1. Vergleichende Spermienmorphologie. Was ist typisch für jeden Typ?

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3 1. Vergleichende Spermienmorphologie Was ist typisch für jeden Typ? Säugerspermium (Sus) Das typische Säugerspermium lässt sich unterteilen in Kopf und Flagellum (9x2+2-Struktur) Das Flagellum ist unterteilt in Mittelstück und Hauptstück. Im Mittelstück sitzen Mitochondrien, im Hauptstück nicht. Dort befinden sich an Strukturen (fibröse Scheide) gebundene, glykolitische Enzyme. Diese Enzyme und die Mitochondrien liefern die Energie für den Geißelschlag. Im Kopf des Spermiums ist das Erbgut lokalisiert, das als einziger Teil des Spermiums in die Eizelle abgegeben wird. Die Mitochondrien aus dem Mittelstück gelangen nicht in die Eizelle; sie werden bei Säugern maternal vererbt. Bei manchen Spermien konnte man nach der Kontrastierung auch noch das Akrosom erkennen, das lytische Enzyme enthält, die für das lokale Zersetzen der Eihülle bei der Befruchtung wichtig sind. Bei wenigen Spermien war noch ein Plasmatropfen zu erkennen (enthält ER und Golgi- Apparat) der normalerweise bei der Ejakulation abgestreift wird. Primitives Spermium (Lumbricus) Das primitive Spermium von Lumbricus ist im Vergleich zum Säugerspermium viel kleiner. Es besitzt wieder einen Kopf und ein Flagellum welches dünn und lang ist. Eine Unterteilung des Flagellums in Mittel und Hauptstück ist jedoch nicht zu erkennen, die Mitochondrien sitzen bei diesem Spermatyp im Kopf direkt hinter dem Kern. Der Kopf ist bei diesem Spermatyp im Gegensatz zum Säugerspermium länglich gestreckt. Bei den Spermien von Lumbricus konnte auch eine Bildung von Spermienclustern beobachtet werden. Crustaceenspermium (Astacus) Das Spermium von Astacus unterscheidet sich wesentlich von den beiden anderen Typen. Es ist recht groß und besitzt lange, dünne, sternförmig angeordnete Fortsätze, die jedoch in der untersuchten Probe nicht vollständig zu sehen waren. Diese Fortsätze sind nicht zu verwechseln mit Flagellen und dienen nicht der Fortbewegung. Astacus-Spermien haben keine Flagellen. Die Spermien werden vom Männchen als Paket (Spermatophore) beim Weibchen, in der Nähe des Geschlechtsausganges angeheftet. Wenn das Weibchen dann seine Eier abgibt kommt es zum direkten Kontakt der Eier mit den Spermien. Die Spermien müssen also wenn überhaupt nur eine kurze Strecke überwinden wofür sie keine Flagellen benötigen.

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7 Ernst Paul 13,92 16,08 Ernst 348 x 10 6 Paul 402 x 10 6 Paul 85% 15% Ernst 80% 20%

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10 Paul ,5% 2,5% 11% 4,5% 0,5% 200 Ernst % 3% 23,5% 3,5% 200

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12 2.Qualitätsprüfung an Eberspermien a) Zellzählung Die Probe, die schon 1:10 mit Konservierungsmedium vorverdünnt war, wurde vor der Auszählung nochmals 1:10 mit Leitungswasser verdünnt (Endverdünnungsfaktor 1:100). Sonst wäre die Spermiendichte für eine Auszählung mit der Neubauer-Zählkammer zu hoch gewesen. Die geringe Osmolarität des Leitungswassers reichte aus um die Spermien zum Platzen zu bringen und somit für die Auszählung immotil zu machen. Für das Ejakulat von Ernst wurde eine Spermienzahl von 348 x 10 6 Spermien pro ml Ejakulat errechnet, für das Ejakulat von Paul eine Anzahl von 402 x 10 6 pro ml Ejakulat. Im Mittel hat ein Schweineejakulat 300 x 10 6 Spermien pro ml. Die beiden untersuchten Schweine hatten also eine überdurchschnittlich hohe Zellzahl im Ejakulat. b) Spermienmotilität: Für Paul wurde ein Anteil von 85% motiler Spermien abgeschätzt, für Ernst eine Anteil von 80%. Die mittleren Werte der aller Praktikumsteilnehmer war 73% für Paul und 68% für Ernst. Diese großen Abweichungen lassen sich nur dadurch erklären, dass das Abschätzen der Spermienmotilität sehr subjektiv erfolgt und für Anfänger auch sehr schwer ist. c) Spermiendefekte Bei beiden Eberejakulaten traten an den Spermien als häufigste Schäden, Schäden am Flagellum auf. Meist waren diese abgeknickt manchmal sogar abgebrochen. Beim Ejakulat von Ernst traten diese Defekte bei den ausgezählten 200 Spermien häufiger auf (47) als bei Paul (22). Die Häufigkeit von Schäden am Akrosom und das Vorhandensein von Plasmatropfen am Mittelstück war bei beiden Ejakulaten in etwa gleich häufig. Rechnet man die genannten absoluten Häufigkeiten in prozentuale Anteile um, kommt man auf 81% intakte Spermien bei Paul und 70% Intakte bei Ernst. Es ist aber gut möglich dass die wirklichen Werte abweichen, da nur eine kleine Probe ausgezählt wurde. d) Hyperaktivierbarkeit: Zur Untersuchung der Hyperaktivierbarkeit wurde mit Hilfe von sogenanntem Hyperaktivierungsmedium, welches das Milieu in der Nähe der Eizelle simuliert, eine Hyperaktivierung der Spermien künstlich ausgelöst. Bei Paul und bei Ernst haben wir nach Behandlung der Spermien mit Hyperaktivierungsmedium beidesmal sehr hohe prozentuale Anteile an hyperaktivierten Spermien gefunden (95% (Paul) bzw. 90% (Ernst)). Der von allen Praktikumsteilnehmern ermittelte mittlere Wert war hierfür 87% (Paul) und 88% (Ernst). Dies spricht für die Güte der Spermien dieser beiden Eber. Zellzahl [106/ml] Motilität [%] Zelldefekte [%] Hyperaktivierbarkeit [%] Bewertung Victor Paul Ernst Manni In der Tabelle sind die Mittelwerte von allen durch die Praktikumsteilnehmern ermittelten Werte angegeben. Bis auf zu geringe Werte bei der Hyperaktivierbarkeit stimmen die gemessenen Werte mit der Wirklichkeit ganz gut überein. Bei den Untersuchungen wurde festgestellt, dass der Eber Manni insgesamt bei der Qualitätsprüfung nicht gut abschnitt. Tatsächlich steht dieser Eber zurzeit unter Beobachtung, wegen nachlassender Qualität seines Ejakulats. Anmerkung: Die Beurteilung der Spermienmotilität wurde zwar auf vorgewärmten Objekträgern durchgeführt, diese kühlten jedoch schnell aus. Da die Spermienmotilität stark temperaturabhängig ist empfiehlt es sich die Untersuchung mit einem beheizbaren Gerät (wurde demonstriert) durchzuführen

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15 0,37 0,02 0,06 0,16 0,22 Verdünnungsfehler 3. Akrosomenreaktion Ziel des Versuches war es die Protease-inhibierende Funktion des Seminalplasmas nachzuweisen. Als proteolytisches Enzym wurde Trypsin gewählt, dass in ähnlicher Form auch im Akrosom vorkommt. Um die Reaktion anzuzeigen wurde der Stoff BAPNA gewählt, dessen hydrolytische Zersetzung durch Trypsin am Photometer quantitativ bestimmt werden kann. An den Ergebnissen kann man deutlich die inhibitorische Funktion des Seminalplasmas auf das Trypsin erkennen. Die Extinktion, und somit auch die Konzentration des umgesetzten BAPNAs war bei niedriger Seminalplasmaverdünnung auch niedrig. Dies zeigt die erwartete niedrige Aktivität des Trypsins an. Die Konzentration des p-nitroanilin stieg mit zunehmender Verdünnung des Seminalplasmas an, was deutlich macht, dass sich wirklich im Seminalplasma Stoffe befinden, die die Aktivität des Trypsins inhibieren. Zu den gemessenen Werten muss man sagen, dass sie im Vergleich zu den anderen Gruppen sehr niedrig waren. Beim Vergleich des Ansatzes SP1 mit SP2 wird deutlich, dass SP2 sicher nicht das 1:10 verdünnte Seminalplasma enthält. Hier ist sicher ein Fehler beim Erstellen der Verdünnungsreihe aufgetreten.

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17 Normale progressive Motilität Hyperaktivität Alle Spermien immotil ) Verhalten von Eberspermien in Abhängigkeit von der Ca2+-Konzentration ösung a): Bei den Spermien die mit Lösung a),einem Ca2+-freien Medium, inkubiert wurden, konnte man keine Besonderheiten erkennen. Die Spermien zeigten hier normale progressive Motilität. ösung b): Bei den Spermien die mit Lösung b), die Ca2+ in einer Konzentration von 0,5mM und einen Ca-Ionophor enthielt, inkubiert wurden, konnte man eine Hyperaktivität beobachten. Diese zeigte sich durch ein ortsgebundenes hin und her zappeln bei vergrößerter Amplitude des Flagellenschlags. ösung c): Lösung c) enthielt wieder den Ca-Ionophor und Ca2+ in 10mM Konzentration. Hier wurde beobachtet, dass alle Spermien ausnahmslos immotil waren. rklärung ie Spermien die mit Lösung a) inkubiert wurden zeigten keine Reaktion, da das Aussenmedium nicht in die Zelle eindringen konnte und diese so nicht beeinflussen. Selbst wenn ein Ionophor enthalten gewesen wäre hätte sich vermutlich keine Reaktion gezeigt. ösung b) und c) brachten grundverschiedene Reaktionen hervor. Die Erklärung für die Beobachtungen ist, dass die Wirkung von Ca2+ konzentrationsabhängig ist. Die optimale Konzentration um eine Hyperaktivität auszulösen ist z.b. 0,5mM. Höhere Konzentrationen aber (ab ca. 1mM) lösen nicht mehr Hyperaktivierung aus, sondern eine Akrosomenreaktion. Dies geschah bei Lösung c) während der Inkubation. Die Kombination aus wildem Herumzappeln (Hyperaktivierung) und Akrosomenreaktion hat dazu geführt, dass die Spermien sich gegenseiteig bei Zusammenstößen durch ihr Akrosom hydrolysiert haben. Das Resultat war Immotilität der Spermien. Diese konzentrationsabhängige Wirkung wird sicher zur Beeinflussung der Spermien in der Nähe der Eizelle genutzt.

18 -alle Spermien immotil -oft eingefallene deformierte Köpfe -normale progressive Motilität -vereinzelt Hyperaktivität 1000 b) Einfluss der Osmolarität auf die Spermienffunktion Bei diesem Versuch erkennt man deutlich das Isotonie nicht mit Isoosmolarität gleichzusetzen ist. Bei der Isoosmolarität kommt es nur darauf an dass in den verglichenen Lösungen die Gesamtteilchenzahl gleich ist. Isotonie setzt weiter noch voraus, dass die in den verglichenen Lösungen gelösten Stoffe in den gleichen Konzentrationen vorliegen. Im Versuch sieht man dass zwei mit Spermien isoosmotische Lösungen verschiedene Reaktionen auslösen können. Die 0,15 M NaCl Lösung (Lösung 2)) hat keinen besonderen Effekt auf die Spermien. Die Na+- und Cl- Ionen können aufgrund ihrer Ladung nicht die Plasmamembran der Spermien passieren und diese somit beeinflussen. Der Harnstoff in Lösung 1) ist jedoch ungeladen und passiert ungehindert die Plasmamembran. Dadurch steigt im Inneren des Spermiums die Osmolarität und Wasser strömt passiv nach. Der dadurch erhöhte Innendruck bringt die Zellen zum Platzen. Das Zellplasma und die darin gelösten Stoffe, die für die Motilität wichtig sind (z.b. ATP, Ca2+), können entweichen. Die Folge ist logischerweise Immotilität.

19 -Spermien meist bewegungslos -teilweise noch zuckend -Spermienköpfe eingefallen -Spermien bewegungslos -Spermienköpfe eingefallen 1000 c) Energieversorgung und Kontrolle der Spermienmotilität Beide Lösungen (3 und 4) enthielten Harnstoff, ATP, und MgCl2. Zusätzlich dazu enthielt Lösung 3 noch CaCl2, Lösung 4 EGTA (Calciumspezifischer Chelator). Der Harnstoff diente dazu die Membran zu zerstören, so dass die anderen Substanzen an ihren Wirkort (Motorproteine Dynein) gelangen konnten. Das ATP war nötig für die Energieversorgung, das Mg2+ als Gegenion zum ATP (ATP ist nur als Mg2+-ATP wirksam). Bei dem Ansatz mit Lösung 3 waren alle für den Geißelschlag notwendigen Komponenten enthalten. Dementsprechend zeigten die Spermien auch, trotz zerstörter Membran eine, wenn auch schawache Bewegung. Bei dem Ansatz in dem EGTA enthalten war zeigten die Spermien keine Bewegung. Der Grund hierfür ist, dass das Ca2+ für den Geißelschlag essentiell ist. In dem Ansatz war allerdings alles freie Ca2+-durch EGTA cheliert und somit unzugänglich für die Geißel.

20 Spermien geplatzt. Harnstoff diffundiert durch Membran, Wasser strömt nach Spermien normal motil. Na + und Cl - können aufgrund ihrer Ladung die Membran nicht passieren. Spermien teilweise beweglich. Zwar alle Stoffe für Bewegung vorhanden aber Strukturen stark zerstört. Spermien immotil. Ca 2+ durch EGTA cheliert und somit nicht verfügbar. Ca 2+ essentiell für Motilität. Ausführliche Diskussion bei Aufgabenstellung Ernst und Paul 500 Paul auch 500 Ernst In der G1-Phase des Zellzyklus (2n, 1c) hat die DNA von Körperzellen von Schweinen eine Länge von ca. 2m. Somit hat der haploide Chromosomensatz (1n,1c) eine ungefähre Länge von 1m. Das durchschnittliche Volumen eines Schweineejakulats beträgt 500ml. Zellzahl (Mittelwert): Paul: 335x106 Spermien pro ml Ejakulat Ernst: 270x10 6 Spermien pro ml Ejakulat Zellzahl pro Ejakulat: Paul: 500 x 335x10 6 = 167,5x10 9 Spermien Ernst: 500 x 270x10 6 = 135x10 9 Spermien Länge der entspiralisierten DNA: Paul: 167,5 Millionen Kilometer Ernst: 135 Millionen Kilometer Die Entfernung Erde Mond beträgt 150 Millionen Kilometer