Basismodul Biologie Praxis I Molekulare Pflanzenphysiologie

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1 1 Universität Bielefeld Lehrstuhl für Molekulare Zellphysiologie Basismodul Biologie Praxis I Molekulare Pflanzenphysiologie Prof. Dr. Dorothee Staiger Kursassistentinnen und assistenten: Ingo Appelhagen Elisabeth Detring Ralf Höcker Xi Huang Bianca Löhr Kristina Neudorf Sarah Schriek

2 2 Versuch 1 Photosynthese Messung des Elektronentransports an funktionstüchtigen Allgemeines: Thylakoiden (Hill Reaktion) In den Chloroplasten wird Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt. Während der Photosynthese wird H 2 O zu O 2 oxidiert und CO 2 auf die Stufe von Kohlenhydraten reduziert. Bei der Oxidation von H 2 O werden Elektronen an die Elektronentransportkette abgegeben. Mit Hilfe der Lichtenergie, die von Photosystem II und I absorbiert wird, werden diese Elektronen auf Redox-Carrier mit negativem Redoxpotential übertragen. Am Ende der Elektronentransportkette wird NADP + zu NADPH + H + reduziert. Mit dem Elektronentransport ist der Aufbau eines Protonengradienten über die Thylakoidmembran gekoppelt, dessen Energie zur Synthese von ATP genutzt wird. Diese Prozesse werden als Lichtreaktionen der Photosynthese bezeichnet. Sie finden an den Thylakoidmembranen der Chloroplasten statt. Isolierte, aufgebrochene Chloroplasten verlieren den größten Teil des nur locker gebundenen Ferredoxins sowie des zelleigenen Elektrononakzeptors NADP + bei der Isolation. Daher sind sie nicht mehr zur Sauerstoffentwicklung und zum Elektronentransport fähig beobachtete Robert Hill, dass isolierte, aufgebrochene Chloroplasten bei Belichtung in Gegenwart von künstlichen Elektronenakzeptoren wie Fe 3+ -Ionen oder reduzierbaren Farbstoffen wieder Sauerstoff entwickeln: Licht 2 H 2 O + 2 A 2 AH 2 + O 2 Bei dieser Hill-Reaktion wird außer H 2 O kein Elektronendonor benötigt; CO 2 ist nicht beteiligt. Die Wasserspaltung und die CO 2 Reduktion können experimentell voneinander getrennt werden. Versuchshintergrund: Im Versuch wird der Farbstoff 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPiP) als künstlicher Elektronenakzeptor eingesetzt. Bei der Reduktion geht der Farbstoff von der blauen, oxidierten Form in die farblose, reduzierte Form über. Dieses wird photometrisch bestimmt. Das Herbizid 3(3,4-Dichlorphenyl)-1,1-dimethylharnstoff (DCMU) hemmt die Elektronenübertragung vom Primärakzeptor des Photosystems II auf Plastochinon. DCMU

3 3 Im Versuch soll der Einfluss von DCMU auf die Photoreduktion von DCPiP ox untersucht werden. Lösungen: Medium A: Medium B: 0,33 M Sorbit 30 mm KCl 30 mm KCl 5 mm NaCl 5 mm NaCl 25 mm Hepes-KOH ph 7,6 25 mm Hepes-KOH ph 7,6 2 mm EDTA 2 mm EDTA 1 mm MgCl 2 1 mm MgCl 2 1 mm MnCl 2 1 mm MnCl 2 0,5 mm KH 2 PO 4 5 mm Ascorbat 4 mm Cystein 1 mm DCPiP Stammlösung Endkonzentration in den Proben: 0,05 mm DCMU Stammlösungen Endkonzentrationen in den Proben: (in 10 % EtOH): A: 1 x 10-6 M 5 x 10-8 M (für Probe 4) B: 2 x 10-6 M 1 x 10-7 M (für Probe 5) C: 5 x 10-6 M 2,5 x 10-7 M (für Probe 6) D: 1 x 10-5 M 5 x 10-7 M (für Probe 7) E: 2 x 10-5 M 1 x 10-6 M (für Probe 8) Versuchsdurchführung: 1. Herstellung der Thylakoidsuspension: Wichtig: Isolierung mit vorgekühlten Glaswaren auf Eis durchführen! 10 g frische Erbsenblätter werden für alle Gruppen gemeinsam mit 160 ml eiskaltem Medium A im Mixer drei mal drei Sekunden lang homogenisiert. Das Homogenisat wird mit einem Trichter durch vier Lagen Mulltuch filtriert. Das Filtrat wird in einem vorgekühlten Erlenmeyerkolben aufgefangen. Von dem Filtrat bekommt jede Gruppe 40 ml in ein 50 ml-zentrifugenröhrchen; die Gewichte je zweier Röhrchen werden auf der Balkenwaage abgeglichen. Die Chloroplasten werden 5 min in der Zentrifuge (Typ Heraeus Megafuge 1.0) im Kühlraum bei 3500 u/min sedimentiert. Der Überstand wird dekantiert und verworfen. Flüssigkeitsreste werden auf Papiertüchern abgetropft. Die Pellets werden zunächst in 2 ml Medium B mit der Kunststoffpipette gründlich resuspendiert (auf Eis), bevor mit Medium B auf ein Volumen von 20 ml aufgefüllt wird. Dabei werden die Thylakoide aus den Chloroplasten freigesetzt. Die Suspension wird noch einmal 10 min bei 3500 u/min zentrifugiert. Der Überstand wird wie oben dekantiert und verworfen. Das Pellet wird in 2 ml Medium B resuspendiert, bevor mit Medium B auf ein Volumen von 4 ml aufgefüllt wird. Für die nachfolgenden Reaktionsansätze soll eine Thylakoidsuspension mit einer Extinktion von 2,0 verwendet werden. Zur Bestimmung der Extinktion werden 20 µl der Suspension in

4 4 einer Küvette mit 1,98 ml Medium B verdünnt (entspricht einer 1:100 Verdünnung), und gemischt. Die Extinktion wird im Photometer bei 600 nm gegen Medium B gemessen. Die Extinktion in der Ausgangssuspension entspricht also dem Hundertfachen des gemessenen Wertes, wenn man von einem linearen Konzentrations- / Extinktions-Verhältnis ausgeht. Die Thylakoidsuspension wird nun auf eine Extinktion von 2,0 verdünnt, indem die entsprechend berechnete Menge der Ausgangssuspension mit Medium B auf ein Volumen von 5 ml aufgefüllt wird. 2. Versuchsansätze: Jetzt werden 8 verschiedene Ansätze in Reagenzgläser pipettiert: Ansatz 1: Ansatz 2: Ansatz 3: erhitzte Probe; durch die Behandlung bei 60 C werden die Proteinkomponenten der Elektronentransportkette denaturiert und dadurch inaktiviert. Dunkelprobe; dieses Röhrchen wird dicht mit Aluminiumfolie umwickelt. Ohne Belichtung können keine Elektronen auf DCPiP übertragen werden. Lichtprobe Ansatz 4 8: Hemmung des Elektronentransports durch steigende Mengen an DCMU. Zunächst wird Ansatz 1 hergestellt (DCPiP noch nicht zugeben!). Während Ansatz 1 10 min bei 60 C im Wasserbad inkubiert wird, werden die anderen Ansätze vorbereitet. Ansatz 2 wird dicht mit Alufolie umwickelt. Von den fünf DCMU-Stammlösungen A - E (s.o.) werden in die Ansätze 4 8 je 200 µl pipettiert. Das DCPiP wird erst unmittelbar vor der Lichtinkubation zu den Ansätzen zugegeben. Ansätze: Ansatz-Nr erhitzt Dunkel Licht DCMU DCMU DCMU DCMU DCMU Thylakoide 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl H µl 300 µl 300 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Medium B 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3.0 ml 3.0 ml DCMU µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl A B C D E DCPiP 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Die Reagenzgläser werden mit Parafilm verschlossen und durch mehrmaliges Invertieren gut gemischt. Dann werden die Proben vor eine Lichtbank gestellt und beobachtet. Wenn die Färbung von Probe 4 die von Probe 3 erreicht hat, spätestens aber nach 10 min werden die Reagenzgläser noch einmal invertiert. 3. Photometrischer Nachweis der DCPiP-Reduktion: Danach werden aus jedem Ansatz 2 ml in ein 2 ml-eppendorf-reaktionsgefäß pipettiert und in der Tischzentrifuge 10 min bei x g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig in

5 5 Plastikküvetten pipettiert und die Extinktion [Ε] im Photometer bei 600 nm gegen Medium B gemessen. 4. Auswertung: Die gemessene Extinktion der Ansätze 3 bis 8 wird auf halblogarithmischem Papier auf der y-achse gegen die DCMU-Konzentration auf der x-achse aufgetragen. Die Extinktionen der Ansätze 1 und 2 werden ebenfalls auf der y-achse eingezeichnet. Diskutieren Sie Ihre Ergebnisse. Versuch 2 Dünnschichtchromatographische Trennung der Chloroplastenpigmente Allgemeines: Damit Licht photosynthetisch wirksam sein kann, muss es von Pigmenten in der Zelle absorbiert werden. Bei höheren Pflanzen sind Chlorophyll a und Chlorophyll b die Hauptpigmente. Chlorophyll, bei dem das zentrale Magnesiumion durch zwei Wasserstoffatome ersetzt ist, wird als Pheophytin bezeichnet. Daneben findet man Carotinoide, lipophile Farbstoffe, die infolge zahlreicher Doppelbindungen gelb, orange oder rot gefärbt sind. Carotine sind reine Kohlenwasserstoffe; am weitesten verbreitet ist das β-carotin. Als Carotinoid (Carotin-ähnlich) kommt vor allem ein sauerstoffhaltiges Derivat, das Lutein, vor. β-carotin Lutein Neoxanthin Chlorophyll a Chlorophyll b

6 6 Versuchshintergrund: Im Versuch werden die Pigmente mit einem organischen Lösungsmittel aus den Thylakoiden herausgelöst. Mit diesem Extrakt können die einzelnen Pigmente mittels Dünnschicht- Chromatographie aufgetrennt werden. Die Pigmente werden dabei entsprechend ihrer Löslichkeit zwischen einer stationären Phase und einer mobilen Phase verteilt. Als stationäre polare Phase dient die Kieselgelschicht der Dünnschichtchromatographieplatte und als mobile apolare Phase das organische Laufmittel Petroleumbenzin/Isopropanol/H 2 O. Pigmente mit hydrophilen Gruppen, z. B. Aldehydgruppen -CHO oder Hydroxylgruppen -OH wandern weniger weit als Pigmente, die reine Kohlenwasserstoffmoleküle sind. Versuchsdurchführung: 1. Extraktion: Grundsätzlich: Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln mit Handschuhen durchführen! 15 Erbsenblätter werden in einem Mörser mit 3 ml Aceton/Petroleumbenzin (10:1) unter Zugabe einer Spatelspitze CaCO 3 (zur Neutralisation des sauren Zellsaftes) gründlich homogenisiert. Ein Faltenfilter in einem Trichter wird unmittelbar vor der Filtration mit 1 ml des gleichen Extraktionsmittels angefeuchtet. Der Blattbrei wird durch diesen filtriert und in einem Erlenmeyerkolben aufgefangen. Der Mörser wird mit 1 ml Extraktionsmittel gewaschen, welches dann ebenfalls auf den Filter gegeben wird. Die Filtermasse wird zweimal mit je 1 ml reinem Petroleumbenzin nachgewaschen. In einem Scheidetrichter werden 5 ml 10 % NaCl-Lösung vorgelegt. Die klare Pigmentlösung wird dazugegeben. Nach Zugabe von 2 ml Petroleumbenzin wird 1 min kräftig geschüttelt, wobei der Hahn und der Stopfen des Scheidetrichters gut festgehalten werden müssen. Zwischendurch wird der Kolben kurz belüftet, da Lösemittel einen hohen Dampfdruck haben. Wo beim Schütteln die wässrige und die organische Phasen aufeinandertreffen, gehen die Chloroplastenpigmente, Chinone und Membranlipide in die Petrolbenzinphase über. Die wasserlöslichen Zellkomponenten, z. B. Zucker und Salze, gehen in die Phase aus wässrigem Aceton. Während 1 min Ruhe trennen sich die Phasen voneinander. Die untere wässrige Phase wird vollständig abgelassen, ebenso evtl. ausgefallene Substanzen zwischen den Phasen. Die Benzinphase wird zweimal mit dest. Wasser (ca. 5 ml) durch kräftiges Schütteln gewaschen, um Reste von Aceton zu entfernen. Sollten sich die Phasen nicht gut trennen, kann statt des Wassers die 10% NaCl-Lösung verwendet werden. Die wässrige Phase wird jeweils abgelassen. Der Petroleumbenzinextrakt wird anschließend in ein 2 ml-eppendorf-reaktionsgefäß abgefüllt.

7 7 /NaCl Aceton/Petrolbenzin Rohextrakt 2. Dünnschichtchromatographie: Auf einer DC-Kieselgelplatte wird mit Bleistift vorsichtig und ohne die Kieselgelschicht zu verletzen 2 cm vom unteren Rand entfernt die Startlinie eingezeichnet. Auf Höhe der Startlinie werden einmal 5 µl und einmal insgesamt 30 µl des Farbstoffgemisches (Benzinphase) aufgetragen, indem mit einer 20 µl Pipette sechsmal 5 µl auf einen Punkt aufgetropft werden (auch hierbei die Kieselgelschicht nicht verletzen). Nach jedem Auftrag läßt man die Probe kurz antrocknen. Wenn nach dem Auftragen das Lösemittel vollständig verdampft ist, wird die Platte aufrecht in eine vorbereitete DC-Kammer (Laufmittel: 100 ml Petroleumbenzin, 12 ml Isopropanol, 0,25 ml H 2 O) gestellt. Achtung: die Kammern werden von mehreren Gruppen gemeinsam benutzt; sie müssen gleichzeitig bestückt werden und dürfen während des Laufs nicht geöffnet werden. Die Atmosphäre in der Kammer muss mit Laufmittel gesättigt sein, damit dieses gleichmäßig fließen kann, ohne dass die Platten zwischendurch austrocknen. Wenn die Laufmittelfront kurz unterhalb des oberen Randes der Platte angekommen ist, wird die Platte aus dem Tank herausgenommen, die Front sofort mit Bleistift markiert und die Platte trocknen gelassen. Auswertung: Umranden Sie die Lagen der Pigmentbanden und berechnen Sie die R f -Werte. Wanderungstrecke der Substanz R f (Retention factor) = Wanderungsstrecke der Laufmittelfront Erklären Sie das Laufverhalten der von Ihnen identifizierten Pigmente in der Dünnschichtchromatographie. Wie würde die Trennung eines Blattextraktes aus im Dunkeln angezogenen Erbsenpflanzen im Vergleich zu Ihrem Resultat aussehen?

8 8 Versuch 3 Induktion der Nitratreduktaseaktivität in Gerstenkeimlingen Allgemeines: Stickstoff ist der quantitativ bedeutendste Mineralstoff für Pflanzen. In Form von Nitrat (NO - 3 ) und Ammonium (NH + 4 ) kommt er im Boden vor. Für diese Stickstoff-Formen haben Pflanzen spezifische Transportproteine in der Cytoplasmamembran entwickelt, die diese Ionen unter Energieverbrauch über die Wurzeln aufnehmen. + Das aus dem Boden aufgenommene Nitrat muß zu NH 4 reduziert werden, um in Aminosäuren eingebaut werden zu können. Die Reduktion erfolgt in mehreren Teilschritten. Der erste Schritt wird durch das Enzym Nitratreduktase katalysiert: NO NADH + H + NO H 2 O + NAD + Die Nitratreduktase wird erst induziert, wenn der Pflanze Nitrat zur Verfügung steht, d.h. die Pflanze synthetisiert das Enzym nur bei Bedarf. Versuchshintergrund: Im Versuch soll die Nitratreduktaseaktivität in Gerstenkeimlingen gemessen werden, die entweder mit oder ohne Nitrat im Gießwasser angezogen worden sind. Als Maß für die Nitratreduktaseaktivität dient das bei der Reaktion entstehende Nitrit (NO 2 - ). Nitrit bildet in Gegenwart von Sulfanilamid und N-Naphthyl-(1-)ethylendiammoniumdichlorid einen roten Azofarbstoff, dessen Konzentration im Photometer bei 540 nm gemessen werden kann. Lösungen: Aufschlusspuffer: 0,1 M Kaliumphosphatpuffer ph 7,5 0,1 M Tris-HCl ph 8,0 0,1 M Kaliumnitratlösung 1 mm EDTA 1 mm NADH-Lösung 10 mm Cystein 1 M Zinksulfatlösung Versuchsdurchführung: 1. Herstellung des Enzymrohextraktes: Grundsätzlich: Alle Gefäße ausreichend beschriften. Alle Arbeiten auf Eis durchführen. Sie bekommen zwei Schalen mit 10 Tage alten, im Licht gewachsenen Gerstenkeimlingen. Die eine Schale wurde nur mit destilliertem Wasser, die andere Schale mit 5 mm KNO 3 - Lösung gegossen. Je 1 g (10 etwa 5 cm lange Halme) Sprossmaterial werden im Mörser mit 4 ml kaltem Aufschlusspuffer gründlich zerrieben. Von beiden Homogenisaten (+NO 3 -, -NO 3 - ) werden 2 ml mit einer Kunststoffpipette in 2 ml-eppendorf-reaktionsgefäße pipettiert und in der Tischzentrifuge 10 min auf höchster Stufe zentrifugiert.

9 9 2. Versuchsansätze: Von jeder der beiden Proben werden jeweils 400 µl Überstand in je zwei 2 ml-eppendorf- Reaktionsgefäße überführt und auf Eis gelagert. Zu je einem der Gefäße jeder Probe werden 200 µl 1 M Zinksulfatlösung gegeben. Ansatz (Anzuchtbedingung) (Inhibitor) (A) - +NO 3 Zn (B) +NO 3 - +Zn (C) - NO 3 Zn (D) NO 3 - +Zn Kaliumphosphatpuffer 400 µl 400 µl 400 µl 400 µl KNO µl 100 µl 100 µl 100 µl NADH 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl _ ZnSO µl 200 µl - Extrakt +NO µl 400 µl - Extrakt NO µl 400µL 1h RT 1h Eis 1h RT 1h Eis Die Ansätze ohne Zinksulfat (Ansätze (A) und (C)) werden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, die Ansätze mit Zinksulfat (Ansätze (B) und (D)) werden auf Eis belassen! In dieser Zeit wird die Eichkurve vorbereitet. 3. Nitrit Eichkurve: Für die Eichkurve werden folgende Ansätze einer 0,1 mm KNO 2 -Lösung in Reagenzgläser pipettiert: _ Ansatz Nummer KNO 2 0,0 20 µl 50 µl 100 µl 200 µl 300 µl 400 µl 500 µl H 2 O 1000 µl 980 µl 950 µl 900 µl 800 µl 700 µl 600 µl 500 µl nmol KNO 2 abs. _ (bitte ausrechnen) Extinktion Nullprobe Beispiel zur Berechnung der Nitritmenge: Probe 8 enthält 500 µl einer 100 µmolaren KNO 3 Lösung: 1 l 100 µmol, 500 ml 50 µmol, 500 µl 50 nmol

10 10 4. Nitrit Nachweis: Die Versuchsansätze und die Proben für die Eichkurve werden parallel weiterbearbeitet. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur werden die Reaktionen in den Versuchsansätzen (A) und (C) durch Zugabe von je 200 µl 1 M Zinksulfatlösung gestoppt. Die Eppendorf-Reaktionsgefäße (Ansätze (A)-(D)) werden 1 min auf höchster Stufe zentrifugiert. Je 1 ml des klaren Überstandes wird in beschriftete Reagenzgläser überführt. Jetzt werden sowohl zu den Enzymproben (Ansätze (A)-(D)), als auch zu den Proben 1 8 der Eichkurve je 1 ml Sulfanilamid- und Naphtyl-Reagenz zugegeben. Die Proben werden gut gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Nitrit reagiert mit der Aminogruppe des Sulfanilamids zu Diazoniumchlorid, das durch Kupplung mit N-[Naphtyl-(1)-]-ethylendiamin einen roten Azofarbstoff bildet: Die Extinktionen werden bei 540 nm gegen die Nullprobe der Eichansätze im Spektralphotometer gemessen. Auswertung: Tragen Sie die Extinktionswerte der Eichkurve in einem Graphen auf der y-achse gegen die Nitritmenge (in nmol) auf der x-achse auf. Bestimmen Sie die gebildete Nitritmenge der Pflanzenextrakte. Vergleichen Sie die Aktivität der Nitratreduktase aus beiden Rohextrakten.

11 11 Versuch 4 Anatomie des Angiospermen-Laubblattes Allgemeines und Versuchshintergrund: Die Blätter der Angiospermen sind seitliche Anhaftungorgane der Sproßachse, welche in ihrer Gestalt an ihre jeweilige Funktion angepasst sind. Es gibt Keim-, Laub-, Kelch-, Kron-, Staub- und Fruchtblätter. Laubblätter gliedern sich in Blattgrund, -stiel und -spreite und sind die Orte der Fotosynthese und der Transpiration. Blattspreiten können unifazial oder bifazial aufgebaut sein. Bei unifazialen Blättern sind die Ober- und Unterseite aus einer Seite des Blattprimordiums hervorgegangen. Sie sind daran zu erkennen, dass die Leitbündel im Blattquerschnitt als Ring oder auch als Bogen angeordnet sind und deren Phloem nach außen weist. Beispiele für unifaziale Blätter sind die Blätter von Juncus- oder Iris-Arten. Bei bifazialen Blättern gehen die Blattober- und Unterseite aus den entsprechend orientierten Seiten der Blattprimordien hervor. Sie sind oftmals sowohl morphologisch als auch anatomisch dorsiventral differenziert, d.h. Blattober- und unterseite sind verschieden: dorsal findet sich Palisadenparenchym, ventral Schwammparenchym. Im Rahmen dieses Versuches soll der anatomische Bau eines bifazialen Laubblattes am Beispiel von Helleborus sp. (Christrose, Ranunculacea, Ranunculales) im Mikroskop betrachtet und zeichnerisch dokumentiert werden. Versuchsdurchführung (Blätter von Helleborus sp.): 1. Blattaufsicht Ein Blattsegment wird mit der Unterseite zum Objektiv gewandt mikroskopiert. Nach Fokussierung auf die äußerste Zellschicht der Blattunterseite lassen sich Epidermiszellen und Spaltöffnungsapparate in Aufsicht betrachten. Eine Spaltöffnung (Stoma) besteht aus Porus und Schließzellen, ein Spaltöffnungsapparat besteht aus Stoma plus Nebenzellen. Zeichnen Sie, was Sie sehen, halbschematisch, und beschriften Sie das Gezeichnete mit Hilfe der unten stehenden Abbildungen. Bei halbschematischen Zeichnungen werden typische Einzelheiten in verallgemeinernder Form wiedergegeben; es muss also nicht zellgetreu gezeichnet werden. 2. Blattquerschnitt Fertigen Sie mit einer Rasierklinge einen Blattquerschnitt vom Frischmaterial an und mikroskopieren Sie diesen in Leitungswasser. Zeichnen Sie das Gesehene und beschriften Sie Ihre Zeichnung mit Hilfe der unten stehenden Abbildungen. Beachten Sie: Dünne Schnitte erhalten Sie, indem Sie mit der Rasierklinge schräg schneiden. Um das Blatt im Querschnitt betrachten zu können, ist es erforderlich, das Segment mit der Schnittfläche zum Objektiv gewandt auf den Objektträger aufzubringen. Ihr(e) Kursassistentin/-assistent wird Ihnen die Schnitttechnik demonstrieren.

12 Abb. 43. Querschnitt durch ein bifaciales Blatt (Christrose Helleborus niger; C3-Pflanze). Das Leitbündel ist gegliedert in Siebteil (P) und Holzteil (X). Aus: Praktikum der Photosynthese, Lichtenthaler / Pfister 12