Aus der Klinik und Poliklinik für Gynäkologie des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf. Direktor: Prof. Dr. med. Fritz Jänicke

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1 Aus der Klinik und Poliklinik für Gynäkologie des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf Direktor: Prof. Dr. med. Fritz Jänicke Bedeutung der Proteolysefaktoren Urokinase Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivator Inhibitor Typ 1 für das rezidivfreie Intervall sowie das Gesamtüberleben von mit nodalnegativem Mammakarzinom Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Zahnmedizin der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von Christopher Leib aus Hamburg 2006

2 Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg Prüfungsausschuss der/die Vorsitzende: Prof. Dr. F. Jänicke Prüfungsausschuss: 2. Gutachter/in: Prof. Dr. B. Brandt Prüfungsausschuss: 3. Gutachter/in: Prof. Dr. I. Fiedler

3 Inhaltsverzeichnis: 1. Einleitung 1.1. Das Mammakarzinom Prognose und Therapie des Mammakarzinoms Die Proteolysefaktoren upa / PAI-1 beim nodalnegativen Mammakarzinom Nachweismethoden von upa / PAI Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden 2.1. Material Patientenakten upa / PAI-1 Tumorgewebe ELISA Test- Kits und Gerätschaften Methoden Datenerhebung und Follow-up Bestimmung von upa / PAI Gewebeaufbereitung Proteinbestimmung Bestimmung der Hormonrezeptoren Statistische Auswertung Festlegen der optimalen Cut-Off- Werte für upa / PAI

4 3. Ergebnisse 3.1. Datenüberblick Untersuchungen zu upa Darstellung der upa Konzentrationen im Tumorzytosol der Zusammenhang zwischen upa und etablierten Prognosefaktoren Korrelation von upa zum rezidivfreien und Gesamtüberleben Untersuchungen zu PAI Darstellung der PAI-1 Konzentrationen im Tumorzytosol der Zusammenhang zwischen PAI-1 und etablierten Prognosefaktoren Korrelation von PAI-1 zum rezidivfreien und Gesamtüberleben Zusammengenommene Betrachtung von upa und PAI Diskussion 4.1. Datenerfassung Methodische Probleme Grenzwerte Prognostische Bedeutung von upa und PAI Ausblick Zusammenfassung... 64

5 6. Abkürzungen Literaturverzeichnis Anhang Danksagungen Lebenslauf Erklärung... 82

6 1. Einleitung 1.1. Das Mammakarzinom Als Brustkrebs wird ein krankhaft bedingtes Wachstum des Brustgewebes bezeichnet, woran jede achte Frau im Laufe ihres Lebens erkrankt. In Deutschland sind das jährlich nahezu Frauen, von denen etwa im Alter unter 60 Jahren sind [1]. Brustkrebs stellt damit die häufigste Krebserkrankung bei Frauen dar und ist für 26% aller Krebsneuerkrankungen und 18% aller Krebstodesfälle bei Frauen verantwortlich. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 63,5 Jahren [2]. Risikofaktoren für Brustkrebs sind besonders: - Alter und Geschlecht : Wie bei vielen Krebsarten spielt das Alter eine wichtige Rolle, bei 77% der Neuerkrankten und 84% der Brustkrebs bedingten Todesfälle sind die Frauen im Alter von 50 Jahren und älter. Weniger als 1% entfällt dabei auf Männer [3, 4]. - Erbfaktoren und familiäre Anamnese : Einige Familien scheinen eine genetische Veranlagung für die Entstehung von Brustkrebs zu haben. Dabei wurden zwei Gene entdeckt, die damit in Verbindung stehen : BRCA1 und BRCA2. Die Gene p53 und BARD1 scheinen ebenso eine wichtige Rolle zu spielen. Außerdem wurden durch andere Untersuchungen noch die Gene BRCA3 und Noey2 aufgezeigt. Diese Fakten legen nahe, dass Brustkrebs durch das Wachstum genetisch beschädigter Zellen entsteht [5-8]. - Hormonelle Einflüsse sind insofern wichtig, da sich Hormone positiv auf das Zellwachstum auswirken [4, 9, 10]. 1

7 1. Einleitung - Frühe Menstruation und späte Menopause : Frauen, bei denen die Menstruation bereits sehr früh einsetzt (jünger als 12 Jahre) oder die erst spät in die Menopause eintreten (älter als 55) sind einem erhöhten Brustkrebsrisiko ausgesetzt. Auch Frauen, die niemals Kinder bekommen haben oder erst nach Ihrem 30ten Lebensjahr sind einem erhöhten Krebsrisiko ausgesetzt [11]. - Kontrazeptiva (Anti-Babypille): Anti-Babypillen scheinen das Risiko für Brustkrebs leicht zu erhöhen abhängig vom Alter, Dauer der Anwendung und anderen Faktoren [12]. - Östrogenpräparate : Bei Östrogenpräparaten (vor allem der Hormonersatztherapie), die länger als 5 Jahre eingenommen wurden, hat sich eine Erhöhung des Risikos für Brustkrebs gezeigt, dabei steigt das Risiko mit der Dauer der Anwendung [13-16]. - Körpergewicht : Adipositas wird als Risikofaktor kontrovers diskutiert [17]. - Alkoholabusus : Exzessiver Alkoholgenuss von mehr als 1-2 Getränken pro Tag hat ein erhöhtes Brustkrebsrisiko zur Folge [18]. - Chemikalien : Einige Studien haben gezeigt, das östrogenähnliche Substanzen in Pestiziden und anderen Industrieprodukten ein erhöhtes Brustkrebsrisiko hervorrufen [19, 20]. - Strahlung : Menschen, die im Kindesalter radioaktiver Strahlung ausgesetzt sind, haben ein erhöhtes Risiko an Brustkrebs zu erkranken [21-23]. - Zusätzliche Risikofaktoren : In einigen Studien hat sich gezeigt, das bei bestehenden oder vorhergehenden Krebserkrankungen im Uterus, Ovar oder Dickdarm aber auch bei einer positiven Familienanamnese mit Krebserkrankungen ein erhöhtes Brustkrebsrisiko besteht [4]. 2

8 1. Einleitung Die klinischen Symptome der Brustkrebserkrankung sind z.b. ein tastbarer Knoten in der Brust, der überwiegend schmerzlos ist, sowie ein Knoten im Achselbereich. Die Häufigkeit zeigt bei der Brustkrebsinzidenz in Deutschland, wie in allen anderen Ländern der EU, in den letzten 20 Jahren einen steigenden Trend [1] Prognose und Therapie des Mammakarzinoms a) Prognose Die relative 5-Jahres-Überlebensrate einer an primärem Mammakarzinom erkrankten Frau beträgt heute etwa 73%. Ihr gehen somit durchschnittlich 6 Jahre ihrer ausstehenden Lebenserwartung verloren [1]. Das Ziel klinischer Studien ist es also vorrangig, die Mortalitätsrate zu senken. So können durch Primärtherapien wie Operation, Bestrahlung und Fortbehandlungen etwa 30% der dauerhaft geheilt werden, aber bei 70% treten dennoch ein Lokalrezidiv oder eine distante Metastasierung auf. Die Prognose der mit primärer Erkrankung wird durch klinische, histopathologische und biochemische Faktoren bestimmt. Zu den klinischen Daten zählen das Alter der Patientin bzw. der prä- oder postmenopausale Hormonstatus. Die Tumorausbreitung wird pathohistologisch durch das ptnm- System bestimmt, entsprechend der Richtlinien der UICC ( Union Internationale Contre Le Cancer ). Anhand des postoperativ durch pathohistologische Untersuchung gesicherten ptnm-schemas lassen sich die Größe des Primärtumors (pt), der 3

9 1. Einleitung Befall der regionären Lymphknoten (pn) und eventuelle Fernmetastasierung (pm) einstufen. Dabei wird der Befall der Lymphknoten in vielen Untersuchungen als der bedeutendste prognostische Marker angesehen. 70% der nodalpositiven entwickeln in den ersten zehn Jahren ein Rezidiv, dagegen nur 30% der nodalnegativen [24-27]. Als ergänzende prognostische und prädiktive Faktoren müssen am Tumorgewebe neben Tumorgröße und Lymphknotenstatus ebenfalls bestimmt werden: - der histologische Typ: Das invasiv- duktale Karzinom bildet die größte Gruppe, gefolgt vom invasiv- lobulären und medullären Karzinom. - der Differenzierungsgrad (Grading): Das Tumor- Grading nach Bloom and Richardson erfasst unabhängig vom Geschwulsttyp histologische und zytologische Merkmale und ordnet diese in ein Schema von üblicherweise drei Differenzierungsgraden (Grading I-III). Diese Einteilung beruht auf drei Kriterien: dem Grad der tubulären Differenzierung, der Polymorphie und dem Anteil an Mitosen. - der Östrogen- und der Progesteronrezeptorstatus: Der Nachweis von Steroidhormonrezeptoren wird von einigen Autoren mit einer günstigen Prognose in Zusammenhang gebracht. Diese Rezeptoren sind vor allem aber ein prädiktiver Parameter für das Ansprechen auf eine endokrine Therapie. 4

10 1. Einleitung Das Mammakarzinom metastasiert häufig und früh. Der Verlauf der Erkrankung wird ausschließlich davon bestimmt, ob eine Fernmetastasierung eintritt. Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Fernmetastasen und sogar der Tod am Mammakarzinom kann durch eine adjuvante, postoperative, systemische Therapie um etwa 20% gesenkt werden [28]. b) Therapie Die Therapie des Mammakarzinoms stützt sich momentan auf fünf Säulen. 1) Operation Es wird die brusterhaltende Therapie (BET) von der Entfernung des gesamten Brustdrüsenkörpers (Mastektomie, Ablatio) als Operationsform unterschieden. Obligatorisch ist dabei die Entfernung der Lymphknoten in der Axilla. Hier setzt sich jedoch mehr und mehr die alleinige Entfernung des Wächterlymphknotens (Sentinel-Lymphknoten-Technik) durch. 2) Bestrahlung Die Bestrahlung wird bei der BET obligatorisch angewandt. Bei einer Ablatio wird nur bei erhöhtem lokalen Rezidivrisiko eine zusätzliche Bestrahlung durchgeführt. 3) Chemotherapie Die Durchführung einer postoperativen, adjuvanten Chemotherapie wird heutzutage vorwiegend nach den Kriterien von St. Gallen entschieden. Hierbei wird nach verschiedenen Parametern (siehe Tabelle 1) das Metastasierungsrisiko 5

11 1. Einleitung ermittelt und bei erhöhtem Risiko zur Senkung desselben eine Chemotherapie durchgeführt [29]. Risikokategorie Niedriges Nodalnegativer Befund, sowie Risiko pt 2 cm und Tumorgrading 1 und Abwesenheit von peritumoralen Gefäßeinsprossungen und Her2/neu Gen weder überexpressioniert noch verstärkt und Alter 35 Jahre Erhöhtes Risiko Nodalnegativer Befund, sowie pt > 2 cm oder Tumorgrading 2 oder 3 oder Peritumorale Gefäßeinsprossung oder Her2/neu Gen Überexpression oder Verstärkung oder Alter < 35 Jahre Nodalpositiver Befund (1-3 befallene Knoten), sowie Her2/neu Gen weder überexpressioniert noch verstärkt Hohes Risiko Nodalpositiver Befund (1-3 befallene Knoten), sowie Her2/neu Gen Überexpression oder Verstärkung Nodalpositiver Befund ( 4 befallene Knoten) Tab. 1: Risikoeinschätzung bei nodalnegativen Mammakarzinompatientinnen nach der Konsensabstimmung von St. Gallen 2005 [26, International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer ] Die nodalnegativen ohne weitere Risikofaktoren werden dabei nicht berücksichtigt, obwohl sie ein Rezidivrisiko von 30% haben. Es ist also wichtig, diese zu erkennen und zu therapieren. 6

12 1. Einleitung 4) Hormontherapie Bei positivem Hormonrezeptorstatus werden Antiöstrogene verabreicht, wie z.b. Tamoxifen für maximal 5 Jahre. 5) Antikörpertherapie Der bis dato einzige zugelassene Antikörper bei Her2/neu überexprimierendem Mammakarzinom ist Trastuzumab (Herceptin ) Die Proteolysefaktoren upa / PAI-1 beim nodalnegativen Mammakarzinom Für mit negativem Lymphknotenbefall sind die klinischen Vorteile einer Chemotherapie verhältnismäßig klein, weil eine primäre operative lokoregionäre Behandlung bereits 60% 70% dieser Patienten heilt [30-32]. Dennoch entwickeln ca. 30% der Metastasen. So müsste man also 100 % der nodalnegativen therapieren, das heißt, sie zum Teil unnötigen und belastenden Nebenwirkungen aussetzen, um bei den gefährdeten 30% der einen Überlebensvorteil zu erreichen. Um dennoch eine Belastung von, die nicht einer systemischen adjuvanten Therapie bedürfen, zu vermeiden, sind aussagekräftige, prognostische Faktoren notwendig, die dazu beitragen, jene 30% der zu erkennen, welche ein hohes Risiko einer Rezidiverkrankung haben. Der Gebrauch von traditionellen prognostischen Faktoren, wie zum Beispiel Alter, Menopausenstatus, Tumorgröße, Tumorgrading, und Steroidhormonrezeptorstatus, ist hierzu jedoch nur mangelhaft geeignet. 7

13 1. Einleitung Um eine Verfeinerung der Risikoabschätzung und eine individualisierte Behandlungsmöglichkeit beim nodalnegativen Mammakarzinom ermöglichen zu können, wurde in den letzten Jahren der Untersuchung von neuen prognostischen Faktoren erhebliche Aufmerksamkeit gewidmet. Durch verschiedene Studien ist klar geworden, dass die Fähigkeit von Krebszellen, die extrazelluläre Matrix zu infiltrieren, und in Lymph- und Blutgefäße einzuwachsen, sowie Metastasen an entfernten Stellen zu bilden, von der koordinierten Wechselwirkung von zwei Hauptproteasesystemen abhängig ist, dem Matrix-Metalloproteinasen- System und dem Plasminogen- Aktivator- System. Hierbei kristallisieren sich vor allem die Serinprotease Urokinase Plasminogen Aktivator (upa) und ihr Inhibitor, Plasminogen Aktivator Inhibitor Typ 1 (PAI-1) als viel versprechende neue Faktoren heraus. Diese Bauteile spielen eine zentrale Rolle in den Abläufen, die letzten Endes zur Entwicklung von Metastasen führen. Sie spielen in der proteolytischen Kaskade, die bei dem physiologischen und pathophysiologischen Auf- und Umbau der extrazellulären Matrix involviert ist, eine tragende Rolle. Ist upa an seinen zellulären Rezeptor upa-r gebunden, verwandelt es das Plasminogen in das Serin- Protease- Plasmin. Dabei wird die Aktivität des upa durch die Serin Protease Inhibitoren PAI-1 und PAI-2 kontrolliert. Das Plasmin löst zahlreiche Komponenten der Gewebeverbindungen auf und bei Malignität auch das Stroma, das die Krebszellnester umschließt. Bindet PAI-1 an den upa/upa-r Komplex kommt es mithilfe transmembranärer Rezeptoren der LDL-Familie zur Aufnahme dieses Tertiärkomplexes in die Zelle. Hier wird der upa/upa-r Komplex kaskadenartig abgebaut und der upa- Rezeptor wieder an der Membranoberfläche replatziert. Damit wird die proteolytische Aktivität der Zelloberfläche und damit die perizelluläre Proteolyse wiederhergestellt [33]. 8

14 1. Einleitung Neben der proteolytischen Aktivität bewirkt das upa- System in Zusammenarbeit mit anderen Proteinen auch einige wichtige andere biologische Effekte. Wie zum Beispiel die Chemotaxis, Invasion, Proliferation und auch die Angiogenese. Die Produktion und der Zusammenbau von perizellulärem und zellulärem upa, upa-r und PAI-1 sind somit die Vorraussetzung für eine effiziente Proteolyse, Angiogenese, Zelladhäsion und Migration und damit für die Tumorzellinsvasion und Metastasierung [34-38]. Bei einer Metastasierung wird durch die Einwirkung des rezeptorgebundenen Plasminogenaktivators (upa) Plasmin aus dem enzymatisch inaktiven Plasminogen in der Umgebung der Tumorzellen gebildet, wobei Inhibitoren (z.b. PAI-1) die Aktivität des upas an den invasiven Tumorgrenzen kontrollieren. An der Tumorperipherie entstandenes Plasmin aktiviert so die Kollagenase und durch die enzymatische Einwirkung dieser beiden Faktoren wird die extrazelluläre Matrix und die Basalmembran durchbrochen. Auf diese Weise können die Tumorzellen die Gefäße erreichen. Hier schützen sie sich nach ihrer Intravasation durch koagulative Mechanismen vor der Immunreaktion im Kreislauf und organisieren sich in den Kapillaren und den Lymphknoten. Ebenfalls durch Proteolyse treten die Tumorzellen aus den Gefäßen wieder aus und dringen in die Metastasierungsstellen ein. Diese Sekundärtumore (Metastasen) veranlassen wiederum unter Einwirkung von upa und PAI-1 die Angioneogenese. Im Tumorzytosol ist eine quantitative Bestimmung von upa und PAI-1 anhand des Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Verfahrens möglich. Es 9

15 1. Einleitung zeigte sich, dass in malignen Tumoren (wie z.b. Brustkrebs) die upa und PAI-1 Konzentrationen deutlich höher liegen als in normalem Gewebe [39-41]. Dabei sind hohe Konzentrationen, sowohl von upa, als auch PAI-1 mit einer schlechten Prognose für Brustkrebspatientinnen verbunden [42, 43]. So haben sich neben einem jugendlichen Alter (<35 Jahre), einem negativen Hormonrezeptorstatus und einem undifferenzierten Tumorgrad (Grading 3), erhöhte upa und PAI-1 Werte als Prognoseparameter für ein kurzes rezidivfreies Überleben (disease-free survival), sowie ein kurzes Gesamtüberleben (overall survival) herauskristallisiert [34, 43-47] Nachweismethoden von upa / PAI-1 Die Bestimmung von upa und PAI-1 erfolgt mittels eines kommerziell erhältlichem, standardisierten und qualitätskontrollierten ELISA im Tumorgewebeextrakt, d.h. an frischem oder unmittelbar nach der Operation in Stickstoff oder bei -80 C tiefgefrorenem Tumorgewebe. Eine repräsentative Gewebemenge, die mengenmäßig etwa einer Stanzbiopsie (ca. 25 mg) oder einem 90 µm Kryoschnitt entspricht, ist für die ELISA- Messung technisch ausreichend. Klinisch relevante Daten durch immunhistochemische Bestimmung von upa/pai-1, liegen derzeit nicht vor. Ein Grund hierfür ist sicherlich die heterogene Expression von upa und PAI-1 auf Tumor- und Stromazellen. Dieses heterogene Expressionsmuster wird durch die biochemische ELISA- Bestimmungsmethode standardisierbar und reproduzierbar quantifiziert. Die immunhistochemische Bestimmung an Paraffinmaterial ist nicht standardisiert, da die heterogene Anfärbung im Gewebe nicht reproduzierbar beurteilt werden kann. Neue molekularbiologische Bestimmungsmethoden 10

16 1. Einleitung werden derzeit evaluiert. Eine Ableitung klinischer Konsequenzen aus immunhistochemischen oder molekularbiologischen upa, bzw. PAI-1 Bestimmungen ist nicht evidenzbasiert und daher nicht zulässig Zielsetzung der Arbeit In verschiedenen Studien wurden upa und PAI-1 bereits als neue Prognosefaktoren für maligne Tumoren beschrieben. In dieser Arbeit soll ihre Aussagekraft in Bezug auf das rezidivfreie Überleben, sowie das Gesamtüberleben bei mit primärem nodalnegativem Mammakarzinom überprüft werden. Außerdem wird ihre Korrelation mit etablierten Prognosefaktoren, sowie adjuvanter Hormon- und Chemotherapie untersucht. 11

17 2. Material und Methoden 2.1. Material Patientenakten Von 243, die im Zeitraum zwischen März 1991 und Juni 1999 an einem primären Brustkrebstumor in der Frauenklinik des UKE operiert worden sind, wurden die Akten ermittelt und zur Auswertung aus dem Archiv angefordert. Das Alter der zum Zeitpunkt der Operation lag zwischen 28 und 88 Jahren. Der Altersdurchschnitt lag mit 57 Jahren nur wenig über dem Median von 56 Jahren. In der Abbildung ist die Altersverteilung des gesamten Kollektivs dargestellt (vgl. Diagramm 1) Anzahl Alter der [Jahre] Diagramm 1: Altersverteilung der im Kollektiv 12

18 2. Material und Methoden upa / PAI-1 Tumorgewebe Das Tumorgewebe stammte von 243, welche im Zeitraum von Januar 1997 bis Oktober 2001 in der Universitätsfrauenklinik Hamburg wegen eines primären Mammakarzinoms operiert wurden. Bei allen Geweben erfolgte die Probenaufarbeitung nach gleichen Kriterien, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Die mit Brustkrebs wurden entweder brusterhaltend (n=163) oder durch modifizierte radikale Mastektomie (n=80) operiert. In jedem Fall erfolgte die axilläre Lymphonodektomie, wobei im Median 16 (0-30) Lymphknoten entnommen wurden. Bei allen 243 in die Untersuchung eingeschlossenen Fällen waren die axillären Lymphknoten tumorfrei. In keinem Fall kam es innerhalb der ersten 12 Monate zu einem axillären Tumorrezidiv. Alle Primärdaten beziehen sich auf den Zeitpunkt der Operation ELISA Test- Kits und Gerätschaften Die upa / PAI-1 ELISA Kits stammten von der Firma american diagnostica GmbH in Pfungstadt, Deutschland (Femtelle upa/pai-1 Test REF 899, american diagnostica inc. Starnford, Connecticut USA). Die Reagenzien zur Proteinbestimmung stammten von der Firma Biorad. Die übrigen Reagenzien und Lösungsmittel wurden von der Firma Merck in Darmstadt bezogen. 13

19 2. Material und Methoden 2.2. Methoden Datenerhebung und Follow-up A) Aktenauswertung Die Auswertung setzte sich wie folgt zusammen : -Name der Patientin -Anschrift und Telefonnummer -Geburtsdatum -Operationsdatum -Operationsart -Lymphknotenbefall -Tumorgröße -Grading -Nummer des histologischen Berichtes -falls vorhanden die upa / PAI-1 Konzentrationen -und die Anschrift des weiterbehandelnden niedergelassenen Arztes Diese Angaben wurden zur weiteren Bearbeitung aufgenommen und in tabellarischer Form festgehalten. Dabei wurden ausschließlich Akten von mit negativem Lymphknotenbefall untersucht, und ebenfalls keine Akten männlicher Patienten berücksichtigt. B) Arztanschreiben / Befragung Die jeweiligen angegebenen Ärzte wurden mit einem Brief kontaktiert, in dem sie eine allgemeine Erklärung des Anliegens, sowie einen Fragebogen mit dem Namen der jeweiligen Patientin erhielten. Auf diesem Fragebogen wurde nach 14

20 2. Material und Methoden dem letzten Kontakt zur Patientin, aufgetretenen Metastasierungen, neuen Operationen in Bezug zur Primärerkrankung, sowie veränderten postoperativen Medikationen oder Behandlungsweisen gefragt. Der Fragebogen selbst konnte dann an eine spezielle Faxnummer zurückgesendet werden und konnte so in die Auswertung des Follow-Ups für die jeweilige Patientin mit einbezogen werden. Es wurden 200 Patienten-Fragebögen an ca. 120 Ärzte versandt, von denen jedoch nur ca. 70 % ausgefüllt in die Auswertung miteinbezogen werden konnten. Der restliche Anteil war durch nur einmaligen oder zu weit zurückliegenden Kontakt des Arztes mit der Patientin nicht auswertbar. C) Patientenanschreiben Durch die aus den Akten ermittelten Anschriften der zum Zeitpunkt der Operation, konnte an diejenigen, über die noch nicht ausreichende Informationen zum Follow-Up vorlagen, ein direktes Anschreiben gerichtet werden. Dabei war der Brief wieder in einen allgemeinen erklärenden Abschnitt und in einen Fragebogen unterteilt. Auf dem die ihren letzten Besuch beim Frauenarzt, sowie die Anschrift ihres jetzigen Frauenarztes und eventuell neu aufgetretene Ereignisse in Bezug auf ihre Primärerkrankung (wie Metastasierungen, neue Operationen, neue Medikationen, oder neue Behandlungsstrategien) angeben sollten. Die Rücksendung des Fragebogens wurde mittels eines beigefügten frankierten Rückumschlags ermöglicht, wobei die Erfolgsrate dieser Methode ebenfalls bei ca. 70% lag, da einige unter der damaligen angegebenen Adresse nicht mehr zu erreichen waren. 15

21 2. Material und Methoden D) Patienten- Hinterbliebenenbefragung Als letzte Möglichkeit zur Erstellung des Follow-Ups für die wurden die in den Akten angegebenen, bzw. durch Nutzung anderer Informationsquellen, wie Internet, erhaltenen Telefonnummern angerufen. Um die Patienten direkt über ihr derzeitiges Befinden und ihren jetzigen Frauenarzt, neu aufgetretene Erkrankungen in Verbindung mit ihrer Primärerkrankung oder neue Medikationen bzw. Behandlungsstrategien zu befragen. Konnten nur die Hinterbliebenen erreicht werden, wurde sich auf das Eintreten des Todes mit Zeitpunkt und Ursache beschränkt. Es konnte jedoch auch hier nicht bei allen Patienten ein erfolgreiches Follow-Up erstellt werden, da sich Telefonnummern als nicht mehr gültig erwiesen oder Hinterbliebene keine Aussagen zu machen wünschten. Die Responserate aller Formen der Befragung stellt in tabellarisch übersichtlicher Form noch einmal die Tabelle 2 dar. Anzahl Erfolgsrate Ausgewählte Akten % Arztanschreiben % Follow-Up Patientenanschreiben ,2 % Telefonbefragung 10 4 % Insgesamt ,2 % Fehlend 7 2,8 % Tab. 2: Überblick über die Rücklaufquoten der angewandten Follow-Up Methoden 16

22 2. Material und Methoden Bestimmung von upa / PAI-1 Prinzip der Messung Der American Diagnostica Femtelle Test basiert auf einem hoch spezifischen monoklonalen Maus Fängerantikörper, der entweder gegen humanes upa oder humanes PAI-1 gerichtet ist. Er erkennt dabei verschiedene Formen von upa, wie hochmolekulares (HMW) upa, upa komplexiert mit PAI-1 oder PAI-2, sowie latente und aktive Formen von PAI-1. Für die Messung wurden die Tumorgewebeextrakte mit bekannter Gesamtproteinkonzentration über Nacht in den mit upa oder PAI-1 Fängerantikörper beschichteten Vertiefungen der Mikrotiterstreifen inkubiert. Nach dem Waschen wurde nun ein biotinylierter Detektionsantikörper, der entweder gegen humanes upa oder humanes PAI-1 gerichtet ist, zugesetzt. Dieser wurde wiederum nach kurzer Inkubationszeit durch ein Streptavidin- Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugat nachgewiesen. Danach gab man als Substrat 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin Perborat (TMB) hinzu, welches durch die HRP umgesetzt wurde und so zu einer Blaufärbung führte. Durch Zugabe von Schwefelsäure wurde die Reaktion gestoppt und die Färbung schlug von blau nach gelb um. Nun konnten die upa und PAI-1 Konzentrationen durch Messung der optischen Dichte bei 450 nm anhand der miterstellten Standardkurve abgelesen werden. 17

23 2. Material und Methoden Material und Lösungen - anti-human upa IgG und anti-human PAI-1 IgG beschichtete Mikrotiterplatten - upa/pai-1 Standards mit in ng/ml kalibriertem hochreinem upa/pai-1 - Detektionsantikörper: biotinyliertes anti-human upa (lyophilisiert), biotinyliertes anti-human PAI-1 (lyophilisiert) - upa Enzym Konjugat, Streptavidin-HRP (60 µl) - PAI-1 Enzym Konjugat, Streptavidin-HRP (60 µl) - Enzymkonjugat Verdünner (lyophilisiert) - PBS Puffer (PBS), ph % Triton X-100 (12 ml) Detergenz - Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), ph 8.5 (lyophilisiert) - Peroxidase Substrat (TMB) (11 ml) - 0,22µm gefiltertes deionisiertes H2O (1 l) N H2SO4 - Pipetten: 2-20 µl, µl und µl mit auswechselbaren Pipettenspitzen - Präzisions-Multipipetten - Reagenzgläser zur Probenverarbeitung - Photometer für Mikrotiterplatten mit einer Wellenlänge von 450 nm - Kryogefäße 1 ml - Flüssiger Stickstoff - Mikro-Dismembrator - Ultrazentrifuge mit Rotor - Schüttler für Reaktionsgefäße und Mikrotiterplatten 18

24 2. Material und Methoden Vorbereitung der Reagenzien des Assays Zur Vorbereitung der upa und PAI-1 Standards wird je 1 ml gefiltertes deionisiertes Wasser in die 0.10, 0.25, 0.50, 0.75 und 1.0 ng/ml upa Standard Fläschchen gegeben,sowie 2 ml gefiltertes deionisiertes Wasser in die 0.0 ng/ml upa Standard Fläschchen. Ebenso verfährt man bei den 1.0, 2.5, 5.0 und 10 ng/ml PAI-1 Standard Fläschchen. Alle Standards werden dann vorsichtig für 3 Minuten gemischt. Die upa und PAI-1 Detektionsantikörper Fläschchen werden mit 5.5 ml gefiltertem deionisierten Wasser aufgefüllt und ebenfalls 3 Minuten gemischt. Zu dem Enzymkonjugat Verdünner wird 20 ml des gefilterten deionisierten Wasssers hinzugegeben und gut durchgemischt. Der Waschpuffer wird durch Lösen einer Packung PBS in 900 ml gefiltertem deionisierten Wassers unter Zugabe von 4 ml des 25% Triton X-100 Detergenz und anschließendem Auffüllen mit weiterem gefilterten deionisierten Wasser auf 1 Liter erstellt. Für die Vorbereitung des Proben Puffers wird BSA zum Waschpuffer in einer Endkonzentration von 1% w/v zugegeben. Um das 10%ige Triton X-100 für die Gewebeextraktion zu erhalten werden 4 ml des 25%igen Triton X-100 mit 6 ml gefiltertem deionisierten Wasser gemischt. Zur Vorbereitung der Tris gepufferten Salzlösung (TBS) mit ph 8.5 wird eine Packung TBS in 900 ml gefiltertem deionisierten Wasser gelöst und nach Auffüllung zu 1 Liter mit weiterem gefilterten deionisierten Wasser gut durchmischt. 19

25 2. Material und Methoden Durchführung Die upa/pai-1 ELISA Testdurchführung mit Femtelle gliedert sich in zwei Tage. Am ersten Tag werden die Mikrotiterstreifen in benötigter Menge in den Halter eingelegt und mit je 100 µl der rekonstituierten upa bzw. PAI-1 Standards, Kontrollen und verdünnten Gewebeextrakt Proben in den mit upa bzw. PAI-1 Antikörpern beschichteten Vertiefungen versehen. Dabei werden immer Doppelbestimmungen durchgeführt die sich in folgendem Schema wiedergeben. 1 2 A S1 S1 B S2 S2 C S3 S3 D S4 S4 E S5 S5 F S6 S6 G P1 P1 H K1 K1 Tab. 3: Schema zur empfohlenen Verteilung der Proben (S= Standard; P= gewebeextrakt Probe; K= Kontrolle) Nach dem Beschichten werden die Mikrotiterstreifen abgedeckt und bei +4 C in feuchter Kammer inkubiert. Am zweiten Tag wird der Inhalt aus den Mikrotiterstreifen verworfen und je 4x mit Waschpuffer gewaschen. Es werden je 100 µl Detektionsantikörper in die upa bzw. PAI-1 beschichteten Vertiefungen gegeben und wiederum nach Abdeckung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Verwerfen des Inhaltes und viermaligem Waschen mit Waschpuffer werden 2 µl des upa bzw. PAI-1 Enzymkonjugates in 2 ml des upa bzw. PAI-1 Enzymkonjugat Verdünners gegeben (pro Mikrotiterstreifen) und je 100 µl des verdünnten Enzymkonjugates in die entsprechenden 20

26 2. Material und Methoden Vertiefungen pipettiert. Nach erneutem Abdecken und Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur werden die Inhalte verworfen und vier mal mit Waschpuffer gewaschen. Nun wird 100 µl TMB Substratlösung in die Vertiefungen gegeben und unter Abdeckung bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Es kommt zu einer Reaktion mit blauer Farbentwicklung, die durch Zugabe von je 50 µl 0.5 N H2SO4 gestoppt wird und zu einem gelben Farbumschlag führt. Jetzt wird innerhalb von 30 Minuten die Messung der Extinktionswerte der Mikrotiterstreifen bei 450 nm in einem ELISA-Reader (Titertek Multiskan MK II von Labsystems, Finnland) vorgenommen und eingetragen. Zusammenfassung des Verfahrens Arbeitsschritte Inkubation 1. Zugabe der Standards, Kontrollen und Proben in die min. 20 Std. bei 4 C Mikrotiterstreifen 2. 4x Waschen 1 Std. bei RT 3. Zugabe des Detektionsantikörpers in die Vertiefungen 4. 4x Waschen 1 Std. bei RT 5. Zugabe des Konjugates in die Vertiefungen 6. 4x Waschen 20 Min. bei RT 7. Zugabe von Substratlösung in die Vertiefungen 8. Zugabe der Stopplösung in die Vertiefungen 9. Lesen der Platte bei 450 nm RT=Raumtemperatur C Tab. 4: Zusammenfassende Darstellung aller Arbeitsschritte 21

27 2. Material und Methoden Auswertung Bezugspunkt für die Messwerte der proben ist eine Kurve, die anhand der Koordination der Standardmesswerte erstellt wird. Hierbei wurden die jeweils gemessenen Mittelwerte der sechs Einzel-Extinktionen (E=450nm) auf der Y-Achse gegen die entsprechenden sechs Konzentrationen mit genau definiertem upa/pai-1 Gehalt (ng/ml) auf der x-achse aufgetragen. Es ergab sich eine annähernd lineare Standardkurve. Über die gemittelte Extinktion der Kontrollen und Proben ist es möglich, die Konzentrationen derselbigen direkt durch Computerberechnung (Programm Magellan von Tecan, Deutschland) abzuleiten. Anschließend wurde überprüft, ob die bestimmten Werte für die Kontrollen im angegebenen Referenzbereich lagen. Bei Abweichen der doppelt gemessenen Werte voneinander um mehr als 10 Prozent musste dieser Wert im nächsten Versuch neu ermittelt werden. Falls die Konzentration der gemessenen Probe über dem Referenzbereich lag, musste die Probe in weiteren Verdünnungsschritten bestimmt werden. Als weitere Verdünnungsschritte wurden gewählt: 1:100 / 1:200 / 1:400 / 1:800 / 1:1600 Die gemessenen Konzentrationen mussten dann jeweils mit dem entsprechenden Faktor multipliziert werden : 2 / 4 / 8 / 16 / Gewebeaufbereitung Das Gewebe wurde unmittelbar nach der operativen Entnahme in das pathologische Labor gebracht, wo die Schnellschnittbegutachtung erfolgte. Das für die Untersuchung benötigte Gewebe wurde vom Pathologen aus dem Tumor 22

28 2. Material und Methoden herauspräpariert, von umgebendem Fettgewebe befreit und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Tumoraufbereitung wurden mg des eingefrorenen Gewebes abgewogen und in einem Mikrodismembrator mittels einer Wolframkugel im vorgekühlten Teflon- Gefäß 30 Sekunden bei 2000 U dismembriert. Das pulverisierte Gewebe wurde anschließend in 1.8 ml 1:10 verdünntem TBS- Puffer und 0.2 ml 10%igem Triton X-100 resuspendiert, um eine 1%ige Triton- X Lösung zu erhalten. Anschließend wurde diese Lösung über Nacht in einem Schüttler bewegt. Die Abtrennung der Kernbestandteile erfolgte in einer Ultrazentrifuge für 1 Stunde bei Umdrehungen und 4 C. Das im Überstand enthaltene Tumorzytosol wurde danach durch eine Gaze filtriert, aliquotiert und bis zur weiteren Verarbeitung in flüssigem Stickstoff eingefroren Proteinbestimmung Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Bio-Rad-Methode. Die Zytosole wurden hierzu 1:20 mit BCA-Puffer [49,5ml TBS-Puffer und 0,5ml 10% Triton X-100] vorverdünnt und anschließend wurden 50µl in Mikrotiterplatten pipettiert und mit je 200µl Farbreagenz von Pierce über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei musste beachtet werden, das Triton X-100 andere Proteinbestimmungs-Tests stört und nur der BCA Protein Assay von Pierce zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben empfohlen wird. Die Messung und Auswertung erfolgte im ELISA-Reader bei 540nm mit dem Computerprogramm Magellan der Firma Tecan. 23

29 2. Material und Methoden Bestimmung der Hormonrezeptoren Die Bestimmung des Steroidhormonrezeptor-Status erfolgte durch Auswertung der Akten der Statistische Auswertung Die statistische Auswertung aller gesammelten Daten erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS für Windows im Release der Firma SPSS Inc., in Zusammenarbeit mit LEADTOOLS , der Firma LEAD Technologies, Inc. Mit Hilfe dieses Programms konnte der Zusammenhang zwischen upa, bzw. PAI-1 mit anderen Prognosefaktoren anhand des Chi- Quadrat- Testes ermittelt werden Festlegung der optimalen Cut-Off- Werte Um die prognostische Bedeutung von upa und PAI-1 untersuchen zu können, bedarf es eines sinnvollen Cut-Off- Wertes, welcher es ermöglicht, zwischen einer Gruppe von mit erhöhten Werten und einer Gruppe mit niedrigen Werten zu unterscheiden. Die Gruppe von, welche einen erhöhten Gehalt an upa und/oder PAI-1 im Tumorzytosol aufweisen und dadurch eine signifikant geringere Heilungswahrscheinlichkeit, bzw. ein erhöhtes Metastasierungsrisiko und ein verkürztes Gesamtüberleben, sowie einen signifikant größeren Nutzen von einer adjuvanten Chemotherapie hätten; 24

30 2. Material und Methoden stehen dabei den mit niedrigem Gehalt an upa/pai-1 gegenüber, welche nach 5 Jahren eine 96%ige Überlebenswahrscheinlichkeit haben. Während mit hohem upa/pai-1 Gehalt nur zu etwa 88% die ersten 5 Jahre überleben. Dabei hat sich in einer großen multizentrisch prospektiv randomisierten Therapiestudie Chemo-N0 gezeigt, dass zur Unterscheidung zwischen guter und schlechter Prognose der Cut-Off- Wert für upa mit 3 ng/µg Protein im Tumozytosol festzulegen wäre und der Cut-Off-Wert für PAI-1 bei 14 ng/µg Protein im Tumorzytosol anzusetzen ist [31, 32, 48]. 25

31 3. Ergebnisse 3.1. Datenüberblick Von den ursprünglich ausgewählten 250 konnten nur 243 in die Untersuchungen mit einbezogen werden, da zu 7 trotz intensiver Recherche kein Follow-Up erstellt werden konnte. In 143 Fällen wurde eine adjuvante Hormontherapie und in 54 Fällen eine adjuvante Chemotherapie, teilweise auch eine doppelte Therapie veranlasst. 60 erhielten keine adjuvante Therapie. Die mediane Nachbeobachtungszeit beträgt 86 Monate. Von den 243 in die Untersuchung eingeschlossenen erlitten 50 ein Rezidiv. Es verstarben insgesamt 43. Den Datenüberblick der aufgenommenen Daten zu den 243 in die Untersuchung einbezogenen und ihre entsprechenden Werte gibt Tabelle 5 noch einmal zusammenfassend wieder. Alter Operationsart Tumorgröße Prozentualer Anzahl Anteil (jew. am Gesamtkollektiv) 50 Jahre 70 28,8 % > 50 Jahre ,2 % Ablatio 80 32,9 % BET ,1 % < 2 cm 82 33,7 % 2-5 cm ,0 % > 5 cm 6 2,5 % 26

32 3. Ergebnisse Grading Östrogenrezeptorstatus Progesteronrezeptorstatus Adj. Hormontherapie Adj. Chemotherapie Rezidivstatus Vitalstatus Mit Befall der Haut, bzw. Muskulatur 2 0,8 % Nicht bestimmt 8 3,2 % G I (Gut differenziert) 48 19,8 % G II (Mittel differenziert) ,6 % G III (Undifferenziert) 81 33,3 % Positiv ,8 % Negativ 54 22,2 % Positiv ,6 % Negativ 52 21,4 % Keine ,2 % Tamoxifen ,0 % Zoladex 7 2,9 % Keine ,8 % CMF 49 20,2 % 4xEC 4 1,6 % FEC/FAC 1 0,4 % Kein Rezidiv ,4 % Rezidiv 50 20,6 % Lebend ,3 % Verstorben 43 17,7 % Insgesamt % Tab. 5: Gesamtübersicht der erfassten Follow-Up Daten 27

33 3. Ergebnisse 3.2. Untersuchungen zu upa Darstellung der upa- Konzentrationen im Tumorzytosol der Die upa- Konzentrationen in dem untersuchten Kollektiv (n=243) lagen zwischen 0,03 und 22,90 ng/µg Protein. Mit dem festgelegten Cut-Off Wert von 3 ng/µg Protein für upa ergab sich ein Median von 1,48 ng/µg Protein für die mit upa- Werten unter dem Cut-Off und ein Median von 4, 98 ng/µg Protein in der Gruppe von mit upa- Werten über dem Cut- Off (Diagramm 1). 15 UPA im Tumorzytosol [ng/µg Protein] N = 147 Niedrigrisikogruppe 96 Hochrisikogruppe Diagramm 1: Box-Plot Darstellung der Konzentrationen von upa der im Kollektiv 28

34 3. Ergebnisse Zusammenhang zwischen upa und etablierten Prognosefaktoren A) Korrelation von upa und der Tumorgröße Bei dem Vergleich zwischen den upa Konzentrationen im Tumorzytosol und der Tumorgröße der ergibt sich in diesem Kollektiv kein Hinweis auf eine signifikante Beziehung (p=0,2) (Tabelle 6). Anzahl mit upa > 3 ng/µg (Prozent) mit upa 3 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Tumorgröße Stadium pt (32,9%) 55 (67,1%) Stadium pt (42,9%) 92 (57,1%) p=0,2 Gesamt (39,5%) 147 (60,5%) Tab. 6: Kreuztabelle zwischen Tumorgröße und gruppen von upa 29

35 3. Ergebnisse B) Korrelation von upa mit dem Tumorgrading Es konnte in diesem Kollektiv ebenfalls keine signifikante Korrelation zwischen den upa-tumorzytosolkonzentrationen und dem Tumor Grading gezeigt werden. So gibt es eine annähernd gleiche Verteilung der mit Tumor Grading 3 in beiden Gruppen und für ein Tumor Grading 1 und 2 zeigt sich ein leicht erhöhter Anteil bei den mit niedrigen upa- Werten (vgl. Tabelle 7). Anzahl mit upa > 3 ng/µg (Prozent) mit upa 3 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Grading nicht bestimmt 8 4 (50%) 4 (50%) Tumor Grad (35,7%) 99 (64,3%) Tumor Grad (48,1%) 42 (51,9%) p=0,27 Gesamt (39,5%) 147 (60,5%) Tab. 7: Kreuztabelle zwischen Tumor- Grading und gruppen von upa 30

36 3. Ergebnisse C) Korrelation von upa und dem Patientenalter Die Tabelle 8 zeigt, dass es in diesem Kollektiv keine signifikanten Korrelationen zwischen dem Patientenalter und der Konzentration von upa im Tumorzytosol gibt. In beiden Altersgruppen weisen 40% der erhöhte upa- Werte auf.. Anzahl mit upa mit upa Signifikanz > 3 ng/µg 3 ng/µg nach Fischer (Prozent) (Prozent) Alter unter 50 Jahre (40%) 42 (60%) ab 50 Jahre (39,3%) 105 (60,7%) p=0,52 Gesamt (39,5%) 147 (60,5%) Tab. 8: Kreuztabelle zwischen Alter der und gruppen von upa 31

37 3. Ergebnisse D) Korrelationen zwischen upa und dem Hormonrezeptorstatus Der Hormonrezeptorstatus wurde im Kollektiv jeweils in Progesteron- und Östrogenrezeptorstatus unterschieden. Tabelle 9 gibt die nicht signifikanten Korrelationen zwischen upa- Konzentration im Tumorzytosol und dem Progesteronrezeptorstatus des Kollektivs wieder, wobei ein Großteil der einen positiven Rezeptorstatus hat und zur Gruppe der mit niedrigen upa-werten gehört. In Tabelle 10 ergibt sich die nicht signifikante Korrelation zwischen dem Östrogenrezeptorstatus und der upa- Konzentration im Tumorzytosol des Kollektivs, wobei die Verteilung hier ganz ähnlich der des Progesteron-Rezeptorstatus ist und ein Großteil der östrogenrezeptorpositiv ist und ebenfalls der Gruppe mit niedrigen upa-werten angehört. Anzahl mit upa > 3 ng/µg (Prozent) mit upa 3 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Progesteronrezeptor negativ (48,1%) 27 (51,9%) positiv (37,2%) 120 (62,8%) p=0,1 Gesamt (39,5%) 147 (60,5%) Tab. 9: Kreuztabelle zwischen Progesteronrezeptorstatus und gruppen von upa 32

38 3. Ergebnisse Anzahl mit upa > 3 ng/µg (Prozent) mit upa 3 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Östrogenrezeptor negativ (46,3%) 29 (53,7%) positiv (37,6%) 118 (62,4%) p=0,16 Gesamt (39,5%) 147 (60,5%) Tab. 10: Kreuztabelle zwischen Östrogenrezeptorstatus und gruppen von upa 33

39 3. Ergebnisse Korrelation von upa zum rezidivfreien und Gesamtüberleben A) Rezidivfreies Intervall Es zeigt sich bei der Betrachtung der Kaplan- Meier Kurven des rezidivfreien Intervalls der beiden gruppen des upa ein signifikant verkürztes rezidivfreies Intervall für mit erhöhten upa- Werten (p=0,012 nach Log-Rank Test) (Diagramm 2). Nach einem Betrachtungszeitraum von ca. 10 Jahren sind nur noch 55% der mit erhöhten upa- Werten rezidivfrei (kumulierte Rezidivfreiheit von 0,55) im Gegensatz zu mehr als 80% der mit niedrigen upa- Werten. 1,1 1,0,9 Kum. Rezidivfreiheit,8,7,6, UPA Risikogruppen Hochrisikogruppe mit upa > 3 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit upa 3 ng/µg Rezidivfreies Intervall in Monaten Diagramm 2: Kaplan-Meier Kurve zum rezidivfreien Intervall der upa gruppen 34

40 3. Ergebnisse B) Korrelation von upa zum Überleben nach 3 Jahren Nach 3 Jahren zeigt sich in der Kaplan- Meier Kurve kein signifikanter Unterschied im Gesamtüberleben der Gruppe von mit upa- Werten über dem Cut-Off zu denen der Gruppe mit upa- Werten unter oder gleich dem Cut-Off (Diagramm 3). So enden beide Kurven mit einer Überlebenswahrscheinlichkeit von 98% bzw. 97% nach 3 Jahren. 1,1 1,0,9 Kum. Überleben,8,7,6, UPA Risikogruppen Hochrisikogruppe mit upa > 3 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit upa 3 ng/µg 36 Gesamtüberleben in Monaten Diagramm 3: Kaplan-Meier Kurve zum Überleben der upa gruppen nach 3 Jahren 35

41 3. Ergebnisse C) Korrelation von upa zum Überleben nach 5 Jahren Über einen Betrachtungszeitraum von 5 Jahren zeigt sich jedoch schon ein Absinken der Kurve für die mit erhöhten upa- Werten. Sie haben nur noch eine Überlebenswahrscheinlichkeit von 89% gegenüber den mit niedrigen upa- Werten die nach 5 Jahren eine Überlebenswahrscheinlichkeit von 91% besitzen (Diagramm 4). 1,1 1,0,9 Kum. Überleben,8,7,6, UPA Risikogruppen Hochrisikogruppe mit upa > 3 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit upa 3 ng/µg Gesamtüberleben in Monaten Diagramm 4: Kaplan-Meier Kurve zum Überleben der upa gruppen nach 5 Jahren 36

42 3. Ergebnisse D) Korrelation von upa zum Gesamtüberleben nach 12 Jahren Nach einem Beobachtungszeitraum von 5 Jahren (60 Monaten) zeigt sich eine deutlich erhöhte Sterblichkeit der mit upa- Werten über 3ng/µg im Tumorzytosol gegenüber den Patietinnen mit upa-werten kleiner oder gleich 3ng/µg im Tumorzytosol. Über den Gesamtverlauf der Studie betrachtet, mit einer maximalen Nachbeobachungszeit von 11,84 Jahren, zeigt sich ein signifikant schlechteres Überleben für die mit erhöhten upa- Werten (p=0,03, Log-Rank Test) (vgl. Diagramm 5). 1,1 1,0,9 Kum. Überleben,8,7,6, UPA Risikogruppen Hochrisikogruppe mit upa > 3 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit upa > 3 ng/µg Gesamtüberleben in Monaten Diagramm 5: Kaplan-Meier Kurve zum Gesamtüberleben der upa gruppen innerhalb der Studie 37

43 3. Ergebnisse 3.3. Untersuchungen zu PAI Darstellung der PAI-1- Konzentrationen im Tumorzytosol der Die PAI-1- Konzentrationen im Tumorzytosol des untersuchten Kollektivs (n=243) lagen zwischen 0,02 und 142,45 ng/µg Protein (als Extrem). Bei dem Festgesetzten Cut-Off Wert von 14 ng/µg Protein ergab sich für die Gruppe von mit PAI-1- Werten unter dem Cut-Off ein Median von 6,66 ng/µg Protein und ein Median von 25,02 ng/µg Protein in der Gruppe von mit PAI-1- Werten über dem Cut-Off (Diagramm 6) PAI-1 im Tumorzytosol [ng/µg Protein] N = 145 Niedrigrisikogruppe mit PAI-1 14 ng/µg 98 Hochrisikogruppe mit PAI-1 > 14 ng/µg Diagramm 6: Box-Plot Darstellung der Konzentrationen von PAI-1 in den gruppen 38

44 3. Ergebnisse Zusammenhang zwischen PAI-1 und etablierten Prognosefaktoren A) Korrelation von PAI-1 mit der Tumorgröße Die Konzentrationen des PAI-1 im Tumorzytosol der des Kollektivs zeigten eine signifikante Korrelation von p=0,02 (nach Fischer). mit der Tumorgröße pt 3 und 4 zeigen dabei höhere PAI-1- Konzentrationen (im Median 20,92 ng/µg Protein) als mit den Stadien pt 1 und 2 (Konzentration im Median 12,42 ng/µg Protein) (vgl. Tabelle 11). Anzahl mit PAI-1 > 14 ng/µg (Prozent) mit PAI-1 14 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Tumorgröße Stadium pt (26,8%) 60 (73,2%) Stadium pt (47,2%) 85 (52,8%) p=0,02 Gesamt (40,3%) 145 (59,7%) Tab. 11: Kreuztabelle zwischen Tumorgröße und gruppen von PAI-1 39

45 3. Ergebnisse B) Korrelation von PAI-1 mit dem Tumorgrading Es zeigt sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen PAI-1- Werten und Grading (p=0,043). Die mit undifferenzierten Tumoren (Grading 3) haben mit einem Median von 15,15 ng/µg Protein höhere PAI-1- Werte als mit differenzierteren Tumoren (Grading 1 und 2), die einen Median von 10,0 ng/µg Protein aufzeigen (Tabelle 12). Anzahl mit PAI-1 > 14 ng/µg (Prozent) mit PAI-1 14 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Grading nicht bestimmt 8 4 (50%) 4 (50%) Tumor Grad (34,4%) 101 (65,5%) Tumor Grad (50,6%) 40 (49,4%) p=0,043 Gesamt (40,3%) 145 (59,7%) Tab. 12: Kreuztabelle zwischen Tumor Grading und den gruppen von PAI-1 40

46 3. Ergebnisse C) Korrelation von PAI-1 zum Patientenalter Es lässt sich in diesem Kollektiv keine signifikante Beziehung zwischen dem Patientenalter und den Konzentrationswerten von PAI-1 im Tumorzytosol der nachweisen (Tabelle 13). Der Großteil der gehört dabei der Altersgruppe über 50 Jahren an, und gehört zur Gruppe von mit PAI-1- Werten kleiner oder gleich dem Cut-Off. Anzahl mit PAI-1 mit PAI-1 Signifikanz > 14 ng/µg 14 ng/µg nach Fischer (Prozent) (Prozent) Alter unter 50 Jahre (47,1%) 37 (52,9%) ab 50 Jahre (37,6%) 108 (62,4%) p=0,11 Gesamt (40,3%) 145 (59,7%) Tab. 13: Kreuztabelle zwischen alter und gruppen von PAI-1 41

47 3. Ergebnisse D) Korrelationen zwischen PAI-1 und dem Hormonrezeptorstatus Es wurde in diesem Kollektiv jeweils zwischen Progesteron- und Östrogenrezeptorstatus unterschieden. Tabelle 14 gibt die nicht signifikanten Korrelationen (p=0,13) zwischen der PAI-1 Konzentration im Tumorzytosol und dem Progesteronrezeptorstatus des Kollektivs wieder. Ein positiver oder negativer Progesteronrezeptorstatus ist somit nicht mit der Zugehörigkeit zu einer der gruppen von PAI-1 korreliert. Aus Tabelle 15 ergibt sich die ebenfalls nicht signifikante Korrelation zwischen der PAI-1 Konzentration im Tumorzytosol des Kollektivs und dem Östrogenrezeptorstatus. Anzahl mit PAI-1 > 14 ng/µg (Prozent) mit PAI-1 14 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Progesteronrezeptor negativ (48,1%) 27 (51,9%) positiv (38,2%) 118 (61,8%) p=0,13 Gesamt (40,3%) 145 (59,7%) Tab. 14: Kreuztabelle zwischen Progesteronrezeptorstatus und gruppen von PAI-1 42

48 3. Ergebnisse Anzahl mit PAI-1 > 14 ng/µg (Prozent) mit PAI-1 14 ng/µg (Prozent) Signifikanz nach Fischer Östrogenrezeptor negativ (50%) 27 (50%) positiv (37,6%) 118 (62,4%) p=0,07 Gesamt (40,3%) 145 (59,7%) Tab. 15: Kreuztabelle zwischen Östrogenrezeptorstatus und gruppen von PAI-1 43

49 3. Ergebnisse Korrelation von PAI-1 zum rezidivfreien und Gesamtüberleben A) Rezidivfreies Intervall In der Kaplan- Meier Kurve zum rezidivfreien Intervall der gruppen von PAI-1 zeichnet sich eine verringerte kumulierte Rezidivfreiheit der mit erhöhten PAI-1- Werten gegenüber den mit niedrigen PAI-1- Werten ab. Diese ist nach Log-Rank Test jedoch nicht signifikant (p=0,061) (Diagramm 7). Obwohl nach ca. 36 Monaten eine deutliche Mehrheit der Gruppe von mit PAI-1-Werten über dem Cut-Off ein Rezidiv erlitten haben und sich dieser Trend im weiteren Beobachtungsverlauf eindeutig fortsetzt. 1,1 1,0,9 Kum. Rezidivfreiheit,8,7, PAI-1 Risikogruppen Hochrisikogruppe mit PAI-1 > 14 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit PAI-1 14 ng/µg Rezidivfreies Intervall in Monaten Diagramm 7: Kaplan- Meier Kurve zum Rezidivfreien Intervall der gruppen von PAI-1 44

50 3. Ergebnisse B) Korrelation von PAI-1 zum Überleben nach 3 Jahren Die Kaplan-Meier Kurve zeigt bei der Betrachtung des Überlebens zwischen den beiden gruppen von PAI-1 keine signifikanten Abweichungen im Verlauf der ersten 3 Jahre (Diagramm 8). Beide gruppen zeigen nach einem Beobachtungszeitraum von 36 Monaten eine Überlebenswahrscheinlichkeit von etwa 97%. 1,1 1,0,9 Kum. Überleben,8,7, PAI-1 Risikogruppen Hochrisikogruppe mit PAI-1 > 14 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit PAI-1 14 ng/µg 36 Gesamtüberleben in Monaten Diagramm 8: Kaplan-Meier Kurve zum Überleben der gruppen von PAI-1 nach 3 Jahren 45

51 3. Ergebnisse C) Korrelation von PAI-1 zum Überleben nach 5 Jahren Die Kaplan-Meier Kurven zum Überleben über einen Verlauf von 5 Jahren zeigen für die mit PAI-1- Werten über dem Cut-Off mit 86% eine deutlich niedrigere Überlebenswahrscheinlichkeit als für die mit PAI-1- Werten kleiner oder gleich dem Cut-Off, die eine Überlebenswahrscheinlichkeit von 94% zeigen (Diagramm 9). 1,1 1,0,9 Kum. Überleben,8,7, PAI-1 Risikogruppen Hochrisikogruppe mit PAI-1 > 14 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit PAI-1 14 ng/µg 60 Gesamtüberleben in Monaten Diagramm 9: Kaplan-Meier Kurve zum Überleben der gruppen von PAI-1 nach 5 Jahren 46

52 3. Ergebnisse D) Korrelation von PAI-1 zum Gesamtüberleben nach ca. 12 Jahren Über den Gesamtzeitraum der Studie von maximal 11,84 Jahren betrachtet, zeichnet sich mit 63% weiter ein deutlich niedrigeres kumuliertes Gesamtüberleben der mit erhöhten PAI-1-Werten gegenüber den mit niedrigen PAI-1- Werten, die ein kumuliertes Gesamtüberleben von 78% zeigen, ab. Dennoch lässt sich für die gruppen von PAI-1 keine Signifikanz nach Log-Rank Test im Gesamtüberleben nachweisen (p= 0,07) (vgl. Diagramm 10). 1,1 1,0,9 Kum. Überleben,8,7, PAI-1 Risikogruppen Hochrisikogruppe mit PAI-1 > 14 ng/µg Niedrigrisikogruppe mit PAI-1 14 ng/µg Gesamtüberleben in Monaten Diagramm 10: Kaplan-Meier Kurve zum Gesamtüberleben der gruppen von PAI-1 innerhalb der Studie 47

53 3. Ergebnisse 3.4. Zusammengenommene Betrachtung von upa und PAI-1 A) Korrelation der Faktoren upa und PAI-1 Es ergab sich für das kollektiv eine sehr hohe Korrelation (p<0,001) zwischen upa und PAI-1. 67,7% der mit hohen upa- Werten weisen auch hohe PAI-1- Werte auf. 78,2% der mit niedrigen upa- Werten haben gleichzeitig niedrige PAI-1- Werte (vgl. Tabelle 16). Um die Vergleichbarkeit zu Gewährleisten werden die 63, die jeweils gemischte Werte aufweisen in den weiteren Betrachtungen nicht berücksichtigt. Anzahl mit PAI-1 Werten über dem Cut-Off (Prozent) mit PAI-1 Werten unter dem Cut-Off (Prozent) Signifikanz nach Fischer UPA Tumorzytosolkonzentration Unter dem Cut-Off (21,8%) 115 (78,2%) Über dem Cut-Off (67,7%) 31 (32,3%) p<0,001 Gesamt (39,3%) 146 (60,7%) Tab. 16: Kreuztabelle zwischen den gruppen von upa und den gruppen von PAI-1 48