Einführung in die Mikrobielle Ökologie

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1 Einführung in die Mikrobielle Ökologie Nachweis mikrobieller Aktivität 4 Who is there? How many? What are they doing? 1

2 Wie weist man mikrobielle Aktivitäten nach? Substratverwertung Analyse von Zellbestandteilen Wachstum Wärmefreisetzung Hemmung Produktbildung Substratumsatz Probleme: - Fließgleichgewicht (steady state, Bildungsrate Verbrauchsrate) - Natürliche Konzentrationen meist nur nm - Div. Kontrollen, Substratzusatz, Ausschluss von Größenklassen oder Licht etc. verändern die Situation schnell grundlegend Messung des Nettoumsatzes nur an sehr aktiven Standorten z.b. CO 2 -Freisetzung, O 2 -Aufnahme Substratverwertung Produktbildung Einsatz von n z.b. 14 C, 35 S, fluoreszierende Modellsubstrate wie MUF (Methylumbelliferyl-Rest fluoresziert nach Abspaltung durch (Exo)-Enzym) Bestimmung des "Heterotrophen Potenzials", Zusatz von Substratüberschuss, (Einbau von zugesetzten markierten Substraten,? Glucose,? Konzentration im Vergleich zur natürlichen Konzentration) Abschätzung von v max sollen - natürliche Konzentration möglichst wenig erhöhen - nur kurz umgesetzt werden, damit sie nicht in einen Kreislauf geraten 2

3 Beispiel photosynthetische Primärproduktion CO 2 + H 2* O < CH 2 O> + * O 2 Messung der 14 CO 2 -Fixierung im Licht (z.b. Flasche im See) Erhöhung der CO 2 -Konzentration meist kein Problem Dunkelkontrolle zum Abzug der CO 2 -Fixierung im Dunkeln? Netto- oder Brutto-Fixierung: Anfangs nur Aufnahme Substratverwertung Produktbildung O 2 -Freisetzung (minus Dunkelkontrolle) nur bei sehr hohen Raten sinnvoll sollen - natürliche Konzentration möglichst wenig erhöhen - nur kurz umgesetzt werden, damit sie nicht in einen Kreislauf geraten Beispiel photosynthetische Primärproduktion Hemmung O 2 - Mikroelektrode (optisches Messverfahren) 3

4 Mikrokalorimeter Wärmefreisetzung Jede lebende Zelle auch thermophile produziert Wärme. Mikrokalorimeter Wärmefreisetzung 4

5 Wieviel Wärme setzt ein Mensch frei? 2500 kcal pro Tag = kj/tag = /(24 * 60 * 60) kj/s = 120 J/s = 120 W Probenahme im Watt 5

6 Mikrokalorimetrie Heat production in mudflat and sandflat sediment Anu Kisand Mikrokalorimetrie Stimulierung der mikrobiellen Aktivität im Wattsediment (Neuharlinger Siel) durch Glucosezusatz (nach 60 h: 100 µmol/15 g) 10 cm 50 cm 300 cm 530 cm 10 cm 50 cm 300 cm 530 cm Wärmefreisetzung (µw) Integrierte Wärmemenge (J) 6

7 Wärmefreisetzung Beispiel: Mikrobieller Abbau von Tetraethyl- Blei im Boden Teeling H, Cypionka H, Appl Microbiol Biotechnol (1997) 48: (Bakterien)wachstum Wachstum 3 H-Thymidin-Aufnahme (1/4 der DNA) Einbau von markierten Aminosäuren (Leucin) 35 SO 42 -Assimilation (Schwefel 1% der Trockenmasse) Zunahme von DNA ( konst. pro Zelle) Zunahme der Zellzahl (Grazer abfiltriert < 2µm) FDC (frequency of dividing cells) Zellbestandteile Hemmung Ohne Inkubation oder Zusatz von Stoffen! 7

8 Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Umsatz von künstlichen Elektronenakzeptoren, Tetrazoliumsalze CTC, TTC, INT u.a. CTC: 5-Cyano-2,3-ditolyl Tetrazoliumchlorid Nachweis respirierender Zellen in einer Sedimentprobe des Bornhorster Sees. Links: DAPI-Färbung, Mitte: CTC, rechts: beide Bilder übereinandergelegt Prinzip: 'Verpackter' Akzeptor wird aufgenommen und reduziert, wobei ein unlösliches, gefärbtes oder fluoreszierendes Produkt entsteht Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Mikroautoradiographie: Einbau von radioaktiven Substraten z.b. 14 C-Glutamat in Proteine oder 3 H-Thymidin in die DNA Kombiniert mit Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung: Mar-FISH M. Wagner/Zeiss 8

9 Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Zählung teilungsfähiger Zellen mit Nalidixinsäure: Hemmt DNA-Replikation, es entstehen fädige Zellen, die sich nicht teilen Wachstum Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Nalidixinsäure hemmt Teilung aber nicht Wachstum Es sind viel mehr Bakterien aktiv als sich kultivieren lassen. 9

10 Stable-Isotope Probing Überschuss von 13 C-markiertem Substrat => wachsende Zellen bauen schweren Kohlenstoff ein => informationstragende Moleküle (RNA, DNA etc.) aus Ihnen lassen sich im Dichtegradienten von leichten Formen abtrennen Control 12 C Experiment 13 C Density gradient centrifugation inactive active DGGE Sara Kleindienst Analyse von Zellbestandteilen aktiver Zellen Analyse von Zellbestandteilen Life-Dead-Staining Phospholipide als nur kurzfristig überdauernde Bestandteile Ribosomen: pro Bakterium je nach Aktivität, Anfärbung mit RNA-Sonden Messenger-RNA (mrna) als Indikatoren für gerade gebildete Proteine molekularbiologische Methoden... 10

11 Wirkung von Hemmstoffen Hemmung Möglichst spezifische Blockade von essenziellen Prozessen Anhäufung von Intermediaten oder alternativen Endprodukten Langfristig Veränderung des Systems... (kurzfristig einsetzen!) Beispiele von Hemmstoffwirkungen Hemmung Plötzliche Dunkelheit hemmt die Photosynthese (s.o.) Filtrieren entfernt Grazer Acetylen (HC HC) hemmt die Denitrifikation (Umsetzung von N 2 O zu N 2 ). Es entsteht N 2 O als Endprodukt und ist leicht im Gaschromatographen nachweisbar Bromethansulfonat (BES) hemmt die Methanogenese. BES ist ein Analoges des Coenzym M (Mercaptoethansulfonat) Molybdat hemmt die Sulfatreduktion. Molybdat ist ein Analoges des Sulfat Nitrapyrin hemmt die Nitrifikation (Umsetzung von Ammonium zu NItrat). Käuflich als 'N-Serve' etc. 11

12 Interpretation von Gradienten Diffusion Gradienten F = D * A * δc/δx (1. Fick'sches Gesetz) F = Fluss D = Diffusionskoeffizient (Durchlässigkeit) A = Fläche δc/δx = Konzentrationsänderung (1. Ableitung) Gradienten Beispiel: Diffusiver Fluss von Sauerstoff durch Wasser Die O 2 -Konzentration ändere sich auf 4 mm von 280 µm auf 210 µm Diffusionskoeffizient D von O 2 in Wasser, 25 C: cm 2 h -1 A: Fläche: 1 cm 2 Gradient δc/δx: -70 µm/0.4 cm = -175 nmol cm -4 (1 µm = 1 nmol/ml = 1 nmol cm -3 ) Fluss F = D * A * δc/δx = cm 2 h -1 * -175 nmol cm -4 = nmol O 2 cm -2 und h -1 12

13 Diffusion Gradienten Ein Gradient (Steigung) zeigt einen Fluss an. Eine Änderung der Steigung (im steady state) zeigt Verbrauch oder Produktion des diffusiblen Stoffes an. Berechnung der Verbrauchsrate aus der zweiten Ableitung des Gradienten. Gradienten Berechnung der O 2 - Aufnahme s. 2 Folien vorher 13

14 Diffusionszeit, Kräfte und Transportmechanismen für Organismen verschiedener Größenordnungen Diffusion Molekulare Diffusion (in Systemen mit Strömung, turbulenter Durchmischung: Eddy- Diffusion) Ein Sauerstoffmolekül bewegt sich in Wasser in 1 sec etwa 30 µm, in 15 min 1 mm seinem Startpunkt weg Formel dazu: (2 r)² t 1D = 2 D - r = Diffusionsstrecke - D = Diffusionskoeffizient, z.b. von O 2 in Wasser, 25 C: cm 2 h -1 Merke: Diffusion ist schnell über kurze Distanz, langsam über lange (quadratische Abhängigkeit) Beispielrechnung: O 2 in Wasser braucht für 1 mm 0.04 cm² = h oder 15.4 min cm² h -1 Bewegung und Kraft Bewegung und Kraft Die Reynolds-Zahl beschreibt das Verhältnis von Trägheit (Masse) zu Viskosität (Reibung) abhängig von der (typischen) Geschwindigkeit Wal 10 9 Forelle 10 5 Ciliat 10-1 Bakterium 10-3 Bakterien haben einen geringen Energiebedarf für die Bewegung. Bereits die Brownsche Molekularbewegung bewegt sie. Merke: Für Bakterien hat Wasser Balken (> 1000 km Polymere pro ml) 14