Vorlesung SoSe 2016 Zellbiologie und Physiologie der Pflanzen

Vorlesung SoSe 2016 Zellbiologie und Physiologie der Pflanzen Prof. Dr. I. Finkemeier Prof. Dr. A. von Schaewen Prof. Dr. J. Kudla 02.05.2016 Licht-Perzeption: Wie nehmen Pflanzen Licht wahr? Pflanzenwachstum Pflanzen zeigen bei Anzucht im Dunkeln eine andere Morphologieals bei Wachstum im Licht (Beispiel: auskeimende Kartoffelknolle, Spargel) Frage: Wie nehmen Pflanzen Licht wahr, wenn sie noch keine Chloroplasten haben? Skotomorphogenese (Entwicklung im Dunkeln) bleicher, langgestreckter Spross und nicht entwickelte Blätter Photomorphogenese (Entwicklung im Licht) gestauchte Sprossachse und grüne, voll entwickelte Blätter Knolle Erde Knolle 1

Lichtrezeptoren regulieren die Photomorphogenese Phytochrom und Cryptochrom Rezeptoren: Phytochrom absorbiert im roten Spektralbereichund Cryptochrom im blauen Spektralbereich Die Antworten beider Wege ergänzen sich und überlappen in ihrer Wirkung. Arabidopsis Wildtyp-Pflanzen Blaulicht Rotlicht Phytochrom Cryptochrom Signalkette cop constitutive photomorphogenesis Photomorphogenese Etioplast DET/COP Proteine Arabidopsis Mutanten det de-etiolated Vorlesung 2016 Chloroplast Abb aus: Buchanan u.a. Biochemistry& Molecular Biology of Plants (Amer. Society of Plant Physiologists, 2000). Phytochrome = Chromoproteine, die im blauen, hellroten und dunkelroten Spektralbereich charakt. Absorptionsmaxima zeigen Phytochrom-Aktivität Entwicklungsantworten Samenkeimung Ergrünung Vorlesung 2016 Phytochrome können in 2 Formen existieren, Pr (red) und Pfr(far red), von denen nur die Pfr-Formphysiologische Reaktionen auslösen kann (absorbiert Licht dunkelroter Wellenlänge, 730 nm) Abb aus: Buchanan u.a. Biochemistry& Molecular Biology of Plants (Amer. Society of Plant Physiologists, 2000). 2

Phytochrom-Wirkung Beispiel für einenintrazellulären Rezeptor Die Koordination von Entwicklungsantworten erfolgt durch Phytochrom (Licht-Rezeptor im Cytosol) und nachgeschaltete sowie untereinander verschaltete Signalwege der Ca 2+ / Calmodulin-Weg interagiert mit dem cgmp-vermittelten Signalweg Ca 2+ CaM aktiviert Klasse I- Gene Pfr- Form G-Proteine konvergierende Signalwege cgmp aktivieren Klasse II- Gene Anthocyan- Biosynthese Chloroplastenentwicklung Phytochrom reversibler Photorezeptor im Cytosol weisses oder hellrotes Licht Cytosol Pr(red) Pfr(far red) schematisch Pr 660 dunkelrotes Licht Pfr 730 Abbau langsame Konversion im Dunkeln Reaktionen, Entwicklungsprogramme Nukleus AvS 2003 3

Phytochrom ist ein Chromoprotein Struktur Chromophor - kovalent an Apoprotein gebunden offenkettiges Tetrapyrrol Signal-Perzeption Proteinsequenz (Apoprotein) TKD = Transmitter- Kinase-Domänen Signal-Weiterleitung Vorlesung 2016 Abb aus: Buchanan u.a. Biochemistry& Molecular Biology of Plants (Amer. Society of Plant Physiologists, 2000). Phytochrom Licht-vermittelte cis-/trans-isomerisierung im Chromophor Phytochromist ein Dimer aus 2 Polypeptidketten(je ca. 125 kda). Jedes Polypeptid trägt ein Chromophor (kovalent über eine Thioether-Brücke an Cystein-Reste gebunden) = offenkettiges Tetrapyrrol. Hellrotes Licht führt zu einer Konfigurationsänderung im Chromophor (Umklappen einer Doppelbindung zwischen Ring C und D) cis trans- Isomerisierung. Dadurch resultiert eine Konformationsänderungim Protein-Rückgrat (Pr Pfr), die multiple Reaktionen auslösen kann. Phytochrome sind im Cytosol lokalisiert, wandern aber nach Belichtung in den Zellkern ein (wurde durch GFP-Fusion gezeigt). 4

Abstammung Die Phytochrom-Chromophorehaben Ähnlichkeit mit den Phycobilinen der Phycobilisomen(den Antennen- Komplexen der Cyanobakterien s. Photosynthese). Als offenkettigetetrapyrrolesind diese ebenfalls durch Thioether-Brücken an Cystein-Reste ihrer Träger-Proteine gebunden. Bakt. Chromophore: Phycocyanin(PC), Phycoerythrin(PE) Phycobilisomenstruktur Die peripheren Antennen der Cyanobakterien(Phycobilisomen) ragen aus der Membran und enthalten kein Chlorophyll, sondernphycoerytrin und Phycocyanin. Nur die Core Antennen enhalten Chlorophyll a. Phytochrome = Lichtsensoren Die starke Homologie zu Phycobilinen(Chromophorein den Lichtsammelkomplexen der Cyanobakterien) verweist auf eine gemeinsame Abstammung der Proteine (Evolution). Unterschied: Phycobiline dienen nur der Lichtsammlungnichtder Lichtwahrnehmung. Sie zeigen auch keine cis-/trans-isomerisierung! Phytochrome bilden eine Gen-bzw. Protein-Familie Es gibt zwei Unterfamilien (PHY Aund PHY B - E), deren Mitglieder unterschiedliche physiologische Funktionen vermitteln, z.b.: PHY A Samenkeimung, Ergrünung PHY B Schattenvermeidung (z.b. im Laubdach) 5

Biosynthese von Phytochromen Beteiligung von sowohl Kern- wie Plastiden-Genom Biosynthese des Tetrapyrrol- Ringsystems kovalente Bindung Reversible Photokonversion Vorlesung 2016,Abb. aus Taiz/Zeiger Physiologie der Pflanzen, Spektrum-Verlag Die Phytochrom-Typen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Stabilität und Regulation ihrer aktuellen Proteingehalte ( steady state = Fließgleichgewicht) PHY A: Gleichgewicht von Synthese und Abbau erfolgt auf Protein-UND Transkript-Ebene. PHY B-E: nur geringe Mengen, aber hohe Stabilitätvon mrna und Protein. Die Transkription wird durch die eigene Pfr-Form nicht inhibiert. Die physiologische Reaktion hängt vom photo-reversiblen Gleichgewicht ab! Vorlesung 2016, Abb. aus Taiz/Zeiger Physiologie der Pflanzen, Spektrum-Verlag 6

Phytochromwird in 26S-Proteasomen abgebaut (nach aktiver Ubiquitinierung im Cytosol) Vorlesung 2016 Abb aus: Buchanan u.a. Biochemistry& Molecular Biology of Plants (Amer. Society of Plant Physiologists, 2000). blau rot/dr Absorptionsspektren Zusammenfassung Phytochromist ein Chromoprotein, das Licht-abhängig zwischen zwei isomeren Formen wechseln kann(prbzw. Pfr, hell-bzw. dunkelrot absorbierend). Es besteht aus 2 Polypeptidketten (2 x 125 kda) mit je einem Chromophor (offenkettiges Tetrapyrrol) in kovalenter Bindung (an je einem Cystein-Rest). Bei cis-/trans-isomerisierung(konfigurationsänderungder Chromophore) ändern die Polypeptidketten ihre Konformation(Proteinphosphorylierung: inaktiv aktiv). Nur die Pfr-Form ist aktiv und kann zelluläre Reaktionen auslösen, d.h. in den Zellkern einwandern und dort genetische Entwicklungsprogramme umsteuern. Im Licht stellt sich eine best. Pfr-Konzentration aus Neusynthese, Umwandlung und Abbau ein Fließgleichgewicht (steady state). 7

Wo wirkt Phytochrom hauptsächlich? Gewebespezifische Expression und Phytochrom-Verteilungsmuster In Keimlingen findet man die höchsten Phytochrom-Mengen in Geweben mit ausgeprägten Entwicklungszunahmen (also Meristemen). Phytochromverteilung in einem etiolierten (dunkel angezogenen) Erbsenkeimling Ökologisch wichtige Licht-Parameter, die von Phytochrom perzipiert werden: -2 HR > DR DR > HR DR > HR DR >> HR Neonlicht (z.b. im Labor) 10-15 dämmrig! 8

Phytochrom - wie wirkt es? Phytochrom-induzierte Reaktionen unterscheiden sich in den Lichtflüssen(Quanten) die sie auslösen (in microeinstein, µe): verylowfluenceresponse (VLFR): lowfluenceresponse (LFR): high intensityresponse (FR-HIR): < 1 µe (0,001-1 µmolquanten m -2 s -1 ) 300-780nm (Shinomura et al., 1996) 1-100 µe (1-100 µmol Quanten m -2 s -1 ) Red > 100 µe (100-2000 µmol Quanten m -2 s -1 ) FarRed (abhängig von Dauer und Intensität, keine Photoreversionmöglich) FRc VLF R PhyA PhyB FR-HIR VLFR LFR De-Etiolierung See Nagy & Davis (2014) Commentary in Plant, Cell & Environment, 37: 2649-2651 Beispiele für Phytochromgesteuerte Entwicklungsprozesse Photoreversibilität(Samenkeimung) Messen der Lichtstärke (Lichthemmung des Streckungswachstums) Messen der Licht/Dunkel-Periode (Blühinduktion) Messen der Beschattung durch höher liegende Blätter(Schattenvermeidung) 9

Samenkeimung: Reversibilität der Photomorphogenese Aktionsspektren (der Phytochrom- Wirkung auf die Samenkeimung) + - Bei manchen Pflanzen wird die Samenkeimung bereits durch sehr schwaches Licht ausgelöst (VLFR). Der Effekt ist beliebig oft reversibel (im Minuten-Bereich). Dabei ist die Qualität des zuletzt eingestrahlten Lichtsentscheidend, d.h. hell-oder dunkelrot (HR = R, DR = FR). Das gilt in auch für andere photomorphogenetische Prozesse. Bestrahlung endet jeweils mit hell-rot(hr) Bestrahlung endet jeweils mit dunkel-rot(fr) Vorlesung 2016 Taiz/Zeiger Physiologie der Pflanzen, Spektrum-Verlag Reziprozität und escape time MERKE: Photo-reversible Effekte werden bereits von sehr schwachem (VLFR) oder schwachem (LFR) Licht ausgelöst. Je nach Intensitätist die notwendige Bestrahlungsdauerentsprechend kürzer oder länger. Diese reziproke Beziehung zwischen Quanten-Flussrateund Dauerder Bestrahlung bezeichnet man als: Reziprozitätsgesetz der Photomorphogenese Jenseits eines kritischen Zeitpunktes sind diese Prozesse irreversibel. Man sagt sie entkommen der Photo-Reversion Escape time 10

Beispiele für Phytochromgesteuerte Entwicklungsprozesse Photoreversibilität (Samenkeimung) Messen der Lichtstärke (Lichthemmung des Streckungswachstums) Messen der Licht/Dunkel-Periode (Blühinduktion) Messen der Beschattung durch höher liegende Blätter(Schattenvermeidung) Hypokotyl- Streckung Licht bedingt Unterschiede in der MORPHOLOGIE(Gestaltbildung) Arabidopsis-Keimling (im Dunkeln) Hypokotyl- Stauchung Arabidopsis-Keimling (im Licht) 11

MERKE: Licht hemmtdas Streckungswachstum Im Schwachlicht angezogene Keimlinge wachsen stark in die Länge. Diese Lichthemmungist ein FR-HIR-Effekt und damit nichtphoto-reversibel. Neben Phytochromen sind dabei auch Cryptochrome involviert (Blaulicht- und UV- A-Rezeptoren). Cryptochrome Phytochrome UV-A Blau PS2 = 680 nm PS1 = 700 nm HR DR Pr = 660 nm Pfr = 730 nm 1-gipfelig 3-gipfelig (340-380 nm) (380-500 nm) 2-gipfelig (570-700 nm) Beispiele für Phytochromgesteuerte Entwicklungsprozesse Photoreversibilität (Samenkeimung) Messen der Lichtstärke (Lichthemmung des Streckungswachstums) Messen der Licht/Dunkel-Periode (Blühinduktion) Messen der Beschattung durch höher liegende Blätter(Schattenvermeidung) 12

Photoperiodische Blühkontrolle Eine Kurztagpflanze blüht, sobald eine kritische Dunkelperiode überschritten wird. EineLangtagpflanzeblüht, wenn die Nacht kürzer als die krit. Dunkelperiode ist. Herbst Frühling Störlichtversuche haben gezeigt: Pflanzen messen die Länge der Dunkelperiode! Vorlesung 2016, Abb. aus Campbell, Biologie, Spektrum-Verlag Nachweis der Beteiligung von Phytochrom Photo-reversibler Effekt von Bestrahlung mit Hell-Rot (HR) bzw. Dunkel-Rot (DR): Die Qualitätdes letzten Lichtpulses ist für die physiologische Antwort entscheidend! 13

Beispiele für Phytochromgesteuerte Entwicklungsprozesse Photoreversibilität (Samenkeimung) Messen der Lichtstärke (Lichthemmung des Streckungswachstums) Messen der Licht/Dunkel-Periode (Blühinduktion) Messen der Beschattung durch höher liegende Blätter(Schattenvermeidung) Phytochrom Lichtstärkeund Schattenvermeidung Wieviel Phy liegt in aktiver (Pfr) Form vor? Beschattung stimuliert Streckungswachtum! Bei Beschattung durch andere Pflanzen oder darüber liegenden Blätter (z.b. in Baumkronen) kommt fast nur noch dunkelrotes Lichtauf der Blattoberfläche an. PHY B-Antwort Streckung von Zellen in Wachstumszonen (involviert Auxine!) 14

Cryptochrome Blaulicht-Rezeptoren in Pflanzen (und Tieren!) Blaulicht- Filter K 2 Cr 2 O 7 Erster Hinweis: Ausfiltern des Blaulicht-Anteils verhindert heliotropebewegungvon Sonnenblumen (Charles Darwins Kalium-DichromatVersuch) Sonnenblume = franz. Tournesol morgens abends Die Natur des Rezeptors war lange Zeit unbekannt Cryptochrom Aktionsspektrum analog zu Flavinen (orange Flavoproteine als Kandidaten) Bsp. für charakteristische 400-500 nm-antworten: Phototropismus Anthocyan- und Carotinoid-Biosynthese Biologische Uhr circadiane Rhythmik ( ungefähr ein Tag ), auch in Tieren! Cryptochrome (CRY) Zeigen Ähnlichkeit zu Photolyasen(DNA-Reparaturenzyme in Bakterien), die Licht-abhängigThymin-Dimere (Cyclobutan-Ringe) in UV-geschädigter DNA spalten (Bsp. für eine Redox-Reaktion als Licht-Antwort). Vorlesung 2016 Abb aus: Buchanan u.a. Biochemistry& Molecular Biology of Plants (Amer. Society of Plant Physiologists, 2000). 15

Cryptochrome (CRY) und Photolyasen Gemeinsame Struktur: Proteinrückgrat mit zwei Chromophoren: Pterin FAD MTHF ET FAD e - Redox- Partner Bakterielle Photolyasen ET = Elektronentransport MTHF = 5,10-methenyltetrahydrofolsäure (Pterin) Chlamydomonas CRY Arabidopsis CRY Drosophila CRY keine Photolyase-Aktivität, wahrscheinlich Interaktion mit Redoxpartner! Humanes CRY Effektor- Domäne?! Vorlesung 2016 Abb: Cashmore et al. (1999). Cryptochromes: Blue Light Receptors for Animals and Plants. Science 284: 760-765. Cryptochrome (CRY) Pterine(Flavine)wirken als Lichtsammler VOR demelektronentransport zum FAD. Funktion analog zu den Chlorophyll-Molekülen in den Antennenkomplexen der Photosysteme (leiten die Anregungsenergie über Resonanzschwingung zum Reaktionszentrum weiter (Photosynthese). Die C-terminalen Erweiterungen (Unterschied zu bakteriellen Photolyasen) dienen wahrscheinlich der Interaktion mit Redox-Partner(n) bei der Signalweiterleitung. CRY-Proteine wandern nach Lichtaktivierung (analog zu PHY) in den Zellkern ein. Mutanten-Analysen zeigen: Durch Fehlen eines nuklerären Repressors wachsen Arabidopsis hy-mutanten (für: long hypocotyl)im Blaulicht genauso wie im Dunkeln (z.b. cry1 oder cry2). Nach Überexpression von CRY1-oder CRY2-Isoformen reagierten die transgenen Pflanzen daher hypersensitiv auf Blaulicht. Im Fall von CRY1 wurde beobachtet, dass auch die lokale Pathogenresistanz verbessert war: Wu & Yang (2010), Mol Plant 3, 539-548. Unterschied: Cry2 ist wesentlich instabiler als Cry1. Diese Photolabilität>5 µe deutet auf eine spezielle Funktion im Schwachlicht hin! 16

Cryptochrome (Cry) undphytochrome (Phy) haben überlappende Wirkspektren Folgende Blaulichtantworten werden gemeinsam von: 5 Phytochromen (PhyA, B-E) und 2 Cryptochromen(Cry1 & Cry2) vermittelt: Hemmung der Hypokotylstreckung(im Licht) Stimulierung der Anthocyan-Biosynthese Blühinduktion (Messen der Photoperiode) Circadiane Rhythmik ( free running = 23-25 h) Phy könnten als Ser/Thr-Kinase möglicherweise Cry phosphorylieren. Speziell: Phototropismus Analysen mit cry1 cry2-doppelmutanten deuteten an, dass noch andere Rezeptoren Blaulicht- Antworten vermitteln. Dies führte zur Entdeckung des ersten Membran-assoziierten Blaulicht-Rezeptors Nph1(nonphototropic hypocotyl) und der Phototropine(Phot1, Phot2), welche Flavin als prosthetische Gruppe enthalten. Phototropine- Struktur, Interaktion und Funktion LOV = Light, Oxygen, Voltage FMN = Flavin-Mono-Nukleotid Phot1(Nph1) (<1 µmolm -2 s -1 ) Phot3 (= Nph3) N LOV1 FMN Nph3 Phot dependent E3 UQ-Ligase LOV2 FMN Phot response signal transducer Rpt2 Kinase C Interaktionspartner wirken unterstützend: Phot1 mit Nph3 (bei niedriger) bzw. Phot2 mit Rpt2 (bei hoher) Licht-Intensität Phot2 (Npl1) (>1 µmol m -2 s -1 ) N Cys-S FMN FMN Kinase Ser-P C Phototropine sind keine integralen Membranproteine, aber Membran-assoziiert, d.h. sie werden (posttranslational) mittels Fettsäuren N-terminal verankert! ( Sekretorisches System, PM, Chloroplast) ATP Signal output: Autophosphorylierung (bis zu 8x) Kong et al. (2013) A Carboxy-Terminal Membrane Association Domain of Phototropin 2 Is Necessary for Chloroplast Movement. Plant Cell Physiol. 54(1): 57-68. Kong et al. (2013) Both phototropin 1 and 2 localise on the chloroplast outer membrane with distinct localisation activity. Plant Cell Physiol. 54(1): 80-92. 17

BLUE-LIGHT SENSING BY THE LOV DOMAIN (Light, Oxygen, Voltage) LOV domains were first identified in a small family of plant blue-light receptor kinases known as phototropins(huala et al., 1997; Christie et al., 1998; 1999). Phototropins (Phot1 and Phot2) regulate a variety of processes in plants that collectively serve to optimize photosynthetic efficiency and promote plant growth under weak light conditions (Takemiya et al., 2005; de Carbonnel et al., 2010). These include phototropism(sakai et al., 2001), stomatal opening (Kinoshita et al., 2001), light-induced chloroplast movements (Kagawa et al., 2001), as well as leaf expansionand movement(kagawa et al., 2001; Sakamoto and Briggs, 2002; Inoue et al., 2008). The primary amino acid structure of phototropins can be separated into two parts: an N-terminal photo-sensory input region coupled to a C-terminal effector domain containing a canonical serine/threonine kinase motif (Figure 2). The N-terminal region comprises two LOV domains (LOV1 and LOV2), each of which binds one molecule of flavin mononucleotide (FMN) as a blue-light-absorbing chromophore. LOV domains are a subset of the Per-ARNT-Sim (PAS) superfamily (Taylor and Zhulin, 1999) and exhibit sequence homology to motifs found in eukaryotic and prokaryotic proteins involved in sensing Light, Oxygen, or Voltage, hence the acronym LOV(Huala et al., 1997; Crosson et al., 2003). From: Christie et al. (2012), Molecular Plant, 3: 533 544 Phototropismus Blaulicht-vermittelte Änderung des Wachstums von Organflanken (in Streckungszonen von Spross und Wurzel). Wirkungsspektrum für die phototrope Reaktion des Lucerne-Hypokotyls (im UV- und Blaulicht) UV-C 100-280 nm UV-B 280-340 nm UV-A 340-420 nm Blau 420-480 nm Phytochromkann die phototrope Reaktionsfähigkeit erhöhen, ohne selbst phototrop wirksam zu sein. Der wachsende Sprossreagiert i. d. R. positiv, die Wurzel(wenn überhaupt) negativ phototrop. Daneben gibt es den Dia-Phototropismus, d.h. Blätter orientieren sich quer zum Licht (bei starker Strahlung u. U. sogar senkrechte Orientierung - mit dem Licht). 18

UV-B Rezeptoren Neben Blaulicht-und UV-A-Rezeptoren (absorbieren bei 340 bis 380 nm) gibt es noch UV-B Rezeptoren, die den Bereich von 280-320 nmwahrnehmen können (d.h. sehr kurze Wellenlängen). Lange vermutetes Chromophor: Carotinoide NEIN - Trp-vermittelter Dimer-Monomer-Übergang (UV-B sensitive Salzbrücke!) Sie induzieren z.b. die Biosynthese von Schutz- Pigmenten (Anthocyane) mit rot-violetter Färbung. Diese wasserlöslichen Phenylpropan- Derivate (Flavonoide-werden im pflanzlichen Sekundärmetabolismus gebildet), akkumulieren in den Vakuolen von Epidermis-Zellen und schirmen das darunter liegende Mesophyll- Gewebe gegen schädliche UV-B Strahlen ab. Lichtstress führt auch zu einer rot-violetten Färbung von Blättern und Stängeln (vgl. Keimlinge vor Ergrünung). Plant UVR8 photoreceptor senses UV-B by Tryptophanmediated disruption of cross-dimer salt bridges John M. Christie, 1,2 Andrew S. Arvai, 2 Katherine J. Baxter, 1* Monika Heilmann, 1* Ashley J. Pratt, 2 Andrew O Hara, 1 Sharon M. Kelly, 1 Michael Hothorn, 3 Brian O. Smith, 1 Kenichi Hitomi, 2,4,5 Gareth I. Jenkins, 1 Elizabeth D. Getzoff 2 The recently identified plant photoreceptor UVR8(UV RESISTANCE LOCUS 8) triggers regulatory changes in gene expression in response to ultraviolet-b (UV-B) light through an unknown mechanism. Here, crystallographic and solution structures of the UVR8 homodimer, together with mutagenesis and far-uv circular dichroismspectroscopy, reveal its mechanisms for UV-B perception and signal transduction. β-propeller subunits form a remarkable, tryptophandominateddimer interface, stitchedtogether by a complex salt-bridge network. Salt-bridging arginines flank the excitonically coupled cross-dimer tryptophan pyramid responsible for UV-B sensing. Photoreceptionreversiblydisruptssalt bridges, triggering dimer dissociation and signal initiation. Mutation of a single tryptophan to phenylalanine re-tunes the photoreceptor to detect UV-C wavelengths. Our analyses establish how UVR8 functions as a photoreceptor without a prosthetic chromophore to promote plant development and survival in sunlight. Dimer (inactive) Monomer (active) Homodimer Tryptophan, Trp = W Alle Abbildungen aus: Christie et al. (2012) Science, March 23, Vol. 335, 1492-1496 19

COP-und DET-Proteine wirken als Repressoren photomorphogener Reaktionen Arabidopsis Wildtyp-Pflanzen Blaulicht Rotlicht Arabidopsis Mutanten Etioplast det de-etiolated Dunkel Phytochrom Cryptochrom Licht Signalkette Photomorphogenese DET/COP Proteine Chloroplast cop constitutive photomorphogenesis Vorlesung 2016 Abbaus: Buchanan et al. Biochemistry& Molecular Biology of Plants (ASPP) Modell der COP1-Wirkung (invers zu PHY und CRY) Cytosol Dunkel Zellkern COP1 inhibiert die Gen-Expression COP1 Licht COP1 UVR8 Licht-regulierte Gene Cry2 P P P 20

Circadiane Rhythmen & biologische Uhr Figure 3. A Molecular Model of the Arabidopsis thaliana Circadian Oscillator. Genes are indicated by solid boxes with the gene names indicated at the left. Proteins are indicated by oval and oblong shapes, with the protein name indicated within the shape. Transcription and translation are indicated by dashed lines. Protein activity is indicated with solid lines, with lines ending in arrowheads indicating positive action and lines ending in perpendicular dashes indicating negative action. The core CCA1/LHY/TOC1 feedback loop is highlighted in green with thick lines and closed shapes. Phosphorylationof LHY and CCA1 by CK2 is indicated with circled Ps. Shaded area indicates activities peaking in the subjective night, and white area indicates activities peaking during the subjective day. From: McClung (2006). Plant circadian rhythms. Plant Cell 18: 792 803. Light-regulated degradation of key factors in the regulation of the circadian clock and photoperiodic flowering by ZTL/FKF1/LKP2 From: Noriyuki Suetsugu, and Masamitsu Wada Plant Cell Physiol 2013;54:8-23 Figures are constructed based on previous studies (Yu et al. 2008, Ito et al. 2012, Song et al. 2012). For clarity, the adaptor function of ELF3 in the GI COP1 interaction (Yu et al. 2008), the role of HSP90 in ZTL stabilization (Kim et al. 2011) and minor functions of FKF1/LKP2 or ZTL/LKP2 in the regulation of the circadian clock or photoperiodic flowering, respectively (Fornara et al. 2009, Baudry et al. 2010), are omitted. A) Blue light regulation of TOC1 and PRR5 degradation by ZTL. In darkness, cryptochromes (crys) cannot inhibit COP1- mediated ubiquitin ligation (white ovals) and the subsequent degradation by the 26S proteasome (not shown) of GI, resulting in low levels of GI. Furthermore, the ZTL LOV GI interaction is weak in darkness. Consequently, TOC1 and PRR5 strongly interact with the ZTL LOV domain and are subsequently degraded through ZTL-mediated ubiquitin ligation. Under blue light, crys inhibit COP1- mediated GI degradation, resulting in the accumulation of GI. Blue light enhances ZTL GI interaction via the ZTL LOV domain, and thus the interaction of TOC1 or PRR5 with the ZTL LOV domain is suppressed. Consequently, TOC1 and PRR5 accumulate in the light. B) Multistep regulation by blue light in FKF1-mediated regulation of photoperiodic flowering. (1) cry increases GI abundance by suppressing COP1 (circle number 1 in Fig. 4B). (2) Blue light enhances FKF1 GI interaction via the FKF1 LOV domain (circle number 2 in Fig. 4B). FKF1 also interacts with CDFs, the negative regulators of CO and FT transcription, via the Kelch repeats (green) and promote the ubiquitin-mediated degradation of CDFs. (3) Blue light enhances the interaction of CO with the FKF1 LOV domain and stabilizes CO proteins (circle number 3 in Fig. 4B), resulting in the activation of FT transcription. 21

From: Current Topics in Developmental Biology - Plant Development Chapter Two Light-Regulated Plant Growth and Development Kami C, Lorrain S, Hornitschek P, and Fankhauser C (2010) 91, 29 66 Figure 2.2. Primary light reactions in the different classes of plant photoreceptors. Arabidopsis has five phytochrome-encoding genes (PHYA E), three cryptochrome genes (CRY1-3), two phototropingenes (PHOT1 and PHOT2), and three Zeitlupefamily genes (ZTL, FKF1, LKP2). The protein domain organization of the different photoreceptors is schematized with the position of chromophore attachment marked with an arrowhead. Phytochromeshave an N-terminal extension of unknown fold (NT) followed by a PAS (Per, ARNT, Sim) domain, a GAF (cgmp phosphodiesterase/adenylcyclase/fhla) domain that binds the chromophore, a PHY domain (related to PAS domains), and a C-terminus that is composed of two PAS domains and a histidine-kinase-related domain (HKRD). Cryptochromeshave a photolyase homology region (PHR) and a C-terminus of unknown structure (CT). Phototropinsare composed of two LOV (light, oxygen, voltage) domains in their N-terminus (LOV1 and LOV2) and a Ser/Thr protein kinase domain (KD). Members of the ZTL family have an N-terminal LOV domain, an F-box, and KELCH repeats. Phytochromeshave phytochromobilin (PΦB) as a chromophore that is covalently bound to an invariant Cys residue in a GAF domain and photoreversiblyswitches between the Pr and the Pfr conformers upon isomerization of a double bond between the (A) and (B) rings of the tetrapyrrol. Cryptochromeshave two chromophores; flavinadenine nucleotide (FAD) and a pterin acting as an antenna pigment. The light reactions from FAD to flavin adenine dinucleotide (FADH-) or neutral radical form of FADH (FADH*) are depicted on the figure (adapted from Bouly et al. (2007)). Phototropins use flavin mononucleotide (FMN) as a chromophore. In darkness, each of the LOV domains noncovalentlybinds to FMN. After absorbing UV-A/blue light, an invariant Cys in the LOV domain covalently binds to FMN. This activated state rapidly returns to the dark state. Zeitlupefamily light sensors also have a LOV photosensorydomain. In contrast to the phototropins, these LOV domains remain in the light-activated state for a long time (hours). CONSTANS wird auf mrna- und Protein-Ebene reguliert (eine molekulare Erklärung für das external coincidencemodell in Arabidopsis) Constans (CO) als Schlüsselfaktor der photoperiodischen Wahrnehmung. CO-Expressionwird durch die circadiane Uhrgesteuert und zeigtim Kurztag diurnale Spitzen während der Nacht. Aber: Im Dunkeln wird das CO-Protein permanent degradiert! Seine Funktion bleibt nur erhalten, wenn CO-mRNA vor Anbruch der Dunkelheit vorliegt (Fig. 5). Dies ist im Langtagder Fall, wenn die Lichtperiode mit dem Maximum der COmRNA-Expression zusammenfällt. (unterstützend wirkt, dass CO-mRNA im Langtag breitere Maxima aufweist). Das wiederum resultiert aus der Aktivität von FLAVIN-BINDING, KELCH REPEAT, F-BOX Protein (FKF1), das nachmittags (via PhyA, Cry2) hilft die Degradation von CO zu hemmen. Als Resultat akkumuliert das CO-Protein nur im Langtagund kann (zusammen mit HAP?) die Transkription von FLOWERING LOCUS T (FT) aktivieren Blühinduktion. Das FT-Protein wird aus den Blättern zum shoot apikal meristem (SAM) transportiert, wo es Blütenbildung auslöst. CO protein degraded CO protein stabilized Fig. 5. The clock-controlled variation in CO mrna levels is depicted with black curves, and CO protein is represented by red spheres (intact protein), or red split spheres (degraded protein). In short days CO mrna is mainly expressed in darkness, and the resulting protein is degraded partly through the action of SPA1, 3, and 4. The protein produced in the morning is also degraded, a process that is dependent of active PhyB. In long days, the repression of CO mrna by CDF1 is released through the action of FKF1 and GI, resulting in an elevated CO expression in the afternoon. The translated CO protein is stabilized in light through the action of PhyA and Cry2. It has been hypothesized that the stable CO protein forms a complex with HAP (haem activator protein) that binds to the FT promoter. The FT protein is transported through the phloem to the SAM (shoot apical meristem) to induce flowering. Genes controlled by the circadian clock are indicated by a clock symbol. FROM: Lagercrantz (2009). At the end of the day: A common molecular mechanism for photoperiod responses in plants? J. Exp. Botany, 60: 2501 2515. 22

Beispiel: Starke Vernetzung von Licht- und Hormon-Antworten Figure 2 Schematic summary of brassinosteroid (BR) regulation of the light-signaling network. The diagram shows signal transduction pathways linking photoreceptors to transcription factors and developmental responses. Arrows and bar-ended lines represent activation and inhibition, respectively. Light-signaling components encoded by BRBTs are in bold. The BR-activated and BR-repressed genes are in red and blue, respectively. PIF1, PIF4, and HY5 share common target genes with BZR1 and are marked by a yellow background. BR promotion of seed germination is likely mediated by repression of SPATULA (SPT ), which encodes a bhlh factor that represses seed germination and cotyledon expansion (57, 99), and by coregulation of common target genes with PIL5/PIF1 (95, 113). BR inhibition of seedling photomorphogenesis is correlated with BZR1 repression of the B-box factor BZS1 (24), two subfamilies of GATA factors (GATA2/GATA4, and GNC/GNL) (86, 105), two HLH factors (HFR1 and PAR1) (23, 41), and GLK1 and GLK2 (26), as well as BR activation of MYC2 (29), GBF2, and GBF3 (56), the PACLOBUTRAZOL RESISTANT (PRE) family of HLH factors (150), and OBP3 (56, 136). Abbreviation: TF, transcription factor. From: ANNUAL REVIEWS - Genetics Zusammenfassung Licht wird von Pflanzen durch verschiedene Rezeptoren wahrgenommen (sogenannte Photorezeptoren): Phytochrome (Phy A, Phy B-E) Cryptochrome (Cry, Nph, Phot) UV-A, UV-B Signalkaskaden (die untereinander vernetzt sein können) leiten die Lichtinduzierten Signale in den Zellkern weiter. Dort kommt es zu einer Umsteuerung des genetischen Programms (Transkription + Translation Expressionsänderungen). Diese können wiederum mit Mechanismen auf anderen Regulationsebenen verschaltet sein, via circadiane Regelkreise, Protein-Degradation (z.b. von Constans, clock Proteinen oder andere Repressoren). 23