EPIDEMIOLOGISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE ZUSAMMENHÄNGE DER HUMANEN KOLONKARZINOGENESE

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1 EPIDEMIOLOGISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE ZUSAMMENHÄNGE DER HUMANEN KOLONKARZINOGENESE Abschlussarbeit Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz der Universität Leipzig Dipl. Chem. Anja Schäferhenrich Jena, den

2 Zusammenfassung In Deutschland stellen Tumorerkrankungen die zweithäufigste Todesursache nach Herz-Kreislauf- Erkrankungen dar und verursachen etwa ein Viertel der jährlichen Todesfälle. Dabei ist der Kolorektalkrebs mit insgesamt Todesfällen pro Jahr sowohl für Frauen als auch für Männer die zweithäufigste Krebstodesursache. Bei der Entstehung der Kolontumore unterscheidet man zwischen vererbbaren und sporadischen Formen, wobei sporadische Kolontumore mit Abstand häufiger vorkommen. Zu den hereditären Krebserkrankungen zählen neben der Familiären Adenomatösen Polyposis (FAP) und dem erblichen nicht-polypösen kolorektalen Krebssyndrom (HNPCC) vor allem die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa). Neben den genetischen Faktoren ist die Kolonkarzinogenese auch mit individuellen Faktoren kausal verbunden. So ist aus epidemiologischen Studien bekannt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen den Kolonkrebshäufigkeiten und individuellen Risikofaktoren besteht und sich Unterschiede in der Darmkrebsinzidenz zwischen verschiedenen Ländern sich großteils durch Unterschiede in Umwelt und Lebensstil erklären lassen. Neben Rauchen und physische Aktivität ist vor allem die Ernährung als wesentlicher individueller Einflussfaktor zu nennen. Die Ernährung soll zu etwa 35% zur kolorektalen Tumorentstehung beitragen [Doll R und Peto R, 1981] und auch der World Cancer Research Fund (WCRF) geht inzwischen davon aus, dass bei Dickdarmtumoren etwa 66-75% der Todesfälle durch Ernährungsumstellung vermieden werden können. Um den Zusammenhang zwischen individuellen Risikofaktoren und der Darmkrebsentstehung zu klären, ist ein besseres Verständnis der molekularen und genetischen Ebene von größter Bedeutung. So wird seit einigen Jahren verstärkt die molekularbiologische Ebene der Kolonkarzinogenese erforscht. Zum einen wurden neben dem 1990 von Fearon und Vogelstein erstmals beschriebenen Mehrstufenmodell der Kolonkarzinogenese mit der Dysplasie -Karzinom-Sequenz und der Genetische-Instabilität-Karzinom- Sequenz weitere Modelle der kolorektalen Krebsentstehung beschrieben. Zum anderen wurden die in die Darmkrebsentstehung involvierten Gene und deren Reaktionswege eingehend erforscht. Kurz zusammengefasst sind diese das APC-Gen und der damit verbundene Wnt-β-Catenin-Signalweg, die SMAD-Gene und der mit ihnen verbundene TGF-β-SMAD-Signalweg, die mit dem K-RAS- beziehungsweise TP53-Gen verbundenen Signalwege und die DNA-MMR-Gene und die damit verbundene Mikrosatelliten-Instabilität. Diese Gene stellen die Angriffspunkte für exogen aufgenommene oder endogen gebildete reaktive Substanzen dar. So können einerseits genotoxische Substanzen die Entstehung von Darmkrebs verursachen, in dem sie DNA-Schäden in den krebsrelevanten Genen setzen oder anderweitig schädigend in die Signalwege eingreifen. Andererseits können Substanzen auch protektiv wirken, indem sie die Zelldifferenzierung, DNA- Reparatur oder die Apoptose geschädigter Zellen fördern. In Zusammenhang mit der kolorektalen Krebsentstehung gilt dies insbesondere für karzinogen und anti-karzinogen wirkende Substanzen, die entweder exogen mit der Nahrung aufgenommen oder auch endogen aufgrund einer bestimmten Ernährung gebildet werden.

3 I INHALTSVERZEICHNIS 0. ZIELSTELLUNG EINLEITUNG EPIDEMIOLOGIE GLOBALE EPIDEMIOLOGIE INDIVIDUELLE EPIDEMIOLOGIE MOLEKULARBIOLOGIE KOLONEPITHEL, KRYPTEN UND STAMMZELLEN KOLONEPITHEL UND KRYPTEN KRYPTEN UND STAMMZELLEN VERÄNDERUNGEN WÄHREND DER KOLONKARZINOGENESE HISTOLOGISCHE EBENE GENOMISCHE EBENE CHROMOSOMALE EBENE GENETISCHE EBENE KOLOREKTALE KREBSENTSTEHUNG VERERBBARER KOLOREKTALKREBS FAMILIÄRE ADENOMATÖSE POLYPOSIS (FAP) HEREDITÄRER NICHT-POLYPÖSER KOLOREKTALKREBS (HNPCC) CHRONISCH-ENTZÜNDLICHE DARMERKRANKUNGEN ENZYMPOLYMORPHISMEN SPORADISCHER KOLOREKTALKREBS WEGE ZUM KOLOREKTALKREBS ADENOM-KARZINOM-SEQUENZ (SUPPRESSORGEN-REAKTIONSWEG) GENETISCHE-INSTABILITÄT-KARZINOM-SEQUENZ (MUTATOR-PHENOTYP-REAKTIONSWEG) DYSPLASIE-KARZINOM-SEQUENZ EINZELNE GENE APC APC-GEN APC-PROTEIN DER WNT-β-CATENIN-REAKTIONSWEG K-RAS K-RAS-GEN K-RAS-PROTEIN... 26

4 6.2.3 DER K-RAS-REAKTIONSWEG Q DCC-GEN SMAD2/4-GEN SMAD2/4-PROTEIN DER TGF-β-SMAD-REAKTIONSWEG TP TP53-GEN TP53-PROTEIN DER TP53-REAKTIONSWEG II 7. UMWELTEINFLÜSSE UND INTERAKTIONEN SCHLUSSFOLGERUNGEN LITERATUR...36

5 III ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1 Todesursachen in Deutschland Statistische Bundesamt, Wiesbaden. 1 Abbildung 2 Ursachen für die Bildung von Darmtumoren. 2 Abbildung 3 Die häufigsten Krebserkrankungen in Deutschland Prozentualer Anteil an den Krebsneuerkrankungen in allen Altersbereichen. Robert Koch Institut, Berlin. 4 Abbildung 4 Die Anatomie des menschlichen Dickdarms. 6 Abbildung 5 Querschnitt durch das Darmlumen. 7 Abbildung 6 Querschnitt durch eine Kolonkrypte mit Stammzellen, Proliferationszone und ausdifferenzierten Zellen. 8 Abbildung 7 Der Einfluß von krebsrelevanten Genen auf den Zellzyklus: Veränderungen in den Genen begünstigen die Entstehung von Tumorzellen. 11 Abbildung 8 Die Adenom-Karzinom-Sequenz nach Fearon und Vogelstein. 11 Abbildung 9 Die Adenom-Karzinom-Sequenz nach Vogelstein zeigt die mit den verschiedenen Stufen der Kolonkarzinogenese verbundenen genetischen Veränderungen. 18 Abbildung 10 Die Genetische-Instabilität-Karzinom-Sequenz zeigt die Veränderungen während der Kolonkarzinogenese aufgrund eines vorliegenden Mismatch- Reparatur-Defektes. 21 Abbildung 11 Die Dysplasie-Karzinom-Sequenz zeigt die Veränderungen während der Kolonkarzinogenese aufgrund einer vorliegenden entzündlichen Darmerkrankung. 22 Abbildung 12 Der Wnt-beta-Catenin-Reaktionsweg. Biocarta. 24 Abbildung 13 Der RAS-RAF-MEK-ERK-Reaktionsweg. Biocarta. 26 Abbildung 14 Der TGF-beta-SMAD-Reaktionsweg. Biocarta. 29 Abbildung 15 Übersicht über die TP53-abhängige Genexpression. 31 Abbildung 16 Der TP53-Reaktionsweg. Biocarta. 32 Abbildung 17 Verknüpfung der individuellen und molekularen Faktoren der kolorektalen Krebsentstehung. 34

6 1 0. ZIELSTELLUNG Diese Arbeit soll einen Überblick über die Epidemiologie und Molekularbiologie von Darmkrebs geben und die Verbindungen beider Forschungsgebiete aufzeigen. Dabei wird die Beschreibung der epidemiologischen Zusammenhänge und einzelner Einflussfaktoren nur kurz sein, um das Hauptaugenmerk auf die molekulargenetischen Ereignisse zu legen. Nach Einleitung und Epidemiologie soll das dritte Kapitel der Arbeit die unterschiedlichen Ebenen der kolorektalen Karzinogenese beleuchten. In Abschnitt 4.1 werden dann die wichtigsten vererbbaren Kolonkrebserkrankungen mit ihren jeweiligen Besonderheiten und genetischen Hintergründen beschrieben. In Abschnitt 4.2 wird auf die sporadische Krebsentstehung eingegangen und in Kapitel 5 auf die verschiedenen molekularen Reaktionswege, die zu Kolontumoren führen. Im sechsten Kapitel werden noch einmal ausführlich die wichtigsten mit der Kolonkarzinogenese verbundenen Gene dargestellt. Schließlich werden in Kapitel 7 der Arbeit die molekularen Veränderungen des Genoms und ihr jeweiliges Verhältnis zu individuellen Einflussfaktoren umrissen. Dies bezieht sich vor allem auf die Art und Weise, wie die molekularbiologische Disposition mit unterschiedlichen Umweltfaktoren und individuellen Einflussfaktoren interagiert. Ein zusammenfassender Ausblick in Kapitel 8 schließt diesen kurzen Abriss der molekularen Kolonkarzinogenese ab. 1. EINLEITUNG Die Zahl der weltweiten Krebsneuerkrankungen lag im Jahr 2000 bei etwa zehn Millionen Fällen, wobei von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) befürchtet wird, dass sie bis zum Jahr 2020 um 50% auf 15 Millionen steigen könnte. Weltweit waren Krebserkrankungen im Jahr 2000 für 12% aller Todesfälle verantwortlich, wo bei der prozentuale Anteil in vielen industrialisierten Ländern weitaus höher Verletzungen, Vergiftungen Krankheiten des Verdauungssystems Krankheiten des Atmungssystems Myokardinfarkt Sonstige 4.1% 4.9% 5.9% 8.6% bösartige 12.8% Neubildungen 25.1% Krankheiten des Kreislaufsystems 38.6% (ohne Myokardinfarkt) Abbildung 1 Todesursachen in Deutschland Statistische Bundesamt, Wiesbaden. liegt (WHO, 2002; WHO, 2003). So lassen sich in Deutschland mehr als ein Viertel der jährlichen Todesfälle auf Krebserkrankungen zurückführen, so dass Tumorerkrankungen die zweithäufigste Todesursache nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellen (Abb. 1) (Statistisches Bundesamt, 2003).

7 2 Die Zahl der jedes Jahr in Deutschland auftretenden Krebsneuerkrankungen wird auf geschätzt und allein im Jahr 1999 starben Menschen an den Folgen einer Tumorerkrankung (Arbeitsgemeinschaft Bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland, 2002). Unter dem Begriff Kolorektalkrebs werden die Krebserkrankungen des Kolons (Dickdarm) und des Rektums (Mastdarm) zusammengefasst. Darmkrebs ist in Deutschland der häufigste bösartige Tumor des Magen-Darm-Traktes und macht zusammengefasst gut 16% der jährlichen Neuerkrankungen an Krebs aus. In der Statistik über organbezogene Krebsneuerkrankungen stehen die kolorektalen Krebserkrankungen bei Frauen an zweiter und bei Männern an dritter Stelle der Krebsinzidenzen. Sie sind mit insgesamt Todesfällen pro Jahr sowohl für Frauen als auch für Männer die zweithäufigste Krebstodesursache (RKI, 2003). Bei der Etiologie der Kolontumore unterscheidet man zwischen vererbbaren und sporadischen Formen. Zu ersteren werden die Familiäre Adenomatöse Poliposis (FAP) und das nichtpolipöse kolorektale Krebssyndrom (HNPCC) gezählt, die zusammen 4-6% aller auftretenden Kolontumore ausmachen. Als ebenfalls hereditär werden die Tumore eingestuft, die aufgrund chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen oder aufgrund von Enzympolymorphismen entstanden sind. FAP-bedingter HNPCC-bedingter Darmkrebs Darmkrebs 1% 5% sonstige erbliche Darmkrebsformen 6% entzündlicher Darmkrebs (Morbus Crohn, 2% Colitis Ulcerosa) 16% sporadischer Darmkrebs (familiäre Cluster) sporadischer Darmkrebs 70% Abbildung 2 Ursachen für die Bildung von Darmtumoren. Die weitaus meisten Kolontumore sind jedoch sporadische Tumore, die ohne genetische Prädisposition entstehen (Abb. 2) (Potter JD, 1999; Kinzler KW und Vogelstein B, 1996). Für die sporadische Krebsentstehung werden eine Vielzahl von endogenen und exogenen Einflussfaktoren diskutiert. Dabei ist für die sporadische Kolonkarzinogenese vor allem die Ernährung ein wichtiger individueller Risikofaktor, wie 1981 erstmals von Doll und Peto gezeigt wurde (Doll R, Peto R., 1981). Inzwischen geht der World Cancer Research Fund (WCRF) davon aus, dass bei Dickdarmtumoren sogar 66-75% der Todesfälle durch Ernährungsumstellung vermieden werden könnten (WCRF, 1997). Diese Aussage lässt sich vor allem durch epidemiologische Studien stützen, die eine erhöhte Kolontumorinzidenz bei westlicher Ernährungsweise (Western Style Diet) zeigen. Diese zeichnet sich durch hohen Fleisch-, Zucker- und Alkoholkonsum aus, bei gleichzeitig geringem Obst- und Gemüseverzehr. Im Gegensatz dazu ist in Ländern, in denen

8 3 traditionell viele komplexe Kohlenhydrate, Ballaststoffe und Antioxidantien und vergleichsweise wenig Fett, raffinierte Kohlenhydrate und tierisches Protein aufgenommen werden, das Auftreten von Darmkrebs relativ selten. Dies trifft auf die meisten afrikanischen, asiatischen und südamerikanischen Länder zu (Bonithon-Kopp C und Benhamiche AM, 1999; Parkin DM et al., 2001; La Vecchia C et al., 2003). Die Tumorentstehung ist ein Mehrstufenprozess, bei dem sich über lange Zeiträume hinweg normale Körperzellen zu Krebszellen verändern. Hierbei unterscheidet man die Phasen der Initiation, Promotion und Progression, die aufeinanderfolgende Prozesse auf molekularer und histologischer Ebene umfassen. Bei der Initiation verursachen zunächst exogene und/oder endogene Faktoren eine irreversible, nicht-letale DNA-Veränderung in einer teilungsaktiven Zelle, die an die nachfolgende Zellgeneration weitergegeben und somit als Mutation manifest wird. In der sich anschließenden Promotionsphase verursachen sogenannte Promotoren eine beschleunigte Proliferation der initiierten Zellen, was in diesem Stadium jedoch nicht zwangsläufig zu einer malignen Entartung der Zellen führt. Meist erfolgt die Ausbildung von gutartigen Läsionen oder Präneoplasien, die allerdings das Risiko einer malignen Entartung in sich tragen. Die Progression führt im Weiteren zu einer Umwandlung des benignen in einen malignen Tumor. Dabei kommt es mit fortschreitender Tumormalignität zu zunehmender Heterogenität und Autonomie des Tumors, verbunden mit infiltrierendem Wachstum und Metastasierung. Für die Kolonkarzinogenese wurde dieser mehrstufige Prozess der Tumorentstehung erstmals von Fearon und Vogelstein dargestellt (Fearon ER und Vogelstein B, 1990). Das Modell beinhaltet die einzelnen histologischen und morphologischen Veränderungen von der normalen Darmmukosa hin zum metastasierenden Kolonkarzinom und stellt die häufigsten genetischen Veränderungen während dieses Prozesses dar. Andere Modelle der Kolonkarzinogenese wurden in den letzten Jahren beschrieben. Den verschiedenen Wegen der Tumorentstehung ist gemein, dass die kolorektalen Tumore mit zunehmender Malignität eine Anhäufung einzelner Mutationen aufweisen. Drei unterschiedliche Modelle der Kolonkarzinogenese werden in Kapitel 5 eingehender beschrieben (Potter JD, 1999; Arends JW, 2000; Smith G et al., 2002). 2. EPIDEMIOLOGIE 2.1 Globale Epidemiologie Im Jahr 2000 erkrankten weltweit etwa Menschen an Kolorektalkrebs, was etwa 9% aller Krebsneuerkrankungen ausmacht. Dabei variiert die Zahl der Kolonkrebserkrankungen sehr stark von Land zu Land (etwa um Faktor 20), wobei die höchsten Inzidenzraten in den westlichen Industrienationen zu finden waren (Bonithon-Kopp C und Benhamiche AM, 1999;

9 4 GLOBOCAN 2000, 2001). Hier ist der Kolorektalkrebs die zweithäufigste maligne Erkrankung und auch in Deutschland ist er bei Frauen die zweithäufigste und bei Männern die dritthäufigste Krebserkrankung (Abb. 3). In Deutschland wird die Zahl M ä nner Prostata Gesamtzahl: Prostata 18,7 Lunge 16,6 Dickdarm und Mastdarm 16,1 Leukämien und Lymphome 6,3 Harnblase 6,3 Magen 5,6 Nieren 4,9 Mund und Rachen 4,7 Frauen Brustdrüse 25,9 Dickdarm und Mastdarm 16,7 Leukämien und Lymphome 5,9 Gebärmutterkörper 5,7 Magen 5,1 Lunge 5,0 Eierstöcke 4,2 Gebärmutterhals 3,9 Gesamtzahl: Brustdrüse Abbildung 3 Die häufigsten Krebserkrankungen in Deutschland Prozentualer Anteil an den Krebsneuerkrankungen in allen Altersbereichen. Robert Koch Institut, Berlin. der jährlichen Neuerkrankungen an Darmkrebs für Frauen auf und für Männer auf über Fälle geschätzt. Diese altersstandardisierten Inzidenzraten liegen im EU-weiten Durchschnitt (RKI, 2003). In epidemiologischen Studien wurden nationale Unterschiede in den Kolonkrebshäufigkeiten und Migrationsdaten untersucht. Es ließ sich zum einen ein direkter Zusammenhang zwischen der Krebshäufigkeit und den jeweiligen landestypischen Umweltfaktoren nachweisen. Zum anderen wurde gefunden, dass die Krebsinzidenzen in Immigrantenfamilien sehr schnell die des Gastlandes erreichen, z.t. bereits innerhalb der ersten Einwanderergeneration (Parkin DM, 1993; Parkin DM et al., 2001). Der Unterschied der Darmkrebsinzidenz zwischen verschiedenen Ländern lässt sich also großteils durch individuelle Risikofaktoren, Unterschiede in Umwelt, Lebensstil und Ernährung, erklären. So sind beispielsweise die Inzidenzraten in Japan bis vor kurzem sehr niedrig gewesen, während die weltweit höchste Kolonkrebsinzidenz bei Japanern auf Hawaii gefunden wurde (Parkin DM, 1993). Neben den beschriebenen individuellen Faktoren ist die Kolonkarzinogenese auch mit genetischen Faktoren kausal verbunden. So ist seit langem bekannt, dass Kolorektalkrebs in bestimmten Familien gehäuft auftritt und dass es genetische Prädispositionen gibt, die ein nachweislich erhöhtes Erkrankungsrisiko mit sich bringen (Carstensen B et al., 1996). Bei der Tumorentstehung bilden sich im Kolon zunächst adenomatöse Veränderungen, aus denen sich im Weiteren, unter bestimmten Bedingungen, Kolontumore entwickeln können. Dies entspricht der Beobachtung, dass in den westlichen Industrienationen etwa 40% der Bevölkerung im Laufe ihres Lebens Kolonadenome entwickeln, aber nur fünf Prozent an Kolorektalkrebs er-

10 5 kranken. Aus diesen Zahlen wird auch deutlich, dass sich nur ein kleiner Anteil der Adenome zu malignen Tumoren entwickelt (Miller K und Waye JD, 2002; Leslie A et al., 2002). Das Auftreten beider Neoplasien korreliert mit zunehmendem Alter, wie Altersverteilungskurven für Adenome und Karzinome des Kolons zeigen. So liegt in Deutschland das mittlere Erkrankungsalter für Darmkrebs für Frauen bei 72 und für Männer bei 67 Jahren (RKI, 2003). 2.2 Individuelle Epidemiologie Zu den Risikofaktoren für Dickdarmkrebs gehören neben genetischer Prädisposition vor allem individuelle Faktoren des jeweiligen Lebensstils. So sind neben Rauchen (Sharpe CR et al., 2002), Übergewicht und mangelnder Bewegung (Boutron-Ruault MC et al., 2001) auch hoher Fleisch- (Norat T et al., 2002) und Alkoholkonsum (Tiemersma EW et al., 2003) positiv mit der Darmkrebsentstehung assoziiert. Zu den wichtigsten protektiven Faktoren zählen ein hoher Gemüse- und Ballaststoffverzehr (Norat T und Riboli E; 2002) ausreichende Bewegung (Slattery ML und Potter JD, 2002) und nicht steroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs) (Krishnan K et al., 2000). Weitere ernährungsrelevante Faktoren, wie beispielsweise Calcium und Vitamin D, antioxidativ wirkende Vitamine, Folsäure und Synbiotika werden als Einflussfaktoren diskutiert, wobei epidemiologische Studien diese Zusammenhänge noch nicht mit endgültiger Sicherheit bestätigen konnten (Krishnan K et al., 2000; Marteau P und Boutron-Ruault MC, 2002). Die Rolle, die die genannten individuellen Einflussfaktoren auf molekularer Ebene spielen, ist entweder bekannt (wie beispielsweise die Inhibierung von Cyclooxygenase-2 durch NSAIDs) oder wird zur Zeit noch erforscht (wie beispielsweise Rauchen und Fleischverzehr als Quellen von spezifischen Karzinogenen, Gemüse als Quelle von Folat und Antioxidantien). Die Reaktionsmechanismen anderer Faktoren, wie zum Beispiel physischer Aktivität, sind auf molekularer Ebene nach wie vor nicht geklärt, auch wenn der epidemiologische Zusammenhang bekannt und durch Meta-Studien statistisch belegt ist (Potter JD, 1999). Um individuelle Einflussfaktoren der Kolonkrebsentstehung beschreiben zu können, wurden immer wieder Fall- und Kohortenstudien durchgeführt, die unterschiedliche Aspekte der jeweiligen Lebensgestaltung untersucht haben. Der Zusammenhang zwischen möglichen Einflussfaktoren und dem Risiko an Darmkrebs zu erkranken wurde dann in Meta-Studien weiterhin untersucht. Für umfassendere Informationen soll an dieser Stelle jedoch auf die Literatur verwiesen werden, da eine tiefergehende Analyse der einzelnen Faktoren den Rahmen dieser Arbeit sprengen würde (WCRF, 1997; Sram RJ et al., 2000; Norat T et al., 2002a; Norat T et al., 2002b).

11 6 3. MOLEKULARBIOLOGIE Generell kann die Entstehung von Dickdarmkrebs unter epidemiologischen und unter molekularbiologischen Gesichtspunkten betrachtet werden, wobei die molekularbiologische Forschung versucht, die epidemiologisch gewonnenen Erkenntnisse auf molekularer Ebene zu bestätigen. Dabei ist gerade das Verständnis der molekularen Ebene sehr wichtig, um den Einfluss individueller endogener und exogener Faktoren aufzuklären und damit eine Grundlage für die Prävention und Behandlung von Darmkrebs zu schaffen. 3.1 Kolonepithel, Krypten und Stammzellen Kolon transversum Kolon ascendens Ileum Kolon descenden s Sigmoid Zökum Rektum After Appendix vermicularis Abbildung 4 Die Anatomie des menschlichen Dickdarms Kolonepithel und Krypten Die Anatomie des menschlichen Dickdarms mit Lage von Kolon und Rektum ist in Abbildung 4 dargestellt. Der gesamte Verdauungstrakt des Menschen ist von einem einfachen kolumnaren Epithel ausgekleidet, das ständig erneuert wird. Zellverlust und Zellerneuerung befinden sich dabei in einem dynamischen Gleichgewicht (Shanmugathasan M und Jothy S, 2000). Die Mikroarchitektur des Dickdarms wird durch Kolonkrypten charakterisiert, die etwa 50 Zellen tief sind (Abb. 5). Sie dienen wahrscheinlich dazu, die Kolonstammzellen an der Krypbasis vor der sehr mutagenen Umgebung des Kolonlumens zu schützen. So garantieren sowohl die Struktur der Krypten als auch die Dynamik der Kolonzellreplikation, dass unter normalen Umständen die Kolonstammzellen und die sich noch replizierenden Tochterzellen im unteren Drittel der Krypten gelegen sind. Diese Anordnung der sich replizierenden Zellen sowie der aus der Teilung resultierende Auswärts-aufwärts-Druck, wie auch die Mukusexkretion sorgen dafür, dass die Stammzellen nicht mit den Inhaltsstoffen des Kolonlumens in Kontakt kommen. Aus den beschriebenen Vorgängen lassen sich wichtige Schlussfolgerungen für die Kolonkarzinogenese ziehen. Da die erste Mutation bei der Darmkrebsentstehung in einer Stammzelle oder eine sehr frühen teilungsaktiven Tochterzelle stattfinden muss, ist sie aufgrund der Kryptmikroarchitektur höchstwahrscheinlich über das Blut und nicht über Inhaltsstoffe des Darm-

12 7 lumens vermittelt. Nach diesem ersten Mutationsereignis ist eine zweite Mutation in der sich vermehrenden Zellpopulation wahrscheinlicher. Bevor allerdings die Inhaltsstoffe des Darms eine Rolle bei der Kolonkarzinogenese spielen können, müssen die teilungsaktiven Zellen erst als Polypen oder Mikroadenome in das Kolonlumen hineinwachsen. Dementsprechend sind aberrante Kryptfoki, Mikroadenome und adenomatöse Polypen wichtige präinvasive Veränderungen der humanen Kolonmukosa (Potter JD, 1999). Darmlumen Epithelschicht Epithelzelle Bindegewebe Fibroblast zirkuläre glatter Fasern Muskel longitudinale Fasern Bindegewebe Epithelschicht glatte Muskelzelle Mesothelzelle Abbildung 5 Querschnitt durch das Darmlumen. Als erste Schädigung reicht meistens eine Mutation des APC-Gens aus, da sie zu Veränderungen in Zelladhäsion, Zellmigration und Zellreplikation und schließlich auch zur Bildung adenomatöser Polypen führen kann (Fearon ER et al., 1987). Bei FAP- und HNPCC-Patienten, die eine ererbte APC-Mutation aufweisen, treten diese Kolonpolypen zu Hunderten und zu Tausenden auf und müssen chirurgisch entfernt werden, um das Risiko, an Kolorektalkrebs zu erkranken, zu verringern (Atkin WS et al., 1992) Krypten und Stammzellen Die ständig in das Darmlumen abgeschilferten Zellen werden von der Kryptbasis her ersetzt, wo sich die intestinalen Stammzellen befinden. Bei diesen handelt es sich um relativ undifferenzierte Zellen, die zur Proliferation, zur Selbsterhaltung und zur Geweberegeneration fähig sind (Potten CS und Loeffler M, 1990). Die Teilung der Kolonstammzellen erfolgt unter normalen Bedingungen asymmetrisch und bringt je eine Stammzelle und eine Tochterzelle hervor. Auf diese Weise wird die Stammzellpopulation stabil gehalten. Die Tochterzellen teilen sich weitere vier bis sechs Male und differenzieren sich aus, während sie gleichzeitig in Richtung Darmlumen zur

13 8 Mukosaoberfläche wandern. Wenn die ausdifferenzierten Zellen an der Mukosaoberfläche ankommen, unterliegen sie normalerweise dem programmierten Zelltod und werden ins Darmlumen abgeschilfert. So haben im Normalfall Mutationen in diesen Zellen keinen Einfluss auf die Integrität der Kryptzellpopulation (Potter JD, 1999; Bach SP et al., 2000). Die humanen Kolonkrypten lassen sich - von der Darmlumen voll ausdifferenzierte Zellen proliferierende/ sich differenzierende Zellen Stammzellen Abbildung 6 Querschnitt durch eine Kolonkrypte mit Stammzellen, Proliferationszone und ausdifferenzierten Zellen. Kryptbasis beginnend- in drei Abschnitte gliedern. Sie bestehen aus klonogenen Stammzellen, teilungsaktiven, aber nicht mehr klonogenen Zellen und aus nicht mehr teilungsaktiven, ausdifferenzierten Zellen (Abb. 6). Die exakte Anzahl der klonogenen Stammzellen ist nicht bekannt, jedoch wurde sie anhand von Geweberegenerationsstudien und Zellzykluszeiten geschätzt (Potten CS, 1986; Potten CS und Loeffler M, 1990). Etwa Zellen der Kryptbasis sind klonogen, während der darüber liegende Bereich aus etwa 114 sehr schnell proliferierenden Zellen kein Stammzellpotential mehr hat. Alle übrigen Zellen einer Krypten sind ausdifferenzierte, nicht mehr teilungsfähige Zellen (Bach SP et al., 2000). Der Mechanismus der Stammzellhomöostase ist insofern von Interesse, als dass genau dieser Mechanismus im Fall der Kanzerogenese außer Kontrolle geraten ist. Die Untersuchung der Kolonstammzellen kann folglich helfen, das unkontrollierte Zellwachstum bei der Krebsentstehung zu verstehen und eventuell zu kontrollieren (Karam SM, 1999; Kim KM und Shibata D, 2002). 3.2 Veränderungen während der Kolonkarzinogenese Die während der Kolonkarzinogenese auftretenden Veränderungen lassen sich auf unterschiedlichen Ebenen analysieren und beschreiben. Die genetischen Veränderungen, die sich während der Tumorgenese in den Zellen anhäufen, wirken sich sowohl auf chromosomaler als auch auf zellulärer Ebene aus und finden sich schließlich auf histologischer Ebene in Gewebeveränderungen wieder. Die auf den verschiedenen Ebenen auftretenden Veränderungen sollen in den nun folgenden Abschnitten beschrieben werden.

14 Histologische Ebene Auf histologischer Ebene lässt sich die Kolonkarzinogenese als eine schrittweise Progression von normalem Kolongewebe in dysplastisches Epithel, Adenom und schließlich Karzinom beschreiben. Bei diesem Prozess verändern sich über lange Zeiträume hinweg normale Kolonepithelzellen zu Krebszellen. Der Verlauf der Tumorentstehung wird in Initiation, Promotion und Progression unterteilt und umfasst aufeinanderfolgende Schritte auf genetischer und morphologischer Ebene. Die früheste Phase der Kolonkarzinogenese stellen auf histologischer Ebene die sogenannten "aberrant crypt foci", kurz ACF dar. Dabei führt eine Zellüberproduktion in den Krypten zu deren Ausdehnung, Verlängerung oder Teilung. Betrifft diese Läsion eine Gruppe von Krypten, entsteht auf der Schleimhaut häufig eine polypoide Erhebung, ein hyperplastischer Polyp. Aus den ACFs, insbesondere aus solchen, die eine Dysplasie aufweisen, können sich Adenome entwickeln. Die Mehrheit der Adenome besteht aus gestielten polypoiden Läsionen der Schleimhaut, die in das Darmlumen hineinwachsen. Sie werden deshalb häufig als adenomatöse Darmpolypen bezeichnet. Aus den meisten Adenomen entwickeln sich langfristig Karzinome, die hochgradig dysplastische Läsionen mit infiltrierendem Wachstum darstellen. Die Aggressivität dieser kolorektalen Karzinome steigt mit erhöhter proliferativer Aktivität, mit Verlust der Zelldifferenzierung und manifester genetischer Instabilität an. Schließlich kann es zum Durchbruch des Tumors durch die Darmwand und zur Ausbildung von Lymphknotenmetastasen und/ oder Fernmetastasen kommen Genomische Ebene Beim Krebsgeschehen kommt es meistens zu Veränderungen der Chromosomenanzahl, wobei die molekularen Ursachen dieser Veränderungen von vielen Faktoren abhängen und nicht vollständig geklärt sind (Lengauer C et al., 1997; Lengauer C et al., 1998). Numerische Chromosomenanomalien werden in mehr als 90% der kolorektalen Krebserkrankungen gefunden; nur die wenigsten Tumore weisen somit einen normalen Karyotyp auf (Muleris M et al., 1990; Bardi G et al., 1997). Die häufigsten numerischen Aberrationen sind in den Veröffentlichungen von Bardi et al. aufgeführt (Bardi G et al., 1995; Bardi G et al., 1997). Für Kolonadenome gilt, dass numerischen Aberrationen in 44%-80% der sporadischen Adenome vorkommen und ihre Häufigkeit mit steigendem Dysplasiegrad zunimmt (Griffin CA et al., 1993). Die häufigste Anomalie in den Adenomen ist die Trisomie 7 (in 40% der Adenome), die oft die einzige Veränderung darstellt. Interessanterweise liegt auf eben diesem Chromosom 7 mit DRA (downregulated in adenoma) ein mögliches Tumorsuppressorgen für die Kolonkarzinogenese. Andere in Kolonadenomen häufig hinzugekommene Chromosome sind die Chromosomen 13, 14 und 20

15 10 (in 30%, 13% bzw. 17% der Adenome), während das Chromosom 18 in 13% der Fälle verloren gegangen ist (Bardi G et al., 1995). Auch in Kolonkarzinomen wurde die Trisomie des Chromosoms 7 als häufigste Veränderung gefunden (in 25% der Tumore), während die Chromosomen 13 und 20 in 12% bzw. 14% der Tumore hinzugekommen sind. Chromosom 14 ist in Kolonkarzinomen erstaunlicherweise nicht hinzugekommen, sondern in 22% der Tumore verloren gegangen. Wie bei den Adenomen ist auch bei den Karzinomen der Verlust von Chromosom 18 häufig (in 26% der Tumore). Zusätzlich wurden in Kolonkarzinomen Verluste des Y-Chromosoms (15%), des Chromosoms 17 (13%), und des Chromosoms 22 (12%) gefunden (Bardi G et al., 1995) Chromosomale Ebene Ried et al. haben durch vergleichende Genom-Hybridisierung kolorektaler Tumore herausgefunden, dass die Zahl genetischer Aberrationen von frühen zu späten Adenomen und weiter zu Karzinomen ansteigt. So finden sich chromosomale Anomalien in drei von vierzehn frühen und fünf von zwölf späten Adenomen und ferner in vierzehn von sechzehn Karzinomen (Ried T et al., 1996). Strukturelle Neuordnungen auf chromosomaler Ebene führen meist zu einem Verlust von 1p und einem Zugewinn von 1q, Verlust von 8p und Zugewinn von 8q, Verlust von 13p und Zugewinn von 13q und zu einem Verlust von 17p und Zugewinn von 17q (Bardi G et al., 1995). Weitere hinzugekommenen Regionen sind 7p, 7q und 20q, während zusätzlich Verluste von 4q und 18q gefunden wurden. Diesen Anstieg chromosomaler Aberrationen mit fortschreitender Tumorprogression haben auch Meijer et al. beobachtet. Hier wurde übereinstimmend gefunden, dass 7p, 7q, 8q, 13q, und 20q hinzugekommen und 4q, 8p und 18q häufig verloren gegangen sind (Meijer et al., 1998). Die in den genannten Veröffentlichungen durch vergleichende Genom- Hybridisierung gefundenen Anomalien stimmen recht gut mit denen der Karyotypisierung von kolorektalen Adenomen und Karzinomen überein (s ) (Bardi G et al., 1995) Genetische Ebene Die bei der kolorektalen Krebsentstehung relevanten Gene können in drei Klassen unterteilt werden: in Onkogene, Tumorsuppressorgene und DNA-Reparaturgene. Onkogene stimulieren unter normalen Bedingungen das Zellwachstum. Ihre Mutation oder Überexpression führt dazu, dass die Zellen auch in Abwesenheit von Wachstumssignalen proliferieren. Tumorsuppressorgene regulieren den Zellzyklus und/oder den programmierten Zelltod, die Apoptose. Werden sie aufgrund von Mutationen oder Allelverlusten nicht mehr expremiert, geht diese hemmende Kontrolle verloren. DNA-Reparaturgene schließlich sind dafür zuständig, Fehler in

16 11 der DNA aufzufinden und zu reparieren. Sind sie mutiert, werden Fehler nicht erkannt und nicht repariert und es kommt es zu einer Anhäufung von Mutationen, die weitere wichtige Gene treffen können (Abb. 7) (Vogelstein B et al., 2000). Wachstums signale N Tumor Suppressor gene Proto onkogene GENETISCHE INSTABILITÄT (DNA -Reperaturgene) Apoptose S G 2 M Metastasierung Tumorzelle Sekundäre Tumore G 1 Abbildung 7 Der Einfluß von krebsrelevanten Genen auf den Zellzyklus: Veränderungen in den Genen begünstigen die Entstehung von Tumorzellen. Ein Modell für die kolorektale Tumorgenese haben Fearon und Vogelstein 1990 mit der Adenom-Karzinom-Sequenz vorgeschlagen (Fearon ER und Vogelstein B, 1990). Dieses geht davon aus, dass mutierte Onkogene und Tumorsuppressorgene zur Entwicklung von kolorektalen Tumoren führen. Im ursprünglichen Modell war K-RAS als Schlüssel -Onkogen aufgeführt und die wichtigen Tumorsuppressorgene sollten auf den Genen 5q (APC), 17p (TP53) und 18q (DCC) liegen. Weiterhin sollten der Verlust von DNA-Methylgruppen und die Überexpression von bestimmten Proteine in den Prozess involviert sein. Die Veränderungen der oben genannten Gene bildet eine Sequenz, die häufig mit der klinischen Progression der Tumore parallel läuft (Vogelstein B et al., 1988; Fearon ER und Vogelstein B, 1990). Grundsätzlich ist aber die Anhäufung der genetischen Veränderungen und nicht ihre Reihenfolge wichtig (Abb. 8). APC K-RAS 18q TP53 weitere Veränderungen Gesundes kolorektales Epithel dysplastische aberante Kryptfoci frühes Adenom intermediäres Adenom spätes Adenom kolorektales Karzinom invasives Karzinom Mismatchreparatur Defizienz Abbildung 8 Die Adenom-Karzinom-Sequenz nach Fearon und Vogelstein.

17 12 Das Modell von Fearon und Vogelstein ist in den letzten Jahren durch eine Vielzahl von Publikationen gestützt und weiter ausgebaut worden (Leslie A et al., 2002; Renehan AG et al., 2002). Gleichermaßen sind aber auch alternative Entstehungswege der Kolonkarzinogenese entdeckt und beschrieben worden (Jass JR et al., 2002; Jiricny J und Marra G, 2003; Munkholm P, 2003). Ein Überblick über die verschiedenen Wege und die jeweils involvierten Gene wird in Kapitel 4 gegeben. 4. KOLOREKTALE KREBSENTSTEHUNG Bei der Ätiologie der Kolontumore unterscheidet man zwischen vererbbaren und sporadischen Formen, wobei sporadische Kolontumore mit Abstand häufiger vorkommen. Zu den erblich bedingten Formen des Dickdarmkrebses werden die Familiäre Adenomatöse Poliposis (FAP) und das nicht-polipöse kolorektale Krebssyndrom (HNPCC) gezählt, die zusammen für 4-6% aller auftretenden Kolontumore verantwortlich sind. Ferner fallen auch die aufgrund von chronischentzündlichen Darmerkrankungen, wie beispielsweise Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn, oder aufgrund von Enzympolymorphismen entstandenen Tumore unter die hereditären Karzinome. Die weitaus meisten Kolontumore sind jedoch sporadische Tumore, bei denen sich ohne genetische Prädisposition über lange Zeiträume hinweg gesunde Körperzellen in Krebszellen verwandeln. Diese machen etwa 85% der gesamten kolorektalen Krebserkrankungen aus. 4.1 Vererbbarer Kolorektalkrebs Schon seit langem ist bekannt, dass Kolorektalkrebs in bestimmten Familien gehäuft auftritt und dass es genetische Prädispositionen gibt, die ein nachweislich erhöhtes Erkrankungsrisiko mit sich bringen. Zu diesen Erkrankungen zählen vor allem das erbliche nicht-polypöse kolorektale Krebssyndrom (HNPCC) und die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP). Menschen mit diesen Erkrankungen haben ein sehr hohes Risiko, im Laufe ihres Lebens Mutationen in den Kolonstammzellen anzuhäufen und schließlich an Darmkrebs zu erkranken (Kinzler KW und Vogelstein B, 1996; Jass JR, 2000) Familiäre Adenomatöse Polyposis (FAP) FAP ist eine seltene Erkrankung, die sich durch eine autosomal-dominant vererbte Mutation des APC-Gens auszeichnet. Die Häufigkeit von angeborenen APC-Mutationen in der Bevölkerung wird auf 1 zu geschätzt. Bei der FAP-Erkrankung bilden sich im Darm bereits im jungen Erwachsenenalter Hunderte bis Tausende adenomatöser Polypen. Unbehandelt führen diese in der dritten oder vierten Lebensdekade der Patienten, und damit etwa zwanzig Jahre früher als bei der durchschnittlichen Bevölkerung, zu kolorektalen Tumoren (Munkholm P, 2003).

18 13 Die vererbten APC-Mutationen in FAP-Familien wurden eingehend untersucht und beschrieben. Zwar befinden sich die Mutationen in unterschiedlichen Bereichen des APC-Gens, sie führen aber fast alle zu Stoppkodons und somit zu verkürzten APC-Proteinen (Nishisho I et al., 1991; Joslyn G et al., 1991). Je nachdem, wo die APC-Mutationen vorliegt, bilden sich verschiedene Phänotypen der FAP-Erkrankung heraus. So sind bei einer abgeschwächten Form der FAP-Erkrankung die Mutationen am 5'-Ende des Gens lokalisiert (Spirio L et al., 1993), bei sehr ausgeprägtem Polyposis-Syndrom jedoch zwischen Kodon 1285 und 1465 (Gayther SA et al., 1994). Aber selbst ein und dieselbe Mutation kann -sogar innerhalb einer Familie- mit verschiedenen Phänotypen verbunden sein (Giardiello FM et al., 1994). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine vererbbare Veränderung des APC-Gens zu einem vorherrschenden Phänotyp führt, wobei individuelle Lebensweise und Umweltfaktoren den Genotyp beeinflussen können Hereditärer nicht-polypöser Kolorektalkrebs (HNPCC) HNPCC ist eine autosomal-dominant vererbte Erkrankung, die für etwa 5% der kolorektalen Krebserkrankungen verantwortlich ist (Lynch HT et al., 1989, Muller A et al., 2003). Das Krankheitsbild wurde bereits 1913 von Warthin (Warthin AS, 1913) beschrieben, der neben anderen familiären Krebssyndromen auch eine HNPCC-Familie mit hohen Inzidenzen an Magen-, Uterus- und Kolorektalkrebs untersuchte. HNPCC ist durch eine relativ kleine Anzahl adenomatöser Polypen charakterisiert, die sich bereits früh zu kolorektalen Tumoren weiterentwickeln. HNPCC-Erkrankungen lassen sich nur schwer vom sporadischen Krebsgeschehen unterscheiden, weil ihr Phänotyp nicht so gut charakterisiert ist wie im Falle von FAP-Erkrankungen. Die besten Unterscheidungskriterien sind das frühe Auftreten der Tumore, die Familiengeschichte sowie ein Muster von weiteren Tumoren, die ebenfalls gehäuft vorkommen. Zu diesen zählen Tumore des Magens, des Endometriums, der Harnwege, und der Galle (Lynch HT et al., 1989). Die wesentlichen Mutationen, die in den Keimbahnen von HNPCC-Familien nachgewiesen wurden, sind Mutationen in DNA-Mismatch-Reparatur-(MMR)-Genen. In Folge des defekten MMR-Systems kommt es zu Mikrosatelliteninstabilität (MSI), die in fast allen Adeno karzinomen von HNPCC-Patienten beobachtet wird. Bei einer nicht medizinisch betreuten HNPCC- Erkrankung liegt das Risiko, an Darmkrebs zu erkranken, bei etwa 80-90% (Leach FS et al., 1993; Peltomaki P und de la Chapelle A, 1997; Muller A et al., 2003). Der MSI-Reaktionsweg und die involvierten Gene werden in Abschnitt 5.2 eingehend beschrieben.

19 Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen Als chronisch-entzündliche Darmerkrankungen sind Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn bekannt. Während die Colitis Ulcerosa den Dickdarm betrifft, kann Morbus Crohn überall im Darm auftreten. Die Symptome beider Erkrankungen sind häufig ähnlich. Beide Krankheiten sind chronisch und manifestieren sich meist in den ersten Lebensjahrzehnten. Bei beiden wechseln sich Phasen relativer Gesundheit mit Phasen akuter Krankheitsschübe ab. Das Risiko einen Kolontumor zu entwickeln ist gegenüber der Normalbevölkerung stark erhöht. So erkranken etwa 20-40% der Patienten, die länger als dreißig Jahre eine chronisch-entzündliche Darmerkrankung hatten, an Darmkrebs (Munkholm P, 2003). MORBUS CROHN Morbus Crohn ist ein entzündlicher Prozess, der jeden Bereich des Verdauungstraktes befallen kann, am häufigsten jedoch in Dünndarm und Kolon diagnostiziert wird. Die Erkrankung ist durch eine unterschiedlich starke Entzündung der Darmmukosa gekennzeichnet, wobei nicht nur die Schleimhaut selbst, sondern die gesamte Darmwand von der Entzündung betroffen sein kann. Die Ursachen des Morbus Crohn sind bis heute nicht geklärt, es lässt sich aber festhalten, dass im Gegensatz zur Colitis Ulcerosa genetische Faktoren eine wesentliche Rolle spielen. Das Darmkrebsrisiko liegt für Patienten mit Morbus Crohn etwa fach über dem der Normalbevölkerung (Munkholm P, 2003). COLITIS ULCEROSA Bei der Colitis Ulcerosa handelt es sich um eine chronische Entzündung des Kolons und des Rektums, deren Ursache ebenfalls ungeklärt ist. Die Erkrankung ist durch eine Entzündung der Darmmukosa gekennzeichnet, die langfristig zu einer Bildung von kolorektalen Tumoren führen kann. Das Risiko ein kolorektales Karzinom zu entwickeln ist für Patienten mit Colitis Ulcerosa signifikant erhöht und liegt etwa 20 bis 30-fach über dem der Normalbevölkerung (Munkholm P, 2003). Das Kolonepithel von schon lange an einer entzündlichen Darmerkrankung leidenden Patienten ist atropisch, mit sehr dünner Lamina Propria / Mukosa und wenigen verbliebenden Drüsenzellen. Aus dieser atropischen Mukosa bilden sich Dysplasien aus, die sich zu Tumoren weiterentwickeln können. Aufgrund des zerstörten Kolonepithels kommt bei den chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen der Darminhalt mit den Kolonstammzellen und den proliferierenden Tochterzellen in Kontakt. So können genotoxische Fezesinhaltsstoffe eine initiierende Mutation setzen. In diesem

20 15 Fall müssen also keine adenomatösen Polypen entstehen, die ins Darmlumen hineinwachsen und das einzig notwendige Ereignis scheint der Verlust der Zellzykluskontrolle zu sein. Auf molekularer Ebene werden dementsprechend selten APC- und K-RAS-Mutationen gefunden und stattdessen TP53-Mutationen häufig beobachtet (Chaubert P et al., 1995; Tarmin L et al., 1996; Bretnall TA, 1996) Die aus den entzündlichen Darmerkrankungen hervorgehenden Kolontumore folgen nicht der Adenom-Karzinom-Sequenz, sondern einem Weg, der als Dysplasie-Karzinom-Sequenz bezeichnet und in Abschnitt 5.3 eingehender beschrieben wird Enzympolymorphismen Enzympolymorphismen werden ebenfalls zu den vererbbaren Risiken der Kolonkarzinogenese gezählt. Dabei sind Enzyme, die die metabolische Aktivierung oder Entgiftung von Karzinogenen katalysieren, in unterschiedlichem Ausmaß oder gar nicht expremiert. Dadurch tragen auch Enzympolymorphismen zu einem erhöhten bzw. verminderten Krebserkrankungsrisiko bei (Potter JD, 1999; Houlston RS und Tomlinson IP, 2001). Von der Vielzahl möglicher Enzympolymorphismen soll hier auf den der N-Acetyltransferasen und der Cytochrom P450-Enzyme bzw. auf den der Methylentetrahydrofolatreduktase eingegangen werden. N-ACETYLTRANSFERASEN (NAT1, NAT2) UND CYTOCHROM P450 (CYP) ENZYME N-Acetyltransferasen (NAT) und Cytochrom-P450-Enzyme (CYP) sind hinsichtlich der nitrosamin-induzierten Krebsentstehung von Interesse. Durch genetische Polymorphismen von NAT1, NAT2 und CYP1A2 wird der Metabolismus heterocyclischer Amine und damit deren Kanzerogenität verändert. Während eine eigenständige Rolle des NAT1- und NAT2-Gens bei der Entstehung von Darmpolypen und Darmkrebs nicht belegt ist, scheint jedoch die Kombination von schnellen NAT1-, NAT2- und CYP1A2-Genotypen und hohem Zigaretten- oder Fleischkonsum mit einem erhöhten Risiko für die Kolonkarzinogenese verknüpft zu sein (Le Marchand L et al., 2001; Houlston RS und Tomlinson IP, 2001). Die NAT1-, NAT2- und CYP1A2-Enzympolymorphismen würden auch den epidemiologisch gefundenen Zusammenhang zwischen Rauchen bzw. hohem Fleischverzehr und einem generell erhöhten Krebsrisiko erklären. Die kanzerogenen Nitrosamine entstehen beim Rauchen in Mengen bis zu 180µg pro Zigarette durch Verbrennungsvorgänge, in gebratenem Fleisch hingegen durch die Maillardreaktion.

21 METHYLENTETRAHYDROFOLATREDUKTASE (MTHFR) Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) ist ein weiteres Gen, das ererbte Enzympolymorphismen aufweisen kann. Es ist sowohl für die DNA-Methylierung als auch für die Bereitstellung von Nukleotiden für die DNA-Replikation und die DNA-Reparatur zuständig. Seine Aktivität hängt vom Folat- und Vitamin B12-Spiegel des Organismus ab. Ein varianter MTHFR- Genotyp (TT) weist bei niedrigem Folat- und Vitamin- B12-Status ein erhöhtes Risiko auf, kolorektale Adenome und Tumore zu entwickeln. Sind Folat- und Vitamin-B12-Aufnahme hingegen hoch, so werden beide Vitamine von diesem TT-Genotyp effektiv genutzt. Dann werden hinreichende Mengen an S-Adenosylmethionin und 5,10-Methylentetrahydrofolat gebildet und die Nucleotidproduktion ist normal. In diesem Fall ist trotz veränderten MTHFR-Phenotyps mit einem durchschnittlichem Risiko für Kolorektalkrebs zu rechnen (Slattery ML et al., 1999; Houlston RS und Tomlinson IP, 2001) Sporadischer Kolorektalkrebs Etwa 80% der kolorektalen Tumore sind sporadisch auftretende Tumore des Dickdarms. Sie machen in Deutschland mit ca Neuerkrankungen pro Jahr etwa ein Drittel der Krebsneuerkrankungen aus (Arbeitsgemeinschaft Bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland, 2002). Beim sporadischen Kolorektalkrebs werden im Laufe des Lebens Genmutationen in den Stammzellen der Krypten erworben. So ereignet sich beispielsweise eine DNA-Schädigung, die nicht vom DNA-Reparatursystem erkannt und repariert, sondern an die Tochtergeneration weitergegeben wird. Diese Mutation kann dazu führen, dass die Zelle bestimmte Wachstumsvorteile besitzt, so dass es schließlich zu monoklonalem Wachstum dieser Zelle kommt. Aufgrund der nachlassenden DNA-Reparaturaktivität häufen sich sporadische Mutationen im Alter, was auch in der Altersverteilungskurve für Krebserkrankungen zum Ausdruck kommt (DePinho RA, 2000; RKI, 2003). Bei sporadischem Kolorektalkrebs haben Individuen mit familiärer Häufung dieser Erkrankung, bedingt durch familiäre Exposition, genetische Einflüsse, Umwelteinflüsse oder durch eine Kombination der verschiedenen Faktoren, ein etwa 2-fach erhöhtes Erkrankungsrisiko (Carstensen B et al., 1996; Jass JR, 2000). In der Mehrzahl der sporadischen Kolontumore sind APC und TP53 mutiert und auch K-RAS-Mutationen sind häufig. Die zeitliche Reihenfolge, in der diese Mutationen aufeinander folgen, variiert, wobei eine somatische Mutation im APC-Gen in den meisten Fällen das initiierende Ereignis darstellt. Mutationen im APC und im K-RAS werden bereits in aberranten Kryptfoci gefunden, TP53-Mutationen in großen adenomatösen Polypen (Leslie A et al., 2002).

22 17 Auch eine ererbte oder erworbene Mutation in MMR-Genen oder die Hypermethylierung dieser MMR-Gene kann die Entstehung von sporadischem Kolonkrebs initiieren. Der Verlust der MMR führt -wie bei HNPCC- zu Mikrosatelliten-Instabilität und schließlich zu einem Mutator- Phenotyp, bei dem es zu einem Teufelskreis aus zunehmender Mikrosatelliten-Instabilität und zusätzlichem Verlust wichtiger Kontrollgene kommt (Ionov Y et al., 1993; Goel A et al., 2003; Duval A und Hamelin R, 2003). 5. WEGE ZUM KOLOREKTALKREBS Auf molekularer Ebene werden verschiedene Wege der Kolonkarzinogenese diskutiert. In der aktuellen Literatur lassen sich mindestens drei Wege finden, die von einem gesunden Kolonepithel zu kolorektalen Tumoren führen. Das bekannteste Modell ist sicher das Mehrstufenmodell der Kolonkarzinogenese, das zuerst von Fearon und Vogelstein beschrieben wurde (Fearon ER und Vogelstein B, 1990). In dieser Veröffentlichung bringen die Autoren erstmals die beim Kolonkrebs auftretenden histologischen und morphologischen Veränderungen mit den gefundenen gene tischen Veränderungen in Zusammenhang. Dieses Modell der Adenom-Karzinom- Sequenz wurde in den letzten Jahren ergänzt und weiterentwickelt (Leslie A et al., 2002). Darüber hinaus sind auch andere Wege zum Kolorektalkrebs beschrieben worden. Dies ist zum einen der Reaktionsweg, bei dem die DNA-Mismatch-Reparatur geschädigt ist (Genetische- Instabilität-Karzinom-Sequenz) (Jass JR et al., 2002; Jiricny J und Marra G, 2003) und zum anderen die auf entzündlichen Darmerkrankungen beruhende Dysplasie-Karzinom-Sequenz (Munkholm P, 2003). Diese drei Wege der Karzinogenese sind sowohl bei vererbbaren als auch bei sporadischen kolorektalen Krebserkrankungen gefunden worden. Ihre Gemeinsamkeit besteht darin, dass die Expression von Schlüsselgenen durch ererbte oder erworbene Mutationen oder aber durch Hypermethylierung verändert bzw. verloren ge gangen ist und es dadurch zu verändertem Zellwachstum und schließlich zur Tumorbildung kommt. 5.1 Adenom-Karzinom-Sequenz (Suppressorgen-Reaktionsweg) Die Adenom-Karzinom-Sequenz findet sich sowohl in ererbtem als auch in sporadischem Darmkrebs. Sie beschreibt fast alle FAP-Tumore und etwa 80% der sporadisch entstandenen Kolorektaltumore. Die Adenom-Karzinom-Sequenz veranschaulicht den mehrstufigen Prozess der Kolonkarzinogenese und kann als Serie genetischer Mutationen, die über einen längeren Zeitraum akkumulieren, aufgefasst werden (Kinzler KW und Vogelstein B, 1996; Lengauer C et al., 1998). Die genetischen Veränderungen ereignen sich in solchen Genen, die zuständig sind für Zell-

23 18 wachstum, Zelldifferenzierung, DNA-Reparatur sowie Interaktionen zwischen zellulärer und extrazellulärer Matrix. Zu den von Fearon und Vogelstein genannten Mutationen zählen Veränderungen im APC-Gen (adenomatous polyposis coli, 5q21-q22), im K-RAS-Gen (kirsten rat sarcoma, 12p12.1), im MCC-Gen (mutated in colon cancer) und im TP53-Gen (tumor protein 53, 17p13.1). Dazu kommen Veränderungen im SMAD2/ SMAD4- (18q21.1) (Hahn SA et al., 1996; Takagi Y et al., 1998) beziehungsweise DCC-Gen (deleted in colorectal cancer, 18q21.3) (Fearon ER et al., 1990). Die Mutationsreihe beginnt mit einer initiierenden Mutation des APC-Tumorsuppressorgens. In einem zweiten Schritt können Proto-Onkogene wie K-RAS durch Mutation aktiviert werden und die Progression und Entartung der Neoplasie begünstigen. Darauffolgend entwickeln sich Mutationen in weiteren Tumorsuppressorgenen, wie MCC, SMAD2/ SMAD4, DCC oder TP53 (Abb. 9) (Potter JD; 1999; Leslie A et al., 2002). Adenom-Karzinom-Sequenz gesundes kolorektales Epithel frühes Adenom intermediäres Adenom spätes Adenom kolorektales Karzinom (aneuploid) invasives metastasierendes Karzinom APC K-RAS 18q DCC SMAD2/4 TP53??? Abbildung 9 Die Adenom-Karzinom-Sequenz nach Vogelstein zeigt die mit den verschiedenen Stufen der Kolonkarzinogenese ve rbundenen genetischen Veränderungen. Der Suppressorgen-Reaktionsweg wurde durch Untersuchung an Tumoren von FAP-Patienten gefunden, die eine ererbte APC-Mutation besitzen. Bei diesen Patienten entstehen trotz der angeborenen Veränderung in einem APC-Allel, solange keine adenomatösen Polypen, bis es zu einer weiteren somatischen Mutation im ursprünglich nicht mutierten APC-Allel kommt (Potter JD; 1999). Beim sporadischen Kolorektalkrebs müssen sich die Mutationen in beiden APC-Allelen spontan ereignen, wodurch sich längere Latenzzeit und höheres Erkrankungsalter ergeben. Für den initiierenden Prozess der Adenombildung sind Veränderungen im APC-Tumorsuppressorgen notwendig (Powell SM et al., 1992). So werden Mutationen im APC-Gen und der Verlust der Heterozygosität (LOH) von Chromosom 5q bereits in Adenomen mit Durchmessern kleiner 0,5 cm gefunden. In kolorektalen Tumoren treten unabhängig vom histopathologischen Status in etwa 60% der Fälle APC-Mutationen auf (Vogelstein B et al., 1988; Powell SM et al., 1992; Miyaki M et al., 1994).

24 19 Die Folge der veränderten Expression des APC-Gens in den Kolonstammzellen ist eine veränderte Adhäsion und Migration der Zellen, durch die es zu Veränderungen in der Kryptarchitektur kommt. Dies führt schließlich zur Ausbildung adenomatöser Polypen, die in das Darmlumen und in den Fezesstrom hineinwachsen (Nathke IS et al., 1996; Polakis P, 1997). Dort sind die Zellen den zytotoxischen und genotoxischen Fezesinhaltsstoffen ausgesetzt und unterliegen nachfolgenden Mutationen. Diese nachfolgende Schädigung trifft mit K-RAS häufig ein Onkogen, das zu der RAS-Genfamilie zählt und dessen Genprodukte für die Regulierung des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung wichtig sind. So weisen Adenome mit K-RAS-Mutationen ein schnelleres Wachstum und eine schnellere Dysplasiebildung auf, woraus gefolgert werden kann, dass Veränderungen in diesem Gen die Progression eines kleinen Adenoms mit geringer Malignität in ein größeres mit höherer Malignität ermöglichen (Macaluso M et al., 2002). K-RAS-Mutationen sind relativ frühe Ereignisse der Tumorgenese (Vogelstein B et al., 1988; Fearon ER und Vogelstein B, 1990) und folgen meistens auf die APC-Mutationen. Veränderungen in einem der K-RAS-Gene lassen sich in etwa 50% der größeren Adenome (>1 cm) und auch in etwa 50% der kolorektalen Karzinome nachweisen. In Adenomen mit einem Durchmesser kleiner 0,5 cm hingegen kommen K-RAS- Mutationen nur mit einer Häufigkeit von etwa 10% vor (Vogelstein B et al., 1988; Fearon ER, 1994). Das nächste genetische Ereignis in der Adenom-Karzinom-Sequenz ist der Verlust des 18q- Allels, der nur selten in frühen Adenomstadien, aber in etwa 50% der späten Adenome und in 70% der kolorektalen Karzinome gefunden wird. Auf Chromosom 18q wurde das DCC-Gen identifiziert (Fearon ER et al., 1990; Fearon ER, 1994), dessen Verlust wahrscheinlich zu Veränderungen der Zelladhäsion in der gesunden Kolonmukosa führt. Weitere Tumorsuppressorgene, die ebenfalls auf Chromosom 18q liegen, sind SMAD2 und SMAD4 (Hahn SA et al., 1996; Takagi Y et al., 1998). Beide Gene werden eingehender in Abschnitt 6.3 behandelt. Als letztes Ereignis, im Anschluss an APC- und K-RAS-Mutationen, tragen Veränderungen im TP53 schließlich zu der malignen Entartung der Adenome bei. So ist das TP53-Gen in kolorektalen Karzinomen häufig durch Mutationen oder LOH inaktiviert. In Kolontumoren weisen z.b. etwa 75-85% der malignen Karzinome TP53-Mutationen auf, während es nur selten in kolorektalen Adenomen verändert ist (Baker SJ et al., 1990). 5.2 Genetische-Instabilität-Karzinom-Sequenz (Mutator-Phenotyp-Reaktionsweg) Der zweite Weg der Kolonkarzinogenese, der hier vorgestellt werden soll, ist der Mutator- Phenotyp-Reaktionsweg. Dieser wurde durch Mutationsanalyse von HNPCC-Tumoren gefunden und führt über genetische Instabilität zum Karzinom (Muller A et al., 2003). HNPCC-Patienten

25 20 besitzen ererbte Schäden in Mismatch-Reparatur-Genen, aufgrund derer die DNA-MMR nicht mehr oder nur noch unvollständig funktioniert. Normalerweise identifiziert und repariert das Mismatch-Reparatur-System die Fehler, die der Polymerase während der DNA-Replikation unterlaufen. Fehlpaarungen werden erkannt, ausgeschnitten und so die Neusynthese der korrekten Sequenz ermöglicht. Der Verlust der MMR-Aktivität hat verschiedene schwerwiegende Folgen, zu denen der Verlust des Proofreadings und der Reparatur kleiner Deletionen und Insertionen gehört (Jiricny J und Marra G, 2003; Muller A et al., 2003). Bei den mutierten MMR-Genen handelt es sich um hmsh2 auf Chromosom 2p (Leach FS et al., 1993) und hmlh1 auf Chromosom 3q (Papadopoulos N et al., 1994), die bei 90% der HNPCC- Patienten mutiert sind (Peltomaki P und de la Chapelle A, 1997). Weitere involvierte Gene sind hpms1, hpms2, hmsh3 und hmsh6 (Muller A et al., 2003). Infolge eines defekten MMR-Systems kann es zur Mikrosatelliten-Instabilität kommen. Als Mikrosatelliten bezeichnet man DNA, die aus zahlreichen Tandem-Wiederholungen besteht, welche in der Regel ein bis fünf Basenpaare umfassen. Diese Mikrosatelliten sind zu Hunderttausenden über das menschliche Genom verstreut und für Fehler während der DNA-Replikation besonders anfällig. Schäden in diesen Bereichen werden normalerweise durch das Mismatch-Reparatur-System behoben, akkumulieren jedoch, wenn die Mismatch-Reparatur nicht oder nur unvollständig funktioniert. Es kommt zu einer Anhäufung von Mikrosatelliten-Fehlern, die als Mikrosatelliten-Instabilität (MSI) bezeichnet wird. Ist eine Zelle MMR-defizient, so unterliegen nicht nur Mikrosatelliten-Regionen Replikationsfehlern, sondern alle Sequenzen mit Nukleotidwiederholungen, einschließlich solcher, die in kodierenden Regionen regulatorischer Schlüsselgene liegen. So begünstigt MSI nicht nur die Tumorentstehung, sondern stellt darüberhinaus einen Marker für ein besonders mutationsanfälliges Genom dar (Vaish M und Mittal B, 2002). Mutationen im APC-, K-RAS- und TP53-Gen sind in HNPCC-Tumoren und auch in sonstigen Tumoren mit Mikrosatelliten-Instabilität seltener als in anderen Kolontumoren (Huang J et al., 1996). Allerdings werden in Folge von HNPCC-Erkrankungen zusätzlich andere Gene geschädigt oder gehen verloren. Zu diesen zählen speziell TGF-β-RII (transforming growth factor β receptor II gene), das in die Wachstumskontrolle von Zellen involviert ist (Parsons R et al., 1995) und BAX, das mit Apoptosevorgängen zusammenhängt (Rampino N et al., 1997). Auch MMR-Gene selbst sind von den Genveränderungen wieder betroffen (Abb. 10). MSI kommt allerdings auch bei etwa 10-15% der sporadischen Kolonkrebserkrankungen vor. Während die Tumorentstehung bei HNPCC-Patienten über Mutationen in MMR-Genen und MSI verläuft, stellt MSI in der sporadischen Kolonkarzinogenese ein relativ spätes Ereignis dar (Ionov Y et al., 1993; Goel A et al., 2003).

26 21 Genetische -Instabilität-Karzinom-Sequenz gesundes kolorektales kolorektales Adenom Epithel hmsh2 hmlh1 hmsh1 TGF-β-R2 kolorektales invasives Karzinom metastasierendes Karzinom MMR- Gene MSI IGF-2-R2 hpms1??? BAX hpms2 Abbildung 10 Die Genetische-Instabilität-Karzinom-Sequenz zeigt die Veränderungen während der Kolonkarzinogenese aufgrund eines vorliegenden Mismatch-Reparatur-Defektes. HYPERMETHYLIERUNG DER MMR-GENE Der epigenetische Prozess der DNA-Methylierung wird durch DNA-Methyltransferase katalysiert und stellt eine weitere Möglichkeit dar, wie es während der Tumorgenese zu Genveränderungen kommen kann (Jones PA, 1996). So ist die DNA-Methyltransferasekonzentration in der gesunden Mukosa von Kolontumorpatienten nur leicht, in kolorektalen Adenomen und Karzinomen jedoch stark erhöht. Infolge dessen weist die DNA von gutartigen wie auch bösartigen Kolontumoren, verglichen mit benachbartem gesunden Gewebe, eine generelle Hypermethylierung der DNA auf (Leslie A et al., 2002). Eine solche Hypermethylierung wurde auch vermehrt bei sporadischem Kolonkrebs mit MSI gefunden. Hierbei ist es zumeist das hmlh1-gen, das hypermethyliert und dadurch nicht expremiert ist, was zu MSI und der Ausbildung eines Mutator-Phenotyps führen kann. Diese Ereignisse wiederum sind mit einem erhöhten Risiko der Tumorbildung verbunden (Herman JG et al., 1998). 5.3 Dysplasie-Karzinom-Sequenz Der dritte Weg zum Kolorektalkrebs hat in den entzündlichen Darmerkrankungen seinen Ausgangspunkt. Auch wenn chronisch entzündliche Darmerkrankungen nur mit 5-6% zu den gesamten Kolontumoren beitragen, sind sie doch wichtig, da einzelne Individuen ein stark erhöhtes Erkrankungsrisiko haben. So haben Morbus Crohn Patienten ein etwa 10- bis 20-fach und Colitis Ulcerosa-Patienten ein etwa 20- bis 30-fach erhöhtes Risiko an Darmkrebs zu erkranken (Munkholm P, 2003). Der Weg von der entzündlichen Darmerkrankung zum Kolorektalkrebs wird als Dysplasie-Karzinom-Sequenz bezeichnet (Abb. 11).

27 22 Bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sind aufgrund atrophischer Gewebeveränderungen die proliferierenden Kryptzellen den mutagenen Inhaltsstoffen des Darmlumens direkt ausgesetzt. Auf genetischer Ebene sind APC-Mutationen selten und Verluste des TP53-Gens geschehen sehr früh und werden sogar in histologisch normalem Kolongewebe dieser Patienten gefunden (Lengauer et al., 1998). Obwohl bei Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa keine DNA- MMR-Defekte vorliegen, kann es zu MSI kommen, die ebenfalls in gesund erscheinendem Gewebe nachgewiesen werden kann. Die MSI lässt sich in diesem Fall auf die mutagene Aktivität von Fezesinhaltsstoffen zurückführen, mit denen die proliferierenden Zellen der entzündeten Darmschleimhaut in Kontakt kommen (Brentnall TA et al., 1996). Sons tige somatische Veränderungen sind noch unzureichend untersucht und beschrieben (Munkholm P, 2003). Dysplasie-Karzinom-Sequenz gesundes kolorektales Epithel chronisch entzündestes, atropisches Kolonepithel kolorektale Adenom kolorektales Karzinom (diploid) invasives metastasierendes Karzinom Morbus Crohn Colitis Ulcerosa TP53 MSI?????? Abbildung 11 Die Dysplasie-Karzinom-Sequenz zeigt die Veränderungen während der Kolonkarzinogenese aufgrund einer vorliegenden entzündlichen Darmerkrankung. 6. EINZELNE GENE 6.1 APC APC ist das klassische Tumorsuppressorgen der Adenom-Karzinom-Sequenz und nimmt eine wichtige Stellung in der kolorektalen Krebsentstehung ein. Mutationen in diesem Gen treten bei mehr als 70% der spontanen Tumore in Kolon und Rektum auf, wobei die Mutationshäufigkeit in Adenomen und Karzinomen vergleichbar ist. Dies gilt selbst für Adenome mit einem Durchmesser von kleiner 0,5 cm und mit geringer Dysplasie (Powell SM et al., 1992). In solch frühen Tumorstadien sind K-RAS-Mutationen selten und TP53-Mutationen nicht vorhanden, was bedeutet, dass Mutationen des APC-Gens die initiierenden Ereignisse der kolorektalen Karzinogenese darstellen. Aus diesem Grund wird das APC-Gen auch als Pförtner (gatekeeper) der kolorektalen Karzinogenese bezeichnet.

28 APC-Gen Das APC-Gen wurde im Jahre 1987 sowohl von Leppert et al. (Leppert M et al., 1987) als auch Bodmer et al. (Bodmer WF et al., 1987) unabhängig voneinander auf Chromosom 5q21 lokalisiert und vier Jahre später sequenziert (Groden et al., 1991). APC-Mutationen werden in etwa % der kolorektalen Adenome und Karzinome gefunden (Vogelstein et al., 1988; Miyaki M et al., 1994). Dabei handelt es sich vor allem um Frameshiftund Nonsens-Mutationen, die in allen Stadien der kolorektalen Kanzerogenese mit gleicher Häufigkeit auftreten. Im Gegensatz dazu nehmen der Verlust des APC-Allels und LOH in ihrer Häufigkeit von frühem Adenom zu invasivem Karzinom hin zu (Miyaki M et al., 1994) APC-Protein Das Produkt des APC-Gens ist ein 312 kda großes Protein, das aus 2843 Aminosäuren besteht. Das APC-Protein liegt in den Zellen verschiedener epithelialer Gewebe vor, wo es meist diffus im Zytoplasma verteilt ist. In der kolorektalen Mukosa wird APC im oberen Teil der Krypten verstärkt expremiert und scheint hier ursächlich mit Adhäsion und Migration, mit Differenzierung und Apoptose der Zellen verknüpft zu sein (Fodde R et al., 2001). Die genauen Funktionszusammenhänge erschließen sich, wenn man den Wnt-β-Catenin-Signalweg betrachtet, in den das APC-Protein involviert ist. Aus diesen Zusammenhängen ergibt sich auch, welche Faktoren durch Verlust oder Mutation des APC-Gens gestört sind und inwiefern dies die Kolonkarzinogenese beeinflusst Der Wnt-b -Catenin-Reaktionsweg Als multifunktionales Protein mit verschiedenen Domänen interagiert APC mit einer großen Zahl an Proteinen. Für die kolorektale Tumorentstehung ist seine Funktion im Wnt-Signalweg (Abb. 12) wichtig, in den auch β-catenin, Glykogensyntasekinase-3β (GSK-3β), Axin/Conductin und weitere Faktoren eingebunden sind. Wild-typ APC bildet mit β-catenin und GSK-3β einen APC-β-Catenin-GSK-3β-Komplex. Dieser reguliert die innerzelluläre β-catenin- Konzentration, indem er zur spezifischen Phosphorylierung und damit zur beschleunigten Zersetzung des β-catenins führt (Ubiquitin-Proteasom-Reaktionsweg). Die Zersetzung des β-catenins kann unterbunden werden, wenn das als interzellulärer Transmitter agierende Wnt-Protein an den Frizzeled-Rezeptor bindet, das Signal an Dishevelled (Dsh) und GSK-3β weitergeleitet wird und dadurch die Phosphorylierung des β-catenins unterbleibt. Eine andere Möglichkeit, dass das β-catenin nicht zersetzt wird, besteht darin, dass sich der APC-β-Catenin-GSK-3β-Komplex aufgrund unzureichend expremierter bzw. veränderter APC-

29 24 Proteine nicht ausbilden kann. In diesem Fall unterbleibt ebenfalls die Phosphorylierung und Zersetzung des β-catenins. Das nicht zersetzte β-catenin akkumuliert im Zytoplasma und reagiert auf zwei Wegen ab. Zum einen bindet es zusammen mit α-catenin an den intrazellulären Teil von e-cadherin, das als Transmembranprotein ein Regulator für Zell-Zell-Kontakte darstellt. Durch diese Bindung treten Veränderungen in den Zell-Zell-Kontakten ein und hier deutet sich an, wieso Zellen mit APC-Mutationen veränderte Zelladhäsion und -migration aufweisen und innerhalb der Krypte bleiben, statt Richtung luminaler Oberfläche, Richtung Zelltod und Exfoliation zu wandern. Zum anderen wandert β-catenin in den Nukleus, wo es mit TCF/LEF interagiert und die Transkription von Zielgenen wie c-myc, cyclin D1, matrylisin und c-jun aktiviert. Die verstärkte Transkription der Zielgene führt zu erhöhter Zellproliferation, verringerter Apoptose und erhöh- Abbildung 12 Der Wnt-beta-Catenin-Reaktionsweg. Biocarta.

30 25 ter Infiltrations-Kapazität der Zellen. Eine Störung des Wnt-Signalweges und die damit verbundene Aktivierung von β-catenin-abhängigen Genen scheint eine notwendige Bedingung für die kolorektale Karzinogenese zu sein. So weist die Hälfte aller Wildtyp-APC-Tumore β-catenin-mutationen auf, was darauf hindeutet, dass diese die Stelle der APC-Mutationen in der Kolonkarzinogenese einnehmen können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das APC-Gen mit die Regulierung der β-catenin- Konzentration einen wichtigen Faktor des Wnt-Signaltransduktionsweges beeinflusst. Aufgrund seiner Rolle hinsichtlich Zelladhäsion und Zellproliferation kann eine unregulierte β-catenin- Expression bzw. eine erhöhte β-catenin-konzentration ein wichtiger früher Faktor der Kolonkarzinogenese sein (Kolligs FT et al., 2002; Leslie A et al., 2002; BioCarta, 2003; NCBI, 2003). 6.2 K-RAS Das K-RAS-Gen gehört neben H-RAS und N-RAS zu der RAS-Genfamilie. Ganz allgemein gehören die RAS-Onkogene zu den Genen, die im humanen Krebsgeschehen mit am häufigsten mutiert sind. In kolorektalen Tumoren werden aktivierende K-RAS-Mutationen in großen Kolonadenomen und -karzinomen mit einer Häufigkeit von etwa 40% gefunden, wohingegen sie in kleinen Adenomen mit einem Durchmesser kleiner 0,5 cm selten vorkommen. Das Auftreten der K-RAS-Mutationen in Adenomen >1 cm belegt, dass dieses Gen ein früher, aber kein initiierender Faktor der kolorektalen Tumorgenese ist. (Vogelstein B et al., 1988; Scott N et al., 1993; Jen J et al., 1994; Rashid A et al., 1999; Andreyev HJ et al., 2001) K-RAS-Gen K-RAS ist ein Onkogen der RAS-Familie, das auf Chromosom 12 lokalisiert ist (12p12.1). Es besitzt vier Exons, wobei zwei alternative vierte Exons existieren und zu zwei unterschiedlichen Genprodukten führen. K-RAS ist, wie die ganze RAS-Genfamilie, in die Signaltransduktion von Wachstumsfaktoren involviert und damit für Zellproliferation und Zelldifferentiation wichtig (Bos JL, 1989). Durch mutagen wirkende Karzinogene kommt es zu Punktmutationen in der GTP-bindenden Domäne des K-RAS-Gens, wobei vor allem Kodon 12, 13, 59 und 61 betroffen sind. Durch derartige Mutationen wird die GTPase-Aktivität der Domäne verringert, was zu einem Anstieg an aktivem RAS-Protein führt (Bourne HR et al., 1990).

31 K-RAS-Protein Das K-RAS-Gen kodiert für ein 21 kda Protein (p21 RAS ), das aus 189 Aminosäuren aufgebaut ist und durch Bindung an Guanosin-5'-triphosphat (GTP) aktiviert wird. Durch Hydrolyse des GTP zu GDP (Guanosin-5'-diphosphat) wird das p21 RAS wieder inaktiviert (McCormick F, 1989). Die Mutationen des K-RAS-Gens betreffen Kodon 12, 13, 59 oder 61 und führen zu einem Austausch von Aminosäuren in den entsprechenden Positionen der K-RAS-Proteine. Infolge dieser Mutationen wird die GTPase Aktivität der RAS-Proteine blockiert und die Proteine bleiben vermehrt in ihrer aktiven, GTP-bindenden Form. Dadurch werden, unabhängig von äußerer Stimulation, ständig Wachstumssignale an die Zelle übertragen (McCormick F, 1989; McCormick F, 1995) Der K-RAS-Reaktionsweg Abbildung 13 Der RAS -RAF-MEK-ERK-Reaktionsweg. Biocarta.

32 27 Der K-RAS-Signalweg (Abb. 13) beginnt außerhalb der Zelle, wo epidermale Wachstumsfaktoren (epidermal growth factors, EGF) an EGF-Rezeptoren der Plasmamembran binden. Dadurch wird eine Dimerisierung der Rezeptoren und eine Auto-Phosphorylierung spezifischer Thyrosinreste ausgelöst. Die phosphorylierten Tyrosine fungieren dann als Bindungsstelle für den Grb2-SOS-Komplex, welcher wiederum das RAS-Protein aktiviert, indem er die Phosphorylierung von Guanosin-5 -diphosphat (GDP) zu Guanosin-5 -triphosphat (GTP) katalysiert. Dies bewirkt eine Aktivierung und Konformationsänderung im K-RAS, so dass zytosolisches Raf-1 gebunden wird und als K-RAS-GTP-Raf-1-Komplex aktiviert vorliegt. In einem nächsten Schritt phosphoryliert und aktiviert Raf-1 MEK (MAPK/ ERK-Kinase), welche wiederum ERK (extracellular signal regulated kinase) aktiviert. Aktivierte ERK hat im Zytosol viele Substrate und kann im Zellkern Transkriptionsfaktoren wie Elk-1, Grb2 (growth-factor-receptor-binding-protein), SOS (son of sevenless) oder SRF (serum response factor) phosphorylieren. Die phosphorylierten Transkriptionsfaktoren wiederum aktivieren im Zellkern die Genexpression spezifischer Zielgene wie c-myc. Im Normalfall wird die RAS-Aktivität begrenzt durch die Hydrolyse des RAS-GTPs zum inaktiven RAS-GDP mittels eines GTPase aktivierendes Protein (GAP). Liegt ein durch Genmutation verändertes RAS-Protein vor, so kann es sein, dass RAS-Proteine entstehen, die ohne gebundenes Nukleotid aktiv sind oder dass das GTP des aktiven RAS-GTPs hydrolysestabil ist und somit aktiv bleibt (Chang F et al., 2003; Leslie A et al., 2002; BioCarta, 2003; NCBI, 2003) q Die beim kolorektalen Krebsgeschehen am zweithäufigsten von Allelverlust betroffene Region ist 18q, das in etwa % der frühen und in 50% der späten Adenome verloren geht. Bein kolorektalen Karzinomen wird ein Verlust von 18q in etwa 70% der Fälle gefunden (Vogelstein B et al., 1988; Boland CR et al., 1995). Es ist bekannt, dass dieser Allelverlust ein wichtiger Schritt in der Kolonkarzinogenese ist, wobei die verantwortlichen Gene noch nicht mit 100%- iger Sicherheit identifiziert sind. Mögliche Zielgene in dieser Region sind das DCC-Tumorsuppressorgen (Vogelstein B et al., 1988) und die Tumorsuppressorgene SMAD2 und SMAD4 (Eppert K et al., 1996) DCC-Gen Vogelstein et al. haben 1988 bei der Veröffentlichung der kolorektalen Adenom-Karzinom- Sequenz propagiert, dass es sich bei dem Gen auf dem 18q-Allel um das DCC-Gen (deleted in

33 28 colorectal carcinoma) handelt (Vogelstein B et al., 1988). Das DCC-Tumorsuppressorgen wurde auf Chromosom 18 (18q21.3) lokalisiert und kodiert für ein Protein, welches aus 1447 Aminosäuren besteht. Das DCC-Protein hat strukturelle Ähnlichkeiten mit bestimmten Zelladhäsionsmolekülen, weshalb man annimmt, dass es mit anderen Proteinen an Zell- Zell- und Zell-Matrix- Interaktionen partizipiert. Darüber hinaus ist DCC ein Caspase-Substrat und vermag als solches Apoptose zu induzieren bzw. zu blockieren (Mehlen et al., 1998). In den meisten gesunden Geweben - einschließlich gesunder Kolonmukosa wird das DCC-Gen expremiert. In untersuchten Kolonkarzinomen hingegen ist seine Expression stark reduziert und fehlt in metastasierenden Kolonkarzinomen, in denen das 18q Allel häufig komplett verloren gegangen ist, sogar ganz (Fearon ER et al., 1990) SMAD2/4-Gen SMAD2 und SMAD4 wurden 1996 sequenziert und nah beieinanderliegend auf 18q21.1 lokalisiert (Riggins GJ et al., 1996; Eppert K et al., 1996). Diese beiden Tumorsuppressorgene regulieren unter anderem Zellwachstum, Zellproliferation und Zelldifferenzierung (Heldin CH et al., 1997; Duff EK und Clarke AR, 1998). Mutationen in SMAD2 und SMAD4 sind in verschiedenen Krebserkrankungen und unter anderem auch in kolorektalen Karzinomen nachgewiesen worden (Riggins GJ et al., 1997). Dort wurden Missense-Mutationen und homozygote Deletionen im SMAD2/4-Gen gefunden, die mit dem Verlust der Proteinexpression bzw. der TGF-β-gesteuerten Phosphorylierung einhergehen (Eppert K et al., 1996). Über SMAD2/4- Mutationen in kolorektalen Adenomen liegen keine Daten vor SMAD2/4-Protein SMAD2 und SMAD4 kodieren für 58 kda bzw. 69 kda große Proteine, die aus 467 bzw. 552 Aminosäuren bestehen. SMAD2 und SMAD4 sind zelluläre Mediatoren des TGF-β-SMAD- Signaltransduktionsweges und regulieren über diesen die Proliferation und Differenzierung von Zellen Der TGF-b -Smad-Reaktionsweg Der TGF-β-SMAD-Signalweg (Abb. 14) beginnt damit, dass TGF-β an TGF-β-R1, eine der beiden Untereinheiten des TGF-β-Rezeptors (bestehend aus TGF-β-R1 und TGF-β-R2), bindet. Dadurch kommt es zu einer Auto-Phosphorylierung des TGF-β-R2, welcher wiederum den TGFβ-R1-Rezeptor phosphoryliert. Es bildet sich ein oligomerer Rezeptorkomplex, der nun das durch SARA (SMAD Anchor for Receptor Activation) an der Zellemembran verankerte SMAD2 phosphoryliert und damit aktiviert. SMAD2 bindet an SMAD4, gelangt im Weiteren als

34 29 SMAD2/4-Oligomer in den Zellkern und aktiviert dort die Transkription von Zielgenen. Die Aktivierung der Transkription durch SMADs geschieht auf unterschiedliche Weise. Der Komplex kann an die DNA binden, mit Transkriptionsfaktoren interagieren oder mit anderen co- Repressoren bzw. co-aktivatoren der Transkription reagieren. Eine weitere Komponente, die die Signaltrans duktion des TGF-β-SMAD-Signaltransduktionsweges reguliert, ist SnoN. In Abwesenheit von TGF-β bindet SnoN an nukleäres SMAD4 und unterdrückt dadurch die Transkriptionsaktivierung durch das SMAD2/4-Oligomer. SMAD3, das ebenfalls von TGF-β aktiviert wird, verursacht die Zersetzung von SnoN und ermöglicht damit dem SMAD2/4-Komplex die Aktivierung der TGF-β-Zielgene. Die Bedeutung von SMAD2 und SMAD4 im kolorektalen Krebsgeschehen liegt darin, dass Abbildung 14 Der TGF-beta-SMAD-Reaktionsweg. Biocarta.

35 30 Mutationen in diesen Genen den TGF-β-Signalweg unterbrechen und es dadurch zu einer erhöhten Proliferation des intestinalen Epithels bzw. speziell der Kolonmukosa kommt (Leslie A et al., 2002; BioCarta, 2003; NCBI, 2003). 6.4 TP53 Mutationen des TP53-Gens finden sich in etwa der Hälfte aller menschlichen Tumore, wobei sich die Art und Häufigkeit der einzelnen Mutationen bei den verschiedenen Tumorarten unterscheidet. In Tumoren des Kolons und Rektums kommen TP53-Mutationen mit einer Häufigkeit von etwa 55% vor. In der Adenom-Karzinom-Sequenz der Kolonkarzinogenese treten TP53-Mutationen erst relativ spät auf, nämlich am Übergang von späten Adenomen zu Karzinomen. So werden Veränderungen des TP53-Gens in 4-26% der späten Adenome (Vogelstein B et al., 1988; Kaklamanis L et al., 1993; Scott N et al., 1993; Rashid A et al., 1999) und in % der Karzinome (Vogelstein B et al., 1988; Kaklamanis L et al., 1993; Darmon E et al., 1994) gefunden, während sie in frühen Adenomen extrem selten auftreten. Daher wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von TP53-Mutationen auch genutzt, um bestimmte Tumore als gutartig oder bösartig einzustufen TP53-Gen Beim TP53 handelt es sich um ein Tumorsuppressorgen, das auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 (17p13.1) lokalisiert ist. Die Funktionen von TP53 sind vielfältig: so blockiert es beim Auftreten von DNA-Schäden die Zellproliferation, stimuliert die DNA-Reparatur und führt, falls die Reparatur ungenügend ist, apoptotischen Zelltod herbei. (Lane DP, 1992; Oren M und Rotter V, 1999; May P und May E, 1999; Ford und Hanawald 1995, McKay et al. 2000). Wird die DNA einer Zelle durch genotoxische Substanzen geschädigt, steigt innerhalb weniger Minuten die TP53-Konzentration im Zellkern an. Dies geht mit einem Stopp des Zellzyklus in der späten G1-Phase und einem verzögerten Eintritt in die S-Phase einher und soll eine Reparatur der DNA- Schäden ermöglichen. Alternativ vermittelt TP53 unter bestimmten Bedingungen Apoptose, wodurch sich der Organismus ebenfalls vor Genommutationen schützen kann. Die große Bedeutung, die das TP53 für den Erhalt der genomischen Stabilität hat, zeigt sich auch darin, dass dieses Gen als Wächter des Genoms bezeichnet wird (Lane DP, 1992). Eine funktionelle Inaktivierung des TP53 erfolgt am häufigsten durch Missense-Mutationen in der DNA-bindenden Domäne (Exon 4-8), welche zumeist den Austausch einer Aminosäure beinhalten und G:C zu A:T-Transitionen bewirken. In Kolonkarzinomen sind die Kodons 175, 248 und 273 besonders häufig von Mutationen des TP53 betroffen (Oren M und Rotter V, 1999; May P und May E, 1999).

36 TP53-Protein Das TP53-Gen kodiert für ein 53 kda Phosphoprotein, das aus 393 Aminosäuren besteht und im Zellkern lokalisiert ist. Das Protein ist ein Transkriptionsfaktor, dessen Aktivität durch seine Konzentration und über Phosphorylierung reguliert wird. Im TP53 lassen sich drei funktionelle Domänen unterscheiden: eine N-terminale Transaktivierungsdomäne, eine im mittleren Teil gelegene spezifische DNA-Bindungsdomäne und eine C-terminale unspezifische DNA-Bindungsdomäne. Mutationen, die in humanen Tumoren gefunden werden, betreffen fast ausschließlich (zu etwa 90%) die sequenzspezifische DNA- Bindungsdomäne. Mutierte TP53-Proteine können untereinander und mit Wildtyp-TP53 Oligomere bilden. In diesen Oligomeren wird die Konfirmation von Wildtyp-TP53 geändert und die Interaktion mit der DNA gestört. Dieser Vorgang erklärt, wieso bei Mutationen auch nur eines TP53-Allels das Produkt des nicht-mutierten Allels inaktiviert wird Der TP53-Reaktionsweg TP53-Tetramere aktivieren nach Bindung an Konsensussequenzen verschiedener Gene deren Transkription. Die Genprodukte, deren Transkription über TP53-abhängige Antwortelemente stimuliert wird, wirken hemmend auf Zellzyklus und Zellwachstum und fördern die Apoptose. Eine Übersicht über diese Gene ist in Abbildung 15 gegeben. Durch Überexpression von Wildtyp-TP53 kann aber auch die Genexpression anderer Gene gehemmt werden. Zu diesen zählen, neben den Onkogenen JUN und FOS, das IL-6-Gen und das BCL-2-Gen. P53 P53 IGFBP-3 IGF p21 CIP Cyclin /CDK p21 CIP PCNA GADD45 PCNA BAX BCL2 FOS JUN IL-6 BCL-2 Hemmung des Zellzyklus Hemmung der DNA- Replikation Apoptose Wachstumshemmung Apoptose Abbildung 15 Übersicht über die TP53-abhängige Genexpression. Da das TP53-Genprodukt ein Zellzyklusregulator mit wachstumshemmender Aktivität ist, kommt es nach dem Allelverlust zu ungehemmtem Tumorwachstum und Metastasierung. Viele Proteine, die mit TP53 assoziieren, sind direkt oder indirekt an der Regulation der Transkription beteiligt. Sie lassen sich in verschiedene Gruppen unterteilen: zum einen handelt es sich um generelle Transkriptionsfaktoren, zum anderen um spezifische Aktivatoren der

37 32 Transkription und schließlich um Proteine, die an Replikation und Reparatur der DNA beteiligt sind. Von zentraler Bedeutung für die Regulation von Zellzyklus und Apoptose ist das MDM2- Protein. MDM2 bindet an den N-terminalen Bereich des TP53-Proteins und hemmt dessen transkriptorische Aktivität. Ferner vermittelt es die Proteolyse von TP53 durch Proteinasen des Ubiquitin-Systems. Da das MDM2-Gen durch TP53 aktiviert wird, besteht ein negativer Rückkopplungsmechanismus, der unter normalen Bedingungen niedrige zelluläre TP53-Konzentrationen zur Folge hat. Durch DNA-Schäden wird nun eine Veränderung des TP53 herbeigeführt, welche die Bindung an MDM2 und damit die Ubiquitin-vermittelte Proteolyse hemmt. Dies hat eine erhöhte zelluläre TP53-Konzentration zur Folge. Die Mutation eines Allels ist ausreichend, um die normale Funktion des TP53 zu unterbinden, da Abbildung 16 Der TP53-Reaktionsweg. Biocarta.