Prof. Dr. Peter C. Dartsch

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1 1 von 7 Dartsch Scientific GmbH Oskar-von-Miller-Str. 10 D Schongau RINGANA Kosmetik GmbH Schloss Hartberg / Herrengasse 1 DI Thomas Kamrat Marienthaler Str. 3 A-8230 Hartberg Dartsch Scientific GmbH Institut für zellbiologische Testsysteme Oskar-von-Miller-Straße 10 D Schongau Fon +49 (0) Fax +49 (0) info@dartsch-scientific.com Internet September 2010 Testbericht und Fachinformation für Angehörige von Heilberufen Tierversuchsfreie zellbiologische Untersuchungen zu antioxidativen Wirkeffekten von RINGANA PACK antiox Zusammenfassung und Schlussfolgerungen Mit tierversuchsfreien zellbiologischen Testmethoden wurde auf seine antioxidativen Wirkeffekte untersucht. Die Testergebnisse haben ergeben, dass die synergetische Wirkstoffkombination in die schädigende Wirkung von exogenen Radikalen aus der Umwelt und auch bei einem metabolischen Ungleichgewicht als Folge von oxidativem Stress dosisabhängig reduziert. Weiterhin wird auch ein lokaler Überschuss reaktiver Sauerstoffradikale im Gewebe, wie er beispielsweise bei Entzündungsprozessen auftreten kann, dosisabhängig vermindert. Im Bereich der berechneten Blutflüsigkeitskonzentration bei der empfohlenen Tagesdosis (ein Sachet mit 10 g Inhalt) und einer vollständigen Resorption der Wirkstoffe werden sowohl exogene als auch endogene Radikale nahezu vollständig inaktiviert. Im direkten Vergleich und im Bereich niedriger Konzentrationen ist bei der Inaktivierung der endogen gebildeten Radikale bis zu 10x effektiver als bei der Neutralisierung exogen einwirkender Radikale. Die Einnahme von kann somit bestens zur Neutralisierung eines Überschusses reaktiver schädigender Sauerstoffradikale empfohlen werden und so zur Förderung des allgemeinen Wohlbefindens beitragen. Schongau, den 22. September 2010 Prof. Dr. Peter C. Dartsch

2 2 von 7 Inhaltsstoffe und Produktauslobung Inhaltsstoffe: Studentenblume, Acai, Goji, Mangosteen, Granatapfel, Holunderbeerenextrakt, Traubenpolyphenole, Curcuma-Extrakt, rein pflanzliches SOD, Coenzym Q10, Grünteeextrakt, natürliche Vitamine, Mineralien und Spurenelemente und hoch aktive synergetische Antioxidantien. Für optimale Verträglichkeit frei von synthetischen Vitaminen, Hefe-, Milch- und Weizenprodukten, Konservierungs- und Farbstoffen. Gelatinefrei, 100 % vegan. Frei von genmanipulierten Rohstoffen. enthält keine chemischen oder natürlichen Aromastoffe und Geschmacksverstärker und entspricht daher geschmacklich den natürlichen Ingredienzien. Produktauslobung: Werden die Zellen reichlich und gezielt mit hochwirksamen Antioxidantien versorgt, können sie sich rasch erneuern. Die natürlichen Wirkstoffe in steigern Wohlbefinden, Leistungsvermögen und Abwehrkräfte. Fragestellung der durchgeführten Untersuchungen Kann einen Überschuss der im Blut zirkulierenden freien reaktiven Sauerstoffradikale neutralisieren und somit einer Schädigung des Organismus durch äußere (exogene) Umwelteinflüsse und/oder oxidativem Stress vorbeugen? Kann endogen und lokal im Gewebe gebildete überschüssige Sauerstoffradikale inaktivieren? Ein solcher Radikalüberschuss direkt im Gewebe kann beispielsweise bei Entzündungsprozessen durch die aus dem Blut eingewanderten neutrophilen Granulozyten als entzündungsvermittelnde Zellen hervorgerufen werden. Testkonzentrationen Um in den hier durchgeführten tierversuchsfreien zellbiologischen Untersuchungen mit verschiedenen Testsystemen die Testkonzentration von abschätzen zu können, wurde von den folgenden Überlegungen ausgegangen: Die Einnahmeempfehlung für RINGANA PACK antiox beträgt 10 g (= Inhalt eines Sachets) pro Tag. Geht man von einer vollständigen Resorption der Wirkstoffe und einer Verteilung in der Blutflüssigkeit von ca. 3,3 Litern aus, so erhält man bei einer angenommenen vollständigen Resorption durch den Dünndarm eine Konzentration von etwa 3 mg/ml. Daher wurde die am stärksten konzentrierte wässrige Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml hergestellt und dann entsprechend weiter verdünnt. Die Untersuchungen wurden im Konzentrationsbereich zwischen 0 und 10 mg/ml durchgeführt. Dabei bezeichnet die Konzentration 0 die unbehandelte Kontrolle ohne Wirkstoff. Antioxidative Wirkung von Ohne Sauerstoff können wir nicht leben, aber Sauerstoff in Form von hochreaktiven freien Sauerstoffradikalen (ROS = reactive oxygen species) kann pathophysiologische Veränderungen bewir-

3 3 von 7 ken und auch den vorzeitigen Alterungsprozess fördern. Freie Radikale werden als natürliche Stoffwechselprodukte permanent in unserem Körper produziert und erfüllen grundsätzlich lebenswichtige Aufgaben. Zudem stehen sie in einem ständigen Gleichgewicht mit den regulierenden natürlichen Entgiftungsmechanismen wie die Enzyme Glutathion, Katalase und Superoxid- Dismutase. Umweltbelastungen, Ernährungsmängel, körperlicher oder seelischer Stress, aber auch Medikamente, Verletzungen und Entzündungen können zu einer unkontrollierten Überproduktion freier Radikale führen. Die Selbstregulation durch den Körper ist gestört. Übersteigt die Aufnahme oder Bildung freier Radikale deren körpereigene Entgiftung, so spricht man von oxidativem Stress. Die schnell und aggressiv wirkenden freien Radikale stören und zerstören wichtige Funktionen und Strukturen im Körper; sie können oxidative Veränderungen verursachen und damit Schädigungen aller wichtigen Biomoleküle wie Nukleinsäuren (DNA und RNA), Proteine, Lipide und Kohlenhydrate. (a) Antioxidative Wirkung im zellfreien Testsystem bei freien exogenen Sauerstoffradikalen Versuchsdurchführung und Auswertung: In diesem zellfreien Testsystem wurde ohne die Verwendung von Zellen im Testansatz geprüft, ob verschiedene Konzentrationen der Testsubstanz in der Lage sind, freie und im Blut zirkulierende Sauerstoffradikale zu inaktivieren. Für die Untersuchung wurden die verschiedenen Konzentrationen in Aqua dest. vorgelegt und dazu Kaliumsuperoxid in Aqua dest. (1 mg/ml) pipettiert. Die nicht durch RINGANA PACK antiox inaktivierten und damit noch reaktionsfreudigen Superoxidanion-Radikale führen dabei zu einer Spaltung und damit auch zu einer Änderung der optischen Dichte des ebenfalls zum Ansatz zugegebenen Tetrazoliumfarbstoffes WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim). Dessen optische Dichte wurde als Differenzmessung OD = nm kontinuierlich aufgezeichnet und nach linearer Regression der erhaltenen Kurvenzüge in Form der Steigung in mod/min ausgewertet. Die erhaltenen Ergebnisse wurden dann als Relativwerte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle dargestellt und gegen die Konzentration aufgetragen. Ergebnis (Abb. 1): neutralisierte die von außen auf den Organismus einwirkenden und frei im Blut zirkulierenden Sauerstoffradikale in einer dosisabhängigen Weise. Bei einer Konzentration > 2,5 mg/ml und damit im Bereich der berechneten Wirkstoffkonzentration in der Blutflüssigkeit, wurden die Radikale vollständig inaktiviert. Die EC50, d.h. die Konzentration, bei der 50% der freien Radikale inaktiviert wurden, lag bei 1,5 mg/ml. Zum Vergleich: Für reine Ascorbinsäure (Vitamin C) lag die EC50 unter gleichen Versuchsbedingungen bei 1,3 mg/ml. Durch die antioxidative Wirkung von können frei im Blut zirkulierende Radikale, welche aus der Umwelt stammen oder durch ein metabolisches Ungleichgewicht (z.b. oxidativer Stress) entstehen, inaktiviert und in ihrer Wirkung abgeschwächt werden.

4 4 von 7 (b) Entzündungshemmende Wirkung im zellbasierten Testsystem bei einem lokalen Überschuss körpereigener (endogener) Sauerstoffradikale Versuchsdurchführung und Auswertung: Humane Promyelozyten (Zelllinie HL60, ECACC ) wurden als permanente Zelllinie in Routinekultur durch sechstägige Behandlung mit Dimethylsulfoxid zu sog. funktionalen Neutrophilen differenziert. Dies sind Zellen, welche die Eigenschaften von phagozytierenden und entzündungsvermittelnden Zellen (neutrophile Granulozyten) im Blut besitzen. Nach Stimulation bilden diese Zellen in einem sog. oxidativen oder respiratorischen Burst Superoxidanion-Radikale, welche das Gewebe lokal zerstören können. Ein solcher Burst stellt nach der Einwanderung dieser Zellen aus dem Blut ins betroffenene Gewebe einen Teilaspekt des komplexen Entzündungsprozesses dar und kann durch die weitere Gewebezerstörung diesen Prozess dauerhaft in Gang halten. Die funktionalen Neutrophilen wurden durch Zugabe eines Phorbolesters (Phorbol-12-myristat-13- acetat; Sigma-Chemie, Taufkirchen) dazu angeregt, Superoxidanion-Radikale zu bilden. Die Radikale führen zu einer Spaltung des ebenfalls dem Versuchsansatz zugesetzten Tetrazoliumfarbstoffes WST-1. Dabei ist die Menge der gebildeten Sauerstoffradikale direkt proportional zur Farbstoffspaltung, d.h. je mehr reaktive Radikale vorhanden sind, desto stärker ist die Farbstoffspaltung und damit auch die Änderung der optischen Dichte. Werden die von den Zellen gebildeten Radikale durch den Wirkstoff inaktiviert, so verändert sich die optische Dichte weniger stark. Es wurde die optische Dichte als Differenzmessung OD = nm kontinuierlich aufgezeichnet und nach linearer Regression der erhaltenen Kurvenzüge in Form der Steigung in mod/min ausgewertet. Die erhaltenen Ergebnisse wurden dann als Relativwerte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle dargestellt und gegen die Konzentration aufgetragen. Ergebnis (Abb. 2): neutralisierte die endogen gebildeten Sauerstoffradikale gleichfalls in einer dosisabhängigen Weise. Die maximale Inaktivierung der endogenen Radikale wurde bei deutlich niedrigeren Konzentrationen als für die exogenen Radikale erreicht. Die EC50, d.h. die Konzentration, bei der 50% der von funktionalen Neutrophilen in einem oxidativen Burst gebildeten Radikale inaktiviert wurden, lag bei 0,15 mg/ml. Somit war die lokale Wirkung bei endogen gebildeten Radikalen bei niedrigen Konzentrationen etwa 10x stärker als die antioxidative Wirkung bei exogenen Radikalen oder bei einem metabolischen Ungleichgewicht (Abb. 3). Im Bereich der berechneten Blutflüssigkeitskonzentration wurden sowohl die exogenen als auch die endogenen Radikale nahezu vollständig inaktiviert.

5 5 von Inaktivierung exogener Sauerstoffradikale in % vs. Kontrolle Vollständige Inaktivierung BF 0 0 0,1 0,25 0,5 1 1,25 1,75 2, Wirkstoffkonzentration in mg/ml Abb. 1: Dosisabhängige Inaktivierung von exogenen Sauerstoffradikalen durch RINGANA "PACK antiox". Bei einer Konzentration > 2,5 mg/ml erfolgt eine vollständige Inaktivierung der Radikale. Durch die antioxidative Wirkung können frei im Blut zirkulierende Radikale, welche aus der Umwelt stammen oder durch ein metabolisches Ungleichgewicht (z.b. oxidativer Stress) entstehen, inaktiviert und in ihrer Wirkung abgeschwächt werden. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus jeweils drei Messungen. BF = Berechnete Konzentration in der Blutflüssigkeit nach vollständiger Resorption (= 3 mg/ml).

6 6 von 7 Inaktivierung endogener Sauerstoffradikale in % vs. Kontrolle Vollständige Inaktivierung BF 0 0 0,1 0,25 0,5 1 1,25 1,75 2,50 3, Wirkstoffkonzentration in mg/ml Abb. 2: Dosisabhängige Inaktivierung von endogenen Sauerstoffradikalen durch RINGANA "PACK antiox". Bereits ab einer Konzentration von 1 mg/ml erfolgt eine nahezu vollständige Inaktivierung der endogen gebildeten Radikale. Dadurch kann die schädigende Wirkung von einem lokalen Überangebot reaktiver Sauerstoffradikale direkt im Gewebe vermindert werden. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus jeweils drei Messungen. BF = Berechnete Konzentration in der Blutflüssigkeit nach vollständiger Resorption (= 3 mg/ml).

7 7 von 7 Inaktivierung von Sauerstoffradikalen in % vs. Kontrolle endogene Radikale exogene Radikale BF 0 0,1 1,0 10,0 Wirkstoffkonzentration in mg/ml Abb. 3: Vergleichende Darstellung der Inaktivierung von endogenen und exogenen Sauerstoffradikalen. Es ist deutlich erkennbar, dass bei der berechneten Blutflüssigkeitskonzentration (= BF) von 3 mg/ml kein signifikanter Wirkunterschied besteht und die Radikale nahezu vollständig entgiftet werden. Bei niedrigeren Konzentrationen ist die Inaktivierung der endogenen Radikale jedoch weitaus stärker ist als die Inaktivierung der exogenen Radikale. Dies ist am völlig unterschiedlichen Kurvenverlauf gut zu sehen.