1. Allgemeines, Verwendungszweck. 2. Parvovirus B19

Transkript

1 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] recomline Parvovirus B19 IgM Immunoassay mit rekombinant produzierten Antigenen zur Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern, sowie Aviditätsbestimmung von IgG-Antikörpern gegen Parvovirus B19 in humanem Serum oder Plasma. 1. Allgemeines, Verwendungszweck Der recomline Parvovirus B19 IgG/IgM ist ein qualitativer in-vitro-test zum Nachweis und zur Identifizierung von IgG- und IgM-Antikörpern gegen das Parvovirus B19 in humanem Serum oder Plasma. Der recomline Parvovirus B19 IgG/IgM erlaubt durch separates Auflinieren verschiedener rekombinant hergestellter Antigene die Bestimmung von spezifischen Parvovirus B19 Antikörpern. Im Gegensatz zu ELISA Testsystemen können durch die verschiedenen Antigen-Reaktionsmuster und der Möglichkeit der Aviditätsbestimmung zusätzliche Aussagen über den Infektionsstatus gemacht werden. 2. Parvovirus B19 Parvovirus B19 ist ein Einzelstrang-DNA-Virus mit einem linearen Genom von ca. 5,1 Kb Länge. Seine Oberfläche wird von einer Proteinhülle gebildet, die aus zwei Polypeptiden VP1 (ca. 84 kda) und VP-2 (ca. 58 kda) besteht. Die beiden Kapsidproteine VP1 und VP2 werden vom gleichen Leserahmen auf dem viralen Genom kodiert, sie sind sequenzidentisch bis auf einen zusätzlichen N-terminalen Anteil des VP1 (ca. 26 kda). Weiterhin wird noch ein Nicht-Strukturprotein NS-1 gebildet, welches für die Virusreplikation und Vermehrung in der Zelle nötig ist. Parvovirus B19 wird primär in erythropoetischen Vorläuferzellen repliziert und lysiert diese, so dass je nach immunologischer Kompetenz mehr oder weniger ausgeprägte Anämien auftreten können. Das Virus wird meist durch Tröpfchen-Infektion übertragen; bedingt durch die relativ hohe Stabilität der Virusproteinhülle ist eine Infektion durch Blut und Blutprodukte ebenso möglich. Parvovirus B19 tritt weltweit auf, wobei in den meisten Ländern ein Durchseuchungstiter von ca % beobachtet wird. Klinische Bilder: Die häufigste klinische Manifestation ist das Erythema infectiosum, auch als typische Kinderkrankheit Ringelröteln (engl. Fith Disease, die fünfte exanthematöse Kinderkrankheit neben Scharlach, Masern, Röteln, und Exanthema subitum) bekannt. Nach relativ milden Prodromalsymptomen kommt es nach ein bis zwei Wochen zur Ausbildung des typischen Exanthems, das meist von grippeähnlicher Symptomatik begleitet wird. Das Exanthem tritt meist zuerst an den Wangen auf und breitet sich innerhalb weniger Tage über den ganzen Körper aus. Bei ca. 50% der erwachsenen Normalpersonen verläuft eine Infektion durch Parvovirus B19 weitgehend asymptomatisch; in einigen Fällen werden grippeähnliche Symptome beobachtet. Allerdings sind Komplikationen wie zusätzlich auftretende Arthralgien und Arthritis häufig (ca. 60%). Frauen sind hiervon doppelt so oft betroffen wie Männer. Diese Arthropathien verschwinden in den meisten Fällen innerhalb von zwei bis vier Wochen. In wenigen Fällen können die Symptome jahrelang intermittierend fortbestehen, so dass bei der Abklärung chronischer Arthropathien auch an eine persistierende Parvovirus B19-Infektion gedacht werden muss. Bedingt durch die Bildung von spezifischen Antikörpern ist die Dauer der Virusvermehrung limitiert, so dass der Befall und Verlust von erythropoetischen Vorläuferzellen keine gravierenden Effekte nach sich zieht. Bei Patienten mit hämolytischen Anämien kann dieses jedoch zu einer lebensbedrohenden aplastischen Krise führen. Bei Infektion während der Schwangerschaft kann das Parvovirus B19 transplazentar auf den Föten übertragen werden, und führt somit bei ca. 20% der Fälle zu einer intrauterinen Infektion. Aufgrund der kurzen Erythrozytenüberlebenszeit bis zur zwanzigsten Schwangerschaftswoche und einer fehlenden effizienten Immunabwehr kann eine Infektion zu einer schweren akuten oder chronischen Anämie und nachfolgendem Spontanabort führen. Eine weitere Komplikation nach Infektion während des zweiten und dritten Trimenons ist die Ausbildung eines Hydrops fetalis, der unbehandelt meist das Absterben der Frucht zur Folge hat. Im Gegensatz zum Rötelnvirus verursacht der Erreger der Ringelröteln keine Embryopathie, ein Schwangerschaftsabbruch ist deshalb nicht indiziert

2 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN Bei immundefizienten Personen kann eine Parvovirus B19-Infektion eine chronische Anämie sich ziehen, da das Virus nicht vollständig eliminiert werden kann. Im Vergleich zur aplastischen Krise bei Patienten mit Anämie handelt es sich hier jedoch um deutlich mildere Verlaufsformen. Zusätzliche Organmanifestationen wie etwa hepatische Dysfunktionen, respiratorische Erkrankungen, Parvovirus B19-assoziierte Myokarditis u.a. sind in jüngster Zeit beschrieben worden. In Einzelfällen werden auch chronische Anämien und Arthropathien verursacht durch persistierende Parvovirus B19-Infektionen in Patienten ohne bekannten Immundefekt gefunden. 3. Diagnostik Eine Erstinfektion durch Parvovirus B19 ist durch das Vorhandensein spezifischer IgM Antikörper charakterisiert. IgM-Titer werden meist etwa 10 Tage nach Infektion und damit meist gleichzeitig mit dem Auftreten der Symptomatik gefunden. IgG-Titer sind wenige Tage später zu finden und persistieren in der Regel lebenslang. Für den Antikörpernachweis können die Strukturproteine des Virus verwendet werden. In aktuellen Arbeiten wurde auch das Nicht-Strukturprotein NS-1 als serologischer Marker bei chronischen Verlaufsformen beschrieben. Nach Parvovirus B19-Infektionen werden in mindestens 10-20% aller Seren Antikörper gegen das NS-1 Protein gefunden. Bei Patienten mit Verdacht auf persistierende Infektion (chronische Anämie, chronische Arthropathien, Immundefizienz, Ausschlussdiagnostik) sollte immer auch ein Virusnachweis mittels PCR durchgeführt werden. recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität], IgM Für den vorliegenden Line-Assay werden gentechnologisch erzeugte Parvovirus B19-Antigene verwendet, die in E.coli bzw. in eukaryotischen Zellen als Nicht-Fusionsproteine produziert werden. Die Unterteilung des Strukturproteins VP1 in zwei Segmente sowie die separate Präsentation von linearen und Konformationsepitopen des VP2-Proteins erlauben bei der serologischen Interpretation einen Hinweis auf den möglichen Infektionszeitpunkt. Mit Beginn der Immunantwort nach Erstinfektion werden im allgemeinen IgG-Antikörper gegen lineare Epitope auf dem gesamten Strukturprotein gebildet; d.h. eine Patientenprobe mit diesem Immunstatus erkennt sowohl den N- wie auch den C- terminalen Bereich (VP-N und VP-C, daneben auch noch VP-2r und VP-1S). Im Verlauf von etwa 6-9 Monaten werden die VP-C-spezifischen, gegen lineare Epitope gerichteten Antikörper durch solche ersetzt, die bevorzugt Konformationsepitope erkennen. Diese Epitope werden durch das Protein VP-2p präsentiert. Die entsprechenden IgG-Antikörper bleiben in der Regel lebenslang erhalten. Mit zunehmender Dauer nach Erstinfektion ist somit ein Verschwinden der Reaktion gegen VP-C (meist nach 6 Monaten) und VP-2r (meist nach wenigen Jahren), auf den Streifen feststellbar, während die IgG- Antikörper gegen VP-N (und z.t. VP-1S) über sehr viele Jahre hin nachweisbar und diejenigen gegen VP-2p meist lebenslang erhalten bleiben. Zusätzlich ist auf dem Teststreifen noch das Nicht-Struktur-Protein NS-1 von Parvovirus B19 vorhanden. Nach Literaturangaben und eigenen Evaluierungen (siehe Punkt 13) sind IgG-Antikörper gegen NS-1 in Patienten mit B19-induzierter Arthritis und anderen chronischen Verläufen, nicht aber bei akuten Infektionen zu finden. Aufgrund des Durchseuchungstiters kann eine Diagnose nie alleine aufgrund von Anti-NS-1 gestellt werden, sondern muss immer durch ein positives PCR-Resultat untermauert werden. Bei Verdacht auf persistierende Parvovirus B19-Infektion kann das Vorhandensein eines Anti-NS-1- Titers also nur einen Hinweis geben

3 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Abbildung 1: Parvovirus B19 Gene; verwendete rekombinante Antigene im recomline Parvovirus B19 IgG, IgM Lokalisation und Anordnung Parvovirus B19 Proteine 5 3 NS-1 VP1 VP2 rekombinante Antigene im recomline Parvovirus B19 NS-1 VP-N VP-1S VP-C VP-2p; VP-2r Tabelle 1: Beschreibung und diagnostische Aussagekraft der verwendeten rekombinanten Antigene Antigenbez. VP2 (VP-2p, VP-2r) VP-N VP-C VP-1S NS-1 Beschreibung und diagnostische Aussagekraft Hauptkapsidantigen; IgG-Antikörper gegen die Konformationsepitope (VP- 2p) sind in der Regel lebenslang nachweisbar, gegen die linearen Epitope (VP-2r) nur Monate bis wenige Jahre. Beide Antigene zeigen eine gute Reaktivität in der frühen Phase der Infektion. N-terminales Fragment des Kapsidantigens VP1; IgG-Antikörper oft jahrelang nachweisbar. Berücksichtigung bei der Aviditätsbestimmung. C-terminales Fragment der Kapsidantigene VP1 bzw. VP2; die Reaktivität (IgG und IgM) der linearen Epitope erscheint früh im Verlauf der Parvovirus-B19-Infektion und verschwindet bald wieder (IgG: in der Regel nach etwa 6 Monaten, IgM: in der Regel bis spätestens nach ca. 12 Wochen). N-terminales, spezifisches Fragment des Kapsidantigens VP1 (der Bereich, in dem sich VP-1 und VP-2 unterscheidet), IgG-Antikörper nach Infekt lange nachweisbar. Berücksichtigung bei der Aviditätsbestimmung. Nichtstrukturprotein 1, erscheint im IgG frühestens 6-8 Wochen nach Infektion bei mindestens 20 % der Erkrankten, kann evtl. Hinweis auf Viruspersistenz geben. Bei der Interpretation eines positiven oder fraglichen IgM-Resultats muss immer das IgG- Reaktivitätsmuster miteinbezogen werden. Bei einer frischen oder kurz zurückliegenden Infektion sollte in der Regel auch immer ein deutlicher VP-C-IgG-Titer zu finden sein. Durch die Aviditätsbestimmung im recomline Parvovirus B19 IgG kann die Diagnosestellung in der Parvovirus B19-Serologie erweitert werden. Die Avidität ist ein Maß für die Stärke der Bindung zwischen einem Antikörper und seinem korrespondierendem Antigen. Normalerweise durchlaufen die IgG- Antikörper eine Reifung, d.h. die IgG-Antikörper der frühen Phase sind niedrig avide, während die Antikörper der abgelaufenen Infektion eine hohe Avidität aufweisen. Die Bindung zwischen Antigen und Antikörper ist bei niedrig aviden Antikörpern so schwach, dass sie durch Anwendung eines Aviditätsreagenzes aufgelöst werden kann, d.h. die Antikörper können von der Bindungsstelle auf dem recomline Parvovirus B19 IgG Streifen abgewaschen werden. Hoch avide Antikörper weisen eine starke Bindung zum Antigen auf, die durch den Einsatz eines Aviditätsreagenzes nicht gelöst werden kann

4 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN Immundominante rekombinante Antigene sowohl von VP1 als auch VP2 Die IgG- und IgM-Immunantworten werden getrennt erfasst und können jeweils in ihrer Intensität bewertet werden. Kontrollbanden zur Überprüfung der Konjugat-Reaktion (IgG, IgM) Sicherer Nachweis durch Streifen spezifische Cutoff-Kontrolle Klar definierte, rekombinante, hoch aufgereinigte Antigene, dadurch hohe Spezifität. Einfache und klare Interpretation durch leicht ablesbare Banden. Höhere Sensitivität aufgrund mengenmäßig optimierter Antigene Möglichkeit der Aviditätsbestimmung zur Eingrenzung des Infektionszeitpunk, individuelle Bewertung der gegen Einzelantigene gerichteten Avidität der IgG-Antikörper (VP-N, VP-1S) 4. Testprinzip Die rekombinanten, hochgereinigten Proteine werden auf eine Nitrozellulose-Membran aufgetragen. Diese Matrix wird anschließend in Streifen geschnitten. Zum Nachweis von Parvovirus B19-spezifischen Antikörpern werden die Streifen mit der verdünnten Serumprobe inkubiert, wobei die Antikörper sich an die Antigene auf den Streifen anlagern. Nichtgebundene Antikörper werden anschließend weggewaschen und die Streifen in einem zweiten Schritt mit Anti-human-IgG bzw. -IgM inkubiert, die mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt sind. Mit einer durch die Peroxidase katalysierten Färbereaktion werden spezifisch gebundene Antikörper nachgewiesen. Falls eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattgefunden hat, erscheint an der entsprechenden Stelle eine dunkle Bande auf dem Streifen. Am oberen Ende der Teststreifen befinden sich untereinander vier Kontrollbanden: 1. Die Reaktionskontrolle unter der Streifennummer, die bei jedem Serum eine Reaktion zeigen muss 2. Zwei Konjugatkontrollen IgG/IgM: diese Banden dienen zur Kontrolle der jeweiligen nachgewiesenen Antikörperklasse. Wird der Teststreifen z. B. zum Nachweis von IgG-Antikörpern benutzt, zeigt die IgG-Konjugatkontrollbande eine deutliche Bande. Analoges gilt für die IgM-Konjugatkontrollbande. 3. Cutoff Kontrolle: zur Kontrolle des Färbeprozesses bzw. Auswertung der Teststreifen. Die Intensität dieser Bande erlaubt die Beurteilung der Antikörper-Reaktivität in positiv, fraglich oder negativ. 5. Packungsinhalt Die Reagenzien einer Packung reichen für 25 Bestimmungen. Jeder Reagenziensatz enthält: 100 ml Waschpuffer (zehnfach konzentriert) Enthält Phosphat-Puffer, NaCl, KCl, Detergenz, Konservierungsmittel: Methylisothiazolon und Oxypyrion 45 ml Chromogenes Substrat Tetramethylbenzidin (TMB, gebrauchsfertig) 5 g Magermilchpulver 1 Gebrauchsinformation 1 Auswertebogen - 4 -

5 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM 5.1 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] Jeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten: 1 Stück Röhrchen mit 25 durchnummerierten Teststreifen, beschichtet mit rekombinant hergestellten Parvovirus B19 Antigenen 6 ml Anti-human IgG Konjugat (zehnfach konzentriert) Aus Kaninchen, enthält NaN 3 Aviditätsbestimmung Für die Bestimmung der Avidität von Parvovirus B19 IgG-Antikörpern ist als Zusatz auf Wunsch das Aviditätsreagenz mit entsprechender Gebrauchsinformation lieferbar. 1 Aviditätsreagenz (Feststoff) für 60 ml gebrauchsfertige Lösung Art. Nr recomline Parvovirus B19 IgM Jeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten: 1 Stück Röhrchen mit 25 durchnummerierten Teststreifen, beschichtet mit rekombinant hergestellten Parvovirus B19 Antigenen 6 ml Anti-human IgM Konjugat (zehnfach konzentriert) Aus Kaninchen, enthält NaN 3 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör Deionisiertes Wasser, Absaugsystem mit Desinfektionsfalle, Mikropipetten, Plastikpinzette, Schüttler, Messzylinder, Laborwaage. Inkubationsschalen (sind bei Bedarf von der MIKROGEN GmbH zu beziehen), 7. Hinweise zum Test und den Reagenzien 7.1 Vorsichtsmaßregeln Während des gesamten Testablaufs müssen geeignete Einmalhandschuhe getragen werden. Die Konjugate enthalten Natriumazid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Berührung kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 1 Stunde bei 121 C autoklaviert werden. Inkubationsschalen nur einmal verwenden. Streifen vorsichtig mit einer Plastikpinzette handhaben. 7.2 Hinweise zur Handhabung Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2 C - 8 C lagern, nicht einfrieren. Vor Testbeginn sind alle Bestandteile für mindestens 30 Minuten auf 18 C - 25 C (Raumtemperatur) zu temperieren. Die Testdurchführung erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur. Die Inkubationstemperatur soll zwischen 18 C und 25 C liegen. Vor Gebrauch die konzentrierten Konjugate gut durchmischen. Die Patientenseren ebenfalls gut mischen. Das Röhrchen mit den Teststreifen ist erst unmittelbar vor Gebrauch zu öffnen, um eine Kondenswasserbildung zu vermeiden. Die nicht benötigten Streifen verbleiben im Röhrchen und werden weiterhin bei 2 C - 8 C gelagert (Röhrchen wieder gut verschließen, Teststreifen dürfen vor Versuchsbeginn nicht feucht werden!). Die Packungen tragen ein Verfallsdatum, nach dessen Erreichen keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden kann

6 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN Es dürfen nur Einzelreagenzien verwendet werden, deren Chargennummer mit der entsprechenden Chargennummer auf dem Etikett der Kitverpackung übereinstimmt. Der Test ist nur von geschultem und autorisiertem Fachpersonal durchzuführen. Bei substantiellen Änderungen am Produkt, bzw. der Anwendungsvorschrift kann die Anwendung außerhalb der von MIKROGEN vorgegebenen Zweckbestimmung liegen. Automatisierung ist möglich, nähere Informationen erhalten Sie von MIKROGEN. 7.3 Herstellung der Lösungen Herstellung des gebrauchsfertigen Waschpuffers Dieser Puffer wird für die Serum- und Konjugatverdünnung sowie die Waschschritte benötigt. Vor dem Verdünnen ist das Volumen des Waschpuffers für die entsprechende Anzahl der durchzuführenden Tests zu bestimmen. Das Magermilchpulver wird zuerst in Waschpuffer-Konzentrat vorgelöst und diese Mischung dann mit deionisiertem Wasser auf das Endvolumen aufgefüllt (Verdünnung: 1 + 9). Die benötigten Mengen sind der Tabelle 2 zu entnehmen. Volumina für in der Tabelle nicht aufgeführte Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln. Gebrauchsfertiger Waschpuffer kann bei 2 C - 8 C vier Wochen gelagert werden. Tabelle 2: Waschpuffer pro eingesetzte Teststreifen eingesetzte Teststreifen Magermilchpulver Waschpuffer- Konzentrat Deionisiertes Wasser gebrauchsfertiger Waschpuffer 1 0,1 g 2 ml 18 ml 20 ml 2 0,2 g 4 ml 36 ml 40 ml 3 0,3 g 6 ml 54 ml 60 ml 5 0,5 g 10 ml 90 ml 100 ml 10 1 g 20 ml 180 ml 200 ml 20 2 g 40 ml 360 ml 400 ml 25 2,5 g 50 ml 450 ml 500 ml Herstellung der Konjugatlösungen Die Konjugatlösung für die IgG- bzw. IgM-Bestimmung ist unmittelbar vor Gebrauch herzustellen, eine Lagerung der gebrauchsfertigen Konjugatlösung ist nicht möglich. Ein Teil des IgG- bzw. IgM-Konjugat-Konzentrats wird mit 9 Teilen gebrauchsfertigem Waschpuffer verdünnt (1 + 9). Die benötigten Mengen sind der Tabelle 3 zu entnehmen. Volumina für in der Tabelle nicht aufgeführte Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln

7 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Tabelle 3: Volumina der Anti-human-IgG / IgM-Konjugat-Verdünnung eingesetzte Teststreifen * Konjugat-Konzentrat (wahlweise IgG, IgM) gebrauchsfertiger Waschpuffer Gebrauchsfertige Konjugatlösung 1 0,2 1,8 ml 2 ml 2 0,4 ml 3,6 ml 4 ml 3 0,6 ml 5,4 ml 6 ml 5 1 ml 9 ml 10 ml 10 2 ml 18 ml 20 ml 20 4 ml 36 ml 40 ml 25 5 ml 45 ml 50 ml * Die Mengen sind ohne Totvolumen berechnet. Je nach Abarbeitung (manuell bzw. an einem Gerät) bitte zusätzliche Konjugatlösung für 1 bis 3 Streifen ansetzen Substratlösung Das Substrat ist gebrauchsfertig. Vor Beginn der Färbung auf Raumtemperatur (18 C - 25 C) bringen. Eine Kontamination der nicht verwendeten Substratlösung durch unsterile Pipettenspitzen etc. muss unbedingt vermieden werden, da dadurch die Sensitivität des Testes beeinträchtigt werden kann. 7.4 Lagerung und Haltbarkeit Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2 C - 8 C lagern. Gebrauchsfertiger Waschpuffer kann bei 2 C - 8 C vier Wochen gelagert werden. Die Konjugatlösung muss immer frisch zubereitet werden. 8. Probenmaterial Das Probenmaterial kann Serum oder Plasma sein, das nach Entnahme möglichst rasch vom Blutkuchen getrennt wurde, um eine Hämolyse zu vermeiden. Hitzeinaktivierte Proben können zu erhöhten Hintergrundreaktionen führen. Eine mikrobielle Kontamination der Probe ist unbedingt zu vermeiden. Unlösliche Stoffe sind vor der Inkubation aus der Probe zu entfernen. Die Verwendung von lipämischen, hämolysierten oder trüben Proben kann einen dunklen Hintergrund auf den Streifen recomline Parvovirus B19 IgG/IgM ergeben. Achtung! Sollen die Bestimmungen nicht sofort erfolgen, kann das Probenmaterial bis zu 2 Wochen bei 2 C - 8 C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung der Proben ist durch Aufbewahrung bei - 20 C oder tiefer möglich. Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben wird wegen der Gefahr fehlerhafter Resultate nicht empfohlen. 9. Testdurchführung 9.1 Allgemeines Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hängt in starkem Maße vom gleichmäßigen Waschen der Streifen ab. Die unter 9.3 und 9.5 beschriebenen Waschfrequenzen sollten deshalb immer eingehalten werden. 9.2 Inkubation der Proben 1. Für jeden Testansatz wird eine Vertiefung einer Inkubationsschale benötigt (siehe 6). In die Vertiefungen werden je 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers pipettiert. In die mit gebrauchsfertigem Waschpuffer gefüllten Vertiefungen wird anschließend je ein Teststreifen vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette eingetaucht. Die Streifennummerierung zeigt nach oben

8 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN Achtung! Die Streifen müssen vollständig mit gebrauchsfertigem Waschpuffer benetzt und untergetaucht sein. Verwendete Röhrchennummer und Streifennummer im Auswertebogen notieren. 2. Probenzugabe IgG/IgM-Testdurchführung: 20 µl einer unverdünnten Probe (Humanserum oder Plasma) werden je Inkubationsansatz zum Teststreifen pipettiert. (Verdünnung ) Bitte achten Sie darauf, die Probe an einem Ende des untergetauchten Streifens in den Waschpuffer einzupipettieren und schnellstmöglich durch vorsichtiges Schütteln der Inkubationswanne einzumischen. Probennummern und zu detektierende Immunglobulinklasse (IgG, IgM) im Auswertebogen notieren. Die Inkubationsschale wird mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt und unter leichtem Schütteln 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Achtung! Es ist darauf zu achten, dass die Inkubationslösungen nicht in andere Vertiefungen verschleppt werden; insbesondere beim Öffnen und Schließen des Deckels sind Spritzer zu vermeiden. 9.3 Waschen 1. Nach der Inkubation werden die Kunststoffdeckel vorsichtig von den Inkubationsschalen abgenommen. 2. Die Serumverdünnung wird vorsichtig aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt. Achtung! Nach dem Absaugen der Lösungen aus einer Vertiefung sind die Pipettenspitzen zu wechseln oder nach jedem Absaugvorgang gut mit deionisiertem Wasser zu spülen, da die Gefahr einer Kreuzkontamination besteht. Bei maschineller Abarbeitung sind diesbezüglich die Hinweise des Geräteherstellers zu beachten. 3. In jede Vertiefung werden anschließend 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers gegeben und für 5 Minuten unter leichtem Schütteln auf dem Schüttler gewaschen. Nach dem Waschvorgang wird der Waschpuffer abgesaugt. 4. Der Waschschritt unter Punkt 3 wird insgesamt dreimal durchgeführt. 9.4 Inkubation mit Peroxidase-Konjugat Nach dem Waschen der Streifen werden in jede Vertiefung 2 ml der entsprechend vorbereiteten Konjugatlösung (siehe Tabelle 3) gegeben und 45 Minuten unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei wird die Inkubationsschale mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt. 9.5 Waschen Die Konjugatlösungen werden aus den Inkubationswannen abgesaugt und die Streifen erneut gewaschen (vergleiche 9.3). 9.6 Substratreaktion 1. In jede Vertiefung werden 1,5 ml Substratlösung gegeben und 5-10 Minuten unter leichtem Schütteln und unter Beobachtung bei Raumtemperatur inkubiert. 2. Sobald die Cutoff-Kontrollbande zu sehen ist, wird der Färbeprozess beendet

9 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM 9.7 Abstoppen der Reaktion 1. Nach Absaugen der Substratlösung werden die Streifen dreimal kurz mit deionisiertem Wasser gewaschen. 2. Die Streifen werden vorsichtig mit einer Plastikpinzette aus dem Wasser entnommen und zum Trocknen für ca. 2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers gelegt. Anschließend können die Streifen auf dem beigelegten Auswertebogen aufgeklebt und die Ergebnisse protokolliert werden. 3. Die Streifen sollten vor Licht geschützt aufbewahrt werden. 9.8 Durchführung der Aviditätsbestimmung Die Durchführung der Aviditätsbestimmung mit dem recomline Parvovirus B19 IgG wird in der Gebrauchsinformation zu dem Aviditätsreagenz (Artikel-Nr ) beschrieben. 10. Zusammenfassung der Testdurchführung 1. alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. 2. in 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer Streifen einlegen, die Streifen müssen komplett untergetaucht sein. 3. jeweils 20 µl von der Probe einpipettieren 4. 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren 5. dreimal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen 6. 2 ml gebrauchsfertige Konjugatlösung zugeben Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren 8. dreimal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen 9. 1,5 ml der Substratlösung zugeben; 5-10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. 10. mindestens dreimal mit deionisiertem Wasser waschen Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers trocknen und das Ergebnis ablesen 11. Auswertung 11.1 Bewertung der Bandenintensität 1. Notieren Sie im beigefügten Auswertebogen Datum und Chargen-Nummer, sowie die detektierte Antikörperklasse. 2. Tragen Sie die Proben-Identifizierungs-Nummern in das Protokollblatt ein. 3. Kleben Sie nun mit einem Klebestift die dazugehörigen Teststreifen in die entsprechenden Felder des Auswertebogens. Richten Sie dazu die Teststreifen mit der Reaktionskontroll-Bande an der eingezeichneten Markierungslinie aus. Kleben Sie dann mit einem durchsichtigen Klebeband die Teststreifen links von der Markierungslinie an. Flächiges Ankleben der ganzen Teststreifen mit Klebestift oder Klebeband kann zu Veränderungen der Färbung führen. 4. Identifizieren Sie nun die Banden der entwickelten Teststreifen anhand des aufgedruckten Kontrollstreifens des Auswertebogens und tragen diese in das Protokollblatt ein. Nehmen Sie dazu anhand der 5. Tabelle 4 die Bewertung der Intensität der auftretenden Banden gesondert für die entsprechenden Immunglobulin-Klassen vor

10 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN 11.2 Kontrollergebnisse Eine Auswertung des Tests kann erfolgen, wenn die folgenden Kriterien erfüllt sind: Reaktionskontroll-Bande (oberste Linie) deutlich gefärbt, dunkle Bande Antikörperklasse (zweite und dritte Bande): die entsprechende Konjugatkontrollbande muss eine deutliche Färbung zeigen. Die andere Konjugatkontrollbande kann eine schwache, unspezifische Färbung entwickeln. Cutoff-Kontrolle (vierte Bande): schwache, aber sichtbare Färbung Tabelle 4: Bewertung der Bandenintensität im Bezug zur Cutoff-Bande Banden keine Reaktion sehr schwache Intensität (geringer als Cutoff-Bande) schwache Intensität (entspricht Cutoff-Bande) starke Intensität (stärker als Cutoff-Bande) sehr starke Intensität Intensität - +/ Achtung! Die Bandenmuster beim recomline Parvovirus B19 IgG- und IgM-Nachweis können unterschiedliche Intensitäten aufweisen. Es ist möglich, dass der IgG recomline kräftigere und dunklere Banden als der IgM recomline zeigt. Die Intensität der Proteinbanden ist abhängig von der Konzentration der Parvovirus B19-spezifischen Antikörper. Bewertung der Avidität: siehe Kapitel Testergebnisse und Testinterpretation Tabelle 5: Auswertung der Banden beim IgG- Nachweis (ohne Beurteilung der NS-1-Reaktivität) keine Reaktion oder andere Konstellationen wie unten IgG negativ VP-N oder VP-2r oder VP-C mindestens mit + IgG fraglich VP-2p oder zwei Antigene (VP-N, VP-1S, VP-2r, VP-C) mindestens mit + IgG positiv Tabelle 6: Auswertung der Banden beim IgM-Nachweis (ohne Beurteilung der NS-1-Reaktivität) keine Reaktion oder andere Konstellationen wie unten IgM negativ VP-N oder VP-1S oder VP-2r oder VP-C mindestens mit + IgM fraglich zwei Antigene (VP-2p, VP-N, VP-1S; VP-2r, VP-C) mindestens mit + IgM positiv Interpretation der NS-1-Reaktivität (IgG) Die NS-1-Reaktion sollte nur im IgG betrachtet werden. Für die Beurteilung Anti-Parvovirus B19 positiv/negativ sollte die NS-1-Reaktion im Normalfall nicht mit einbezogen werden. Bei der Beurteilung des möglichen Zeitpunktes der Infektion kann bei vorhandener NS-1-Reaktivität im IgG in der Regel davon ausgegangen werde, dass dieser mindestens sechs Wochen zurückliegt. Zu beachten ist allerdings, dass NS-1-Antikörper in nur etwa 20% der Fälle überhaupt gebildet werden. Im Zusammenhang mit entsprechender Symptomatik und klinischen Vorbefunden kann ein NS-1-Titer einen Hinweis auf eine mögliche Persistenz dieses Virus geben. Allerdings darf die Diagnose persistierende Parvovirus B19-Infektion nie allein aufgrund des serologischen Befunds gestellt werden. Hauptkriterium bleibt der Nachweis von Parvovirus B19-Antigen oder Parvovirus B19-DNA. Weiterhin ist zu beachten, dass sich NS-1 IgG-Antikörper erst nach gewisser

11 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Zeit entwickeln, auch eine DNA-Bestimmung mittels PCR muss nicht zu jedem Zeitpunkt der Persistenz positiv sein. Deshalb sind in solchen Fällen immer mehrere Bestimmungen im zeitlichen Verlauf zu fordern Hinweise zur Interpretation Bei der Beurteilung des Testergebnisses sollten stets IgG- und IgM-Befunde gemeinsam betrachtet werden. Für alle Testinterpretationen, insbesondere aber bei schwachpositiven bzw. fraglichen Resultaten, ist die Einbeziehung eventuell vorhandener klinischer Informationen unerlässlich. Es empfiehlt sich auch hier eine enge Kooperation von Labor und behandelndem Arzt. Proben mit unklaren oder fraglichen Ergebnissen sollten in Abhängigkeit von der klinischen Situation nach 2-3 Wochen kontrolliert werden. Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit einer Parvovirus B19-Infektion nicht grundsätzlich aus. Falsch negative Ergebnisse können auftreten, wenn die Probenabnahme vor der initialen Reaktion des Immunsystems erfolgte. Isoliert positive IgM-Nachweise ohne positiven IgG-Befund bedürfen sorgfältiger Interpretation. Hier kann es sich um eine akute Infektion handeln. Auch bei einem eindeutigen IgG-Befund einer länger zurückliegenden Parvovirus B19 Infektion kann eine schwache IgM-Reaktivität durch persistierende IgM-Antikörper verursacht werden. Durch eine polyklonale Stimulierung von B-Lymphozyten bei einer akuten Epstein-Barr Virus Infektion kann die Parvovirus B19 IgM-Antikörperbildung reaktiviert werden, und somit zu einem positiven Parvovirus B19 IgM-Ergebnis führen. Die Verwendung von ikterischen Seren kann zu einer erhöhten Anzahl von positiven Ergebnissen führen. Typische Parvovirus B19 Reaktionsprofile: Aufgrund bisher durchgeführter Evaluierungen können die folgenden IgG- und IgM-Reaktionsmuster einen Hinweis auf einen bestimmtem Parvovirus B19-Status geben. Es muss aber darauf hingewiesen werden, dass es sich hierbei um typische Reaktionsmuster handelt, von denen es durchaus Abweichungen geben kann. Bei lang zurückliegenden Infektionen wird meist eine IgG-Reaktivität gegen VP-2p und/oder VP-N (meist mit VP-1S) beobachtet. Bei einer frischen Infektion ist zusätzlich zu VP-2p, VP-N und VP-1S eine starke IgG-Reaktivität gegen VP-C und VP-2r zu beobachten. Diese starke Reaktivität gegen das VP-C ist meist bei einer beginnenden oder kurz zurückliegenden Infektion (Dauer meist nicht länger als 6 Monate) zu finden. Falls keine IgG-Reaktivität gegen VP-C auftritt, kann eine akute Infektion mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen, bei weiteren Verdacht wird eine Verlaufskontrolle empfohlen

12 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN Tabelle 7: Parvovirus B19 Status und typische IgG- und IgM-Antikörperreaktionsmuster IgG VP-2p, VP-N, VP-2r, VP-C (Reaktivitäten meistens +) VP-2p, VP-N, VP-1S, VP-2r, VP-C (Reaktivitäten meistens ++) VP-2p, VP-N, VP-2r und VP-C, meist mit VP-1S (Reaktivitäten meistens ++) VP-2p und/oder VP-N mit VP-1S (Reaktivitäten meistens ++) negativ: VP-2r und VP-C IgM VP-2p, VP-N (Reaktivitäten meistens ++) VP-2r, VP-C (Reaktivitäten meistens + bis ++) VP-2p, VP-N und VP-2r (Reaktivitäten meistens +) negativ oder fraglich (isolierte Antigen-Reaktivitäten mit +) negativ möglicher Parvovirus B19 Status akute Infektion, IgG-Titer noch schwach oder nicht vorhanden Status nach Infektion (Wochen bis Monate) mit IgM- und IgG-Antwort Status nach Infektion (Monate) lang zurückliegende Infektion (Jahre) VP-2p, VP-N und VP-2r, (Reaktivitäten meistens nur +) VP-2p, VP-N, VP-1S (Reaktivitäten meistens +) negativ: VP-2r und VP-C VP-2p, VP-N und/oder VP-2r (evtl. VP-1S), (Reaktivitäten meistens nur +) VP-N, VP-1S (Reaktivitäten meistens nur +) unklarer Status, evtl. verursacht durch Boosterung; Test sollte im zeitlichen Verlauf wiederholt werden zurückliegende Infektion durch IgG-Befund mit untypischer IgM- Reaktivität, Konstellation wurde bei einigen Rheumafaktor positiven Seren beobachtet, Test sollte im zeitlichen Verlauf wiederholt werden Die Bewertung von NS-1 Titern im IgG zur Abklärung persistierender Parvovirus B19-Infektionen, reaktiven Arthropathien, chronischen Anämien oder anderer Symptomatik mit Verdacht auf Parvovirus B19-Persistenz wurde in Tabelle 7 nicht berücksichtigt, da hier abhängig von Dauer, Klinik, und Immunkompetenz eine Vielzahl von Kombinationen möglich sind. NS-1-Titer sollten nur bei speziellen Fragestellungen mit in die Interpretation einbezogen werden (siehe 11.3). Aviditätsbestimmung: In den meisten Fällen erlaubt die Bestimmung der Avidität der gegen die jeweiligen Einzelantigene gerichteten IgG-Antikörper eine genauere Bestimmung des vorliegenden Infektionsstatus, insbesondere die Unterscheidung einer akuten Infektion mit Parvovirus B19 von einer subakuten Infektion mit persistierenden IgM-Antikörpern (siehe 11.5). Dunkle Teststreifen: Manche Patientenseren können auf dem gesamten Nitrozellulose-Streifen eine dunkle, durchgängige oder gemusterte Färbung erzeugen (z.b. bei Seren von Patienten mit Milcheiweiß- Allergien). Hierfür sind unterschiedliche Faktoren aus dem jeweiligen Patientenserum verantwortlich. Die Auswertung dieser Streifen ist in der Regel nur mit Einschränkungen möglich. So sind z.b. "inverse" Banden (weiße Banden auf dunklem Hintergrund) als negativ zu werten. Das entsprechende Serum sollte in jedem Fall mittels anderer serologischer Methoden überprüft werden

13 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM 11.5 Diagnoseerweiterung durch Aviditätsbestimmung Testprinzip und Testdurchführung Die Bestimmung der Avidität von Parvovirus B19 IgG-Antikörpern ist mit dem Aviditätsreagenz, Artikel- Nr möglich. Die Testdurchführung entnehmen Sie bitte der Gebrauchsinformation zum Aviditätsreagenz Avidität im recomline Parvovirus B19 IgG Die Avidität wird an IgG-Antikörpern gegen VP-N und VP-1S beurteilt. Gegen die im recomline Parvovirus B19 präsentierten linearen Epitope des VP-2r und VP-C werden in vielen Fällen im Infektionsverlauf keine hoch-aviden IgG-Antikörper gebildet. Die Konformation des VP-2p-Antigens und damit die Bindungseigenschaften werden durch das Aviditätsreagenz verändert, deshalb kann beim VP-2p keine verlässliche Abschätzung der Avidität durchgeführt werden Auswertung und Interpretation der Avidität im recomline Parvovirus B19 IgG Aviditätsbestimmung nur von anti- VP-N- und anti-vp-1s-igg-antikörpern Banden auf dem IgG-Streifen die in ihrer Reaktivität geringer als der Cutoff sind, werden bei der Aviditätsbestimmung nicht berücksichtigt. Vergleichen Sie die Intensitäten der entsprechenden Banden auf den beiden Teststreifen (IgG- Streifen und Aviditätsstreifen), die mit der gleichen Patientenprobe inkubiert wurden. Achten Sie darauf, ob sich die Intensitäten verändert haben. Eine Abnahme der Intensität der VP-N und VP-1S-Bande um wesentlich mehr als 50% kann als geringe Avidität betrachtet werden, eine Abnahme um ca. 50% als intermediäre Avidität. Bei hoher Avidität nimmt die Bandenintensität des Aviditätsstreifens nicht bis kaum ab, die IgG- Antikörper werden als hoch avide betrachtet. Die gegen VP-N und VP-1S gerichteten IgG-Antikörper erreichen frühestens im Verlauf von ca. 4 Wochen, spätestens 6 bis 8 Wochen nach Infektion hohe Avidität. Eine niedrige bzw. intermediäre Avidität der VP-N- und VP-1S-Bande ist daher als ein deutlicher Hinweis auf eine akute Infektion zu sehen. Im Falle von hoch aviden IgG-Antikörpern gegen VP-N und VP-1S kann eine Infektion innerhalb der letzten 4 Wochen in aller Regel ausgeschlossen werden. Weichen die Aviditäten von VP-N und VP-1S voneinander ab, so ist diejenige des VP-N maßgeblich. Generell gilt, dass für die Aviditätsbeurteilung keine absoluten Regeln aufgestellt werden können. In einzelnen Fällen ist zu beachten, dass niedrige Aviditäten auch bei zurückliegenden Infektionen nicht auszuschließen sind, da eine Reifeverzögerung der Avidität möglich ist. Die Interpretation der Avidität muss immer im Zusammenhang mit den gesamten Untersuchungsergebnissen erfolgen. 12. Klinische Ergebnisse Zur Leistungsbewertung des recomline Parvovirus B19 IgG, IgM wurden Patientenproben unterschiedlicher Herkunft getestet. Insgesamt wurde bei 298 Patientenproben ein IgG- Antikörpernachweis und bei 287 Proben ein IgM-Antikörpernachweis durchgeführt. Zusätzlich wurden 70 mögliche Störseren und 10 Serum/Plasma-Paare getestet. Bei 67 Patientenproben wurde die Avidität der IgG-Antikörper bestimmt Proben von Patienten mit akuter Parvovirus B19-Infektion Es wurden insgesamt 52 Serumproben von Patienten mit einer akuten Parvovirus B19-Infektion getestet. Darunter waren 12 Infektionsverläufe, bestehend aus jeweils 2-5 Abnahmen. In allen 12 Verläufen konnten spezifische Parvovirus B19 Antikörper nachgewiesen werden. In einigen Fällen war bereits die erste Patientenprobe des Infektionsverlauf positiv, bei den erst negativen Proben konnte bei den folgenden Abnahmen eine Serokonversion beobachtet werden. IgM-Antikörper konnten bei elf von diesen zwölf Infektionsverläufen mindestens bis zum 42. Tag nach dem ersten Auftreten von Symptomen nachgewiesen werden

14 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Gebrauchsinformation MIKROGEN 12.2 Blutspender Weiterhin wurden 187 (im IgG-Ansatz) und 176 (im IgM-Ansatz) nicht selektierte Blutspenderplasmen im recomline Parvovirus B19 untersucht. Diese Proben wurden auch parallel mit einem Parvovirus B19 Vergleichs-ELISA getestet (siehe unter ). IgG-Ergebnis: Im recomline Parvovirus B19 IgG waren 66% der Proben positiv. Viele dieser Proben zeigten typische Reaktionsmuster für länger zurückliegende Infektionen (siehe Tabelle 7). IgM-Ergebnis: Im recomline Parvovirus B19 IgM waren 3% der Proben positiv Vergleichstestung des recomline Parvovirus B19 mit einem Parvovirus B19 ELISA Die Übereinstimmung der beiden Parvovirus B19 Testsysteme war gut, beim Nachweis von IgG- Antikörpern stimmten die Ergebnisse zu ca. 98% überein, beim Nachweis von IgM-Antikörpern wurde eine Übereinstimmung der Ergebnisse, je nach Patientenkollektiv, von 93,1% bis 95,5% festgestellt. Bei der Berechnung der Übereinstimmung beider Testsysteme wurden die grenzwertigen bzw. fraglichen Ergebnisse zu den positiven Ergebnissen gezählt Austestung von 101 Serumproben von Patienten mit einer akuten oder kürzlich zurückliegenden Parvovirus B19-Infektionen. Vergleichs-ELISA Parvovirus B19 IgG/IgM akute oder kürzlich zurückliegende Infektionen positiv grenzwertig negativ recomline Parvovirus B19 IgG recomline Parvovirus B19 IgM positiv fraglich negativ positiv fraglich negativ Summe IgG bzw. IgM 101 Überstimmung beider IgG-Testsysteme 98,0% Überstimmung beider IgM-Testsysteme 93,1% Austestung der Blutspenderproben Vergleichs-ELISA Parvovirus B19 IgG/IgM Blutspenderproben positiv grenzwertig negativ recomline Parvovirus B19 IgG recomline Parvovirus B19 IgM positiv fraglich negativ positiv fraglich negativ Summe IgG 187 Summe IgM 176 Überstimmung beider IgG-Testsysteme 97,8% Überstimmung beider IgM-Testsysteme 95,5%

15 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM 12.4 Bestimmung der Sensitivität mittels des WHO-Standards IgG Der WHO-Standard IgG (100 IU/ml) wurde in davon ausgehenden Verdünnungen im recomline Parvovirus B19 IgG und in einem Vergleichs-ELISA IgG untersucht. Der WHO-Standard IgG zeigte bei einer Verdünnung noch bei von 1,5 IU/ml im recomline Parvovirus B19 ein fragliches Ergebnis (isoliert positive VP-N-Reaktivität). Der Vergleichs-ELISA IgG zeigte hier ebenfalls ein grenzwertiges Ergebnis Mögliche Störseren Bei der Untersuchung potentiell interferierender Faktoren wurden im Falle von lipämischen, CRP- und ANA-positiven Seren keine Hinweise auf eine Beeinträchtigung des Testergebnisses gefunden. Bei ikterischen, hämolytischen und Rheumafaktor-positiven Seren ergab sich eine leicht erhöhte Zahl an positiven IgM-Befunden (s. Tabelle 7). Bei Vorliegen einer infektiösen Mononukleose (Pfeiffer sches Drüsenfieber, EBV-Infektion) kann es zu einer polyklonalen Stimulierung von B-Lymphozyten kommen. Dies kann zu positiven Reaktionen beim Nachweis von Antikörpern der IgM-Klasse führen Vergleich Serum und Plasma Bei der Untersuchung der Proben von 10 Patienten wurden keine Unterschiede bei der Verwendung von Serum oder Plasma (EDTA-Plasma) festgestellt Bestimmung der Avidität der IgG-Antikörper Es wurden 67 Serumproben von akuten, kürzlich zurückliegenden bzw. länger zurückliegenden Parvovirus B19-Infektionen im recomline Parvovirus B19 IgG auf Avidität der gegen VP-N und VP-1S gerichteten IgG-Antikörper untersucht. Die Ergebnisse der Aviditätsuntersuchung korrelierten verlässlich mit den klinischen Daten und der Interpretation aus den Reaktivitäten der einzelnen Antigene mit IgG- und IgM-Antikörpern. Die Daten zeigten, dass die gegen VP-N und VP-1S gerichteten IgG-Antikörper frühestens nach 4 Wochen, in der Regel nach 6 bis 8 Wochen nach der Infektion zu hoher Avidität gereift waren. Nachfolgend wurden ausschließlich hoch avide IgG-Antikörper gefunden. 13. Literatur Die ausführliche Literaturliste finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation ab Seite 30. Auf Anforderung übersenden wir Ihnen gerne weiterführende Literatur zur Parvovirus B19 Diagnostik zu. 14. Erklärung der Symbole Die Tabelle mit der Erklärung der Symbole finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation auf Seite

16 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Instructions for use MIKROGEN recomline Parvovirus B19 IgG [Avidity] recomline Parvovirus B19 IgM Line immunoassay based on recombinant antigens for the determination of IgG and IgM antibodies and avidity of IgG antibodies against Parvovirus B19 in human serum and plasma. 1. General aspects, intended use recomline Testkit Parvovirus B19 is a qualitative in-vitro-test for the detection of IgG- and IgMantibodies against proteins of Parvovirus B19 in human sera and plasma. recomline Parvovirus B19 IgG, IgM provides for identification of specific Parvovirus B19 antibodies by means of separate line-ups of different antigens, produced by recombinant engineering. In contrast to ELISA testing systems the recomline Parvovirus B19 gives additional information about the state of infection by different reactivity patterns and the determination of avidity. 2. Parvovirus B19 Parvovirus B19 is a single-stranded DNA virus with a linear genome, ca. 5.1 Kb in length. Its surface is formed by a protein envelope which consists of two polypeptides VP-1 (approx. 84 kda) and VP-2 (approx. 58 kda). The two capsid protein VP1 and VP2 are coded from one reading frame on the viral genome; this means that both proteins are identical with the exception of a ca. 26 KDa N-terminal segment of VP 1. Also coded is a major non-structural protein (NS-1), which is required for virus replication and propagation. Parvovirus B19 replicates primarily in erythropoietic precursor cells, causing cell lysis. Therefore, depending on the immunological competence, more or less pronounced anaemias can occur. This virus is usually transmitted by droplet infection. As a result of the relative high stability of the virus protein envelope, infection via blood and blood products is also possible. Parvovirus B19 is found world-wide, about % of the population in most countries are infected. Clinical Pictures: The most frequent clinical manifestation produced is erythema infectiosum, also known as fifth disease, a typical childhood disease. Following relatively mild prodromal symptoms, a typical exanthem appears after one to two weeks, which is usually accompanied by symptoms similar to those of flu. The exanthem generally begins on the cheeks and spreads over the entire body within a few days. In the case of ca. 50 % of normal adults, a Parvovirus B19 infection progresses largely asymptomatically. In some cases, symptoms similar to those of flu are observed. However, complications such as arthralgia and arthritis occur frequently (ca. 60 %). Women are affected by these complications twice as often as men. In most cases, these arthropathies disappear within two to four weeks. But in a few cases, the symptoms can continue intermittently for many years. Consequently, in the clarification of chronic arthropathies, a persistent Parvovirus B19 infection must also be considered. The duration of virus multiplication is limited because of the formation of specific antibodies. Therefore, the infection and loss of erythropoietic precursor cells cause no serious effects. However, this can result in a life threatening aplastic crisis in patients suffering from haemolytic anaemias. If infection occurs during pregnancy, Parvovirus B19 can be transplacentally transmitted to the fetus (in approx. 20%). Since the survival time of erythrocytes is short up to the twentieth week of pregnancy and an efficient immune response is lacking, infection can cause severe acute or chronic anaemia and lead to a spontaneous abortion. Another complication after infection during the second trimester is the formation of hydrops fetalis, which untreated usually results in the death of the embryo. In contrast to the rubella virus, the pathogen responsible for infectious erythema causes no embryopathy and an abortion of a pregnancy is therefore not indicated. In immunodeficient persons, a Parvovirus B19 infection can result in chronic anaemia because the virus cannot be completely eliminated. However, this type of anaemia has a much milder course when compared to the aplastic crisis of anaemic patients. Additional organ manifestations such as hepatic dysfunction, respiratory diseases, Parvovirus B19 associated myocarditis etc have been described recently

17 MIKROGEN Instructions for use recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM In individual cases, chronic anaemias and arthropathies are also caused by persistent Parvovirus B19 infections in patients without a known immune defect. 3. Diagnosis A primary infection with Parvovirus B19 is documented by the presence of specific IgM antibodies. IgM titers are generally found about 10 days after infection, at the same time as the appearance of symptoms. IgG titers are found a few days later and, as a rule, persist lifelong. The structural proteins of the virus can be used for antibody detection. Recently, the non-structural protein NS-1 has also been described as a serological marker in chronic courses of the disease. However, it should be taken into account that in about % of all sera, antibodies against this protein are found after infection. In patients suspected of having a persistent infection (chronic anaemia, chronic arthropathies, immunodeficiency, diagnosis of exclusion), virus detection by means of PCR should always be carried out as well. recomline Parvovirus B19 IgG [avidity], IgM This line immunoassay uses Parvovirus B19 antigens made with the help of genetic engineering. They are produced as nonfusion proteins in E.coli alternatively in eukaryotic cell cultures. Serological interpretation based on division of the structural protein VP1 into two segments, and separate presentation of linear and conformational epitopes, reveals the possible time of infection. Generally speaking, IgG antibodies to linear epitopes on the entire structural protein are produced at the onset of the immune response subsequent to primary infection; that is to say a patient sample with this immune status recognises both the N-and C-terminal regions (VP-N and VP-C, as well as VP-2r and VP- 1S). In the course of a period of approx. 6-9 months, the VP-C-specific antibodies directed against linear epitopes are replaced by antibodies that show a preference for recognition of conformational epitopes. These epitopes are presented by the protein VP-2p. The corresponding IgG antibodies normally show lifelong persistence. With increasing duration of the primary infection, the disappearance of the reaction to VP-C (usually after 6 months) and VP-2r (usually after a few years), becomes visible on the strips, whereas the IgG antibodies to VP-N (and partly antibodies to VP-1S as well) remain detectable for many years; antibodies to VP-2p show lifelong persistence in most cases. In addition, the non-structural protein NS-1 of Parvovirus B19 is also present on the test strip. According to the literature and our own evaluations, IgG antibodies against NS-1 are to be found in patients with Parvovirus B19 induced arthritis and other chronic forms of the disease, but not in patients suffering from acute infections. As a result of the infection titer in the population, a diagnosis can never be made solely on the basis of anti-ns-1, but must always be supported by a positive PCR result. If a persistent Parvovirus B19 infection is suspected, the presence of a NS-1 titer can only be regarded as an indication. Figure 1: Parvovirus B19 genes; usage of recombinant antigens in recomline Parvovirus B19 IgG, IgM Localisation and arrangement of Parvovirus B19 proteins 5 3 NS-1 VP1 VP2 recombinant antigens use in recomline Parvovirus B19 NS-1 VP-N VP-1S VP-C VP-2p; VP-2r

18 recomline Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM Instructions for use MIKROGEN Table 1: Description and diagnostic significance of used recombinant antigens rec. antigen VP2 (VP-2p, VP-2r) VP-N VP-C VP-1S NS-1 Description and diagnostic significance main capsid antigen; IgG antibodies to the conformation epitopes (VP-2p) normally show lifelong detectability, those to the linear epitopes (VP-2r) are detectable for months to a few years. Both antigens show good reactivity in the early phase of the infection. N-terminal fragment of the capsid antigen VP1; IgG antibodies often detectable for years. Taken into account in avidity testing. C-terminal fragment of capsid antigens VP1 resp. VP2; the reactivity (IgG and IgM) of the linear epitopes appears early in the course of a Parvovirus B19 infection, then disappears soon after (IgG: usually after about 6 months, IgM: usually after about 12 weeks at the latest). N-terminal, specific fragment of the capsid antigen VP1 (the fragment in which VP-1 and VP-2 differ), IgG antibodies remain detectable long after an infection. Taken into account in avidity testing. Non-structural protein 1, appears in IgG at the earliest 6-8 weeks after infection in at least 20% of ill persons, may be indicative of virus persistence. The IgG reactivity pattern must always be taken into account in the interpretation of a positive or borderline IgM result. In a fresh or recent infection, a pronounced VP-C-IgG titer should also be detectable as a rule. The Parvovirus B19 diagnostic process can be advanced by determining the avidity of the IgG antibodies. The IgG antibodies undergo a maturation process whereby early-phase antibodies show a low avidity level and post-infection antibodies show a high level of avidity. Low-avidity antibodies can be washed off the strip binding location with an avidity reagent, whereas high-avidity antibodies are not removed by the same reagent. Parallel processing of two IgG charges, one of which must be treated with the avidity reagent, can determine whether the IgG antibodies are low-avidity (acute process) or high-avidity (infection has run its course). MIKROGEN can supply the avidity reagent for the avidity test. Immunodominant recombinant antigens from VP1 and VP2 Separate detection of IgG and IgM antibodies possible Safe evaluation due to strip specific controls (cut off and conjugate control) Well-defined and highly purified recombinant antigens, therefore high specificity. Easy and clear interpretation due to easy to read bands High sensitivity because of quantitative optimised antigens Easy and reliable determination of avidity possible 4. Test Principle The recombinant, highly purified proteins are applied to a nitrocellulose membrane. This matrix is then cut into strips. To facilitate detection of Parvovirus B19-specific antibodies, the strips are incubated with the diluted serum or plasma sample, whereby the antibodies bind to the antigens on the strips. Unbound antibodies are then flushed away and the strips are incubated in a second step with anti-human IgG and IgM coupled with horse radish peroxidase. Specifically bound antibodies are detected by means of a colour reaction catalysed by the peroxidase. If an antigen-antibody reaction has taken place, a dark band appears at the corresponding locus on the strip