Rekombinante Allergene

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1 8. WIENER KOMPONENTENSCHULE September 2016 in Wien Rekombinante Allergene Assoc.Prof.Dr. Birgit Linhart Abteilung für Immunpathologie Institut für Pathophysiologie und Allergieforschung Medizinische Universität Wien

2 DEFINITIONEN: Allergenquelle Allergenextrakt - Allergen Allergenquelle Allergenextrakt Allergen Gemische aus allergenen und nicht allergenen Bestandteilen Mastzelle Molekül, das die Krankheitssymptome auslöst

3 Was sind standardisierte Allergenextrakte? Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich Institut, 1996

4 Was sind standardisierte Allergenextrakte? Nachweis von IgE-bindenden Proteinen in Maisextrakten Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich Institut, 1996

5 Standardisierte Allergenextrakte enthalten unterschiedliche Konzentrationen von Haupt- und Nebenallergenen Analyse von 9 Haselnuß-Extrakten Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich Institut, 2002

6 Standardisierte Allergenextrakte enthalten unterschiedliche Konzentrationen von Haupt- und Nebenallergenen Nachweis des LTP-Gehalts in 9 Haselnuss - Hauttestlösungen (A-I) mittels Immunoblot:

7 Standardisierte Allergenextrakte enthalten unterschiedliche Konzentrationen von Haupt- und Nebenallergenen Nachweis des LTP-Gehalts in 9 Haselnuss - Hauttestlösungen (A-I) mittels Immunoblot:

8 Standardisierte Allergenextrakte enthalten unterschiedliche Konzentrationen von Haupt- und Nebenallergenen Timothygrass Lieschgras Extrakt Company IgE IgE Company 4 Company IgE IgE = preimmune Phl p 1 2= a-phl p 1 3= preimmune-phl p 2 4= a-phl p 2 5= Preimmune Phl p 4 6= a-phl p 4 7= preimmune Phl p 5 8= a-phl p 5 9= preimmune-phl p 6 10= a-phl p 6 11= Preimmune Phl p 12 12= a-phl p 12 13= preimmune Phl p 13 14= a-phl p 13 15= preimmune-phl p 7 16= a-phl p 7 IgE= Graspollen-allergischer Patient Focke M. et al, Clin.Exp.Allergy 2008

9 Standardisierte Allergenextrakte enthalten unterschiedliche Konzentrationen von Haupt- und Nebenallergenen Timothygrass Lieschgras Extrakt Company IgE IgE Phl p 1 Company 4 Company IgE IgE = preimmune Phl p 1 2= a-phl p 1 3= preimmune-phl p 2 4= a-phl p 2 5= Preimmune Phl p 4 6= a-phl p 4 7= preimmune Phl p 5 8= a-phl p 5 9= preimmune-phl p 6 10= a-phl p 6 11= Preimmune Phl p 12 12= a-phl p 12 13= preimmune Phl p 13 14= a-phl p 13 15= preimmune-phl p 7 16= a-phl p 7 IgE= Graspollen-allergischer Patient Focke M. et al, Clin.Exp.Allergy 2008

10 Wichtige Allergene sind oft nur in geringen Mengen enthalten Biological activity of recombinant Der p 2, Der p 5 and Der p 7 allergens of the house-dust mite Dermatophagoides pteronyssinus. Lynch et al., Int-Arch-Allergy-Immunol Recombinant spiked allergen extract Lundberg et al., Allergy. 2001

11 Standardisierte Allergenextrakte enthalten beträchtliche Mengen an Endotoxinen Endotoxin content of standardized allergen vaccines. Trivedi et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 2003

12 Allergenextrakte können mit Allergenen aus anderen Allergenquellen kontaminiert sein Beispiel: False-positive skin prick test responses to commercially available dog dander extracts caused by contamination with house dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus) allergens. van der Veen MJ, Mulder M, Wittemann AM, van Ree R, Aalberse R, Jansen HM, van der Zee JS. J. Allergy Clin Immunol. 98, , 1996.

13 Herstellung rekombinanter Allergene

14 Herstellung rekombinanter Allergene DNA RNA PROTEIN / ALLERGEN

15 IgE IMMUNOSCREENING cdna Bank ausplatieren jeder Plaque steht für 1 Protein Bakterienrasen Bakteriophage Detektion von gebundenem IgE Serum IgE von allergischen Patienten die Proteine werden auf Nitrozellulose übertragen

16 IgE IMMUNOSCREENING DNA Sequenzanalyse Expression des rekombinanten Allergens cdna Bank Bakteriophage ausplatieren jeder Plaque steht für 1 Protein Bakterienrasen Isolation der DNA, die für das Allergen kodiert Detektion von gebundenem IgE Serum IgE von allergischen Patienten die Proteine werden auf Nitrozellulose übertragen

17 Produktion von rekombinanten Allergenen: Prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme 1. Bakterien: Escherichia coli 2. Hefe: Pichia pastoris 3. Pflanzen: Tabak 4. Insektenzellen

18 Produktion von rekombinanten Allergenen: Prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme 1. Bakterien: Escherichia coli Proteine werden nicht glykosyliert! 2. Hefe: Pichia pastoris 3. Pflanzen: Tabak 4. Insektenzellen Proteine werden glykosyliert!

19 Welche Bedeutung haben Karbohydrate?

20 Cross-reactive Carbohydrate Determinants (CCDs) MUXF3 CCD (Bromelain), eine prototypische N-Glykan Struktur

21 Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen Studies of the carbohydrate moieties of the timothy grass pollen allergen Phl p 1 Petersen et al., Electrophoresis 1995 Post-translational modifications influence IgE reactivity to the major allergen Phl p 1 of timothy grass pollen Petersen et al., Clin Exp Allergy 1998 Hapten

22 Cross-reactive Carbohydrate Determinants (CCDs) Phl p 1 Phl p 4 Phl p 13 Lyc e 2 Hev b 4 Lol p 11 Api g 5 Ole e 1 Cor a 11 Ara h 1 Cyn d 1 Art v 1 Api m 1 Api m 2 Ves v 2 Lieschgraspollen Lieschgraspollen Lieschgraspollen Tomate Latex Weidelgraspollen Sellerie Olivenpollen Haselnuss Erdnuss Bermudagraspollen Beifußpollen Bienengift Bienengift Wespengift

23 Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen, jedoch mit geringer biologischer Relevanz?

24 Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen, jedoch mit geringer biologischer Relevanz Poor biologic activity of cross-reactive IgE directed to carbohydrate determinants of glycoproteins. van-der-veen et al., J-Allergy-Clin-Immunol Carbohydrate epitopes and their relevance for the diagnosis and treatment of allergic diseases. van-ree et al., Int-Arch-Allergy-Immunol Specific IgE to cross-reactive carbohydrate determinants strongly affect the in vitro diagnosis of allergic diseases. Mari et al., J-Allergy-Clin-Immunol IgE to cross-reactive carbohydrate determinants: analysis of the distribution and appraisal of the in vivo and in vitro diagnosis. Mari et al., Int-Arch-Allergy-Immunol. 2002?

25 IgE-Reaktivität gegen Karbohydrat-Epitope kann zu falsch positiven Testresultaten führen Recombinant allergen-based IgE testing to distinguish bee and wasp allergy Mittermann I., et.al. J Allergy Clin Immunol 2010

26 IgE-Reaktivität gegen Karbohydrat-Epitope kann zu falsch positiven Testresultaten führen

30 Charakterisierung rekombinanter Allergene

31 Analyse der Reinheit von rekombinanten Allergenen SDS-PAGE 97 - M

32 Analyse der Reinheit von rekombinanten Allergenen Massenspektrometrie

33 Molecular Ellipticity Zirkulardichroismus (CD): eine einfache Technik, um die strukturelle Integrität von Proteinen festzustellen Temperature scan Wavelength (nm) 25 C 35 C 45 C 55 C 65 C 75 C 85 C 95 C Tropomyosin

34 Die dreidimensionale Struktur der rekombinanten Allergene ist für ihre allergene Wirkung von Bedeutung

37 Die Strukturaufklärung von Allergenen erfolgt mittels NMR-Spektroskopie und Röntgenstrukturanalyse Birchpollen-Profilin Acanthamoeba-Profilin

38 Vergleich der IgE-Reaktivität von natürlichen und rekombinanten Allergenen Recombinant allergens for immunoblot diagnosis of tree-pollen allergy Valenta et al., J Allergy Clin Immunol 1991

39 Gereinigte natürliche Allergene sind oft Gemische aus mehreren Isoformen Humane IgE- und T-Zell-Reaktivität der Bet v 1 Isoformen a, e, b, d und l T cell reactivity (rel. %) IgE binding (rel. %) Skin prick test wheal areas (mm 2 ) nbet v ND rbet v 1a rbet v 1e rbet v 1b rbet v 1d rbet v 1l

40 Vergleich der IgE-Reaktivität von natürlichen und rekombinanten Allergenen IgE antibodies to recombinant pollen allergens (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, and Bet v 2) account for a high percentage of grass pollen-specific IgE Niederberger et al., J Allergy Clin Immunol 1998 Recombinant birch pollen allergens (rbet v 1 and rbet v 2) contain mostof the IgE epitopes present in birch, alder, hornbeam, hazel, and oak pollen: A quantitative IgE inhibition study with sera from different populations Niederberger et al., J Allergy Clin Immunol 1998

41 Zelluläre Allergen-Stimulationstests: Histamin-Freisetzungstest

42 Eine in vitro - Methode zur Messung der biologischen Aktivität von rekombinanten Allergenen Induction of specific histamine release from basophils with purified natural and recombinant birch pollen allergens. Valenta et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1993

43 Zelluläre Allergen-Stimulationstests: Der Lymphozyten-Transformationstest Die Stimulierung von spezifischen T-Zellen ist kein charakteristisches Merkmal für Typ I Allergien! Peptide specificity and HLA restriction do not dictate lymphokine production by allergen-specific T-lymphocyte clones. van-neerven et al., Immunology Nonallergic individuals recognize the same T cell epitopes of Bet v 1, the major birch pollen allergen, as atopic patients. Ebner et al., J-Immunol. 1995

44 Zelluläre Allergen-Stimulationstests: Der Basophilen-Aktivierungstest misst die CD63 und CD203c Expression auf basophilen Granulozyten

45 Messung der CD203c Expression auf basophilen Granulozyten Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. Hauswirth et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 2002

46 Evaluation von rekombinanten Allergenen in vivo mittels Provokationstests

47 Pricktest und intradermaler Hauttest mit rekombinanten Allergenen In vivo allergenic activity of a hypoallergenic mutant of the major fish allergen Cyp c 1 evaluated by means of skin testing. Douladiris et al., J Allergy Clin Immunol Diagnostic value of recombinant Aspergillus fumigatus allergen I/a for skin testing and serology. Moser et al., J-Allergy-Clin-Immunol Type I skin reactivity to native and recombinant phospholipase A2 from honeybee venom is similar. Muller et al., J-Allergy-Clin-Immunol Serological and skin-test diagnosis of birch pollen allergy with recombinant Bet v I, the major birch pollen allergen. Menz et al., Clin-Exp-Allergy Skin testing with recombinant allergens rbet v 1 and birch profilin, rbet v 2: diagnostic value for birch pollen and associated allergies. Pauli et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1996

48 Nasale Provokation mit rekombinanten Allergenen Skin test results but not serology reflect immediate type respiratory sensitivity: a study performed with recombinant allergen molecules. Niederberger et al., J-Invest-Dermatol. 2001

49 REKOMBINANTE ALLERGENE IN DER ALLERGIEDIAGNOSTIK UND -BEHANDLUNG First cloning of allergen-encoding cdnas DNA and amino acid sequence similarities the basis for the one for all concept IgE-based diagnosis with recombinant allergens Development of animal models based on recombinant allergens Construction and characterization of recombinant hypoallergens for allergy vaccination First studies using recombinant allergens for provocation testing in allergic patients 1996 First population studies using recombinant allergens 1999 Monitoring the course of SIT using recombinant allergens Evaluation of recombinant hypoallergens in patients by provocation testing 2002 The concept of marker allergens for the identification of cross-sensitizations and for selection of patients for SIT 2002 Microarrayed recombinant allergens for diagnosis First immunotherapy trial with recombinant hypoallergens 2005 First immunotherapy trial with recombinant allergens 2008 Comparison of extract-, purified allergen-, and recombinant allergen-based SIT 2008 Recombinant allergens as reference materials for allergenic products 2009 Phase III studies with recombinant hypoallergens completed 2010 First SLIT studies with recombinant allergens

50 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!