MARTIN-LUTHER-UNIVERSITÄT HALLE-WITTENBERG Funktionelle Analyse des Typ-III-Effektors AvrBs3 und homologer Proteine aus Xanthomonas campestris DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTÄT I - BIOWISSENSCHAFTEN DER MARTIN-LUTHER-UNIVERSITÄT HALLE-WITTENBERG von Sabine Kay geboren am 30.06.1977 in Dessau Gutachterin bzw. Gutachter: 1. Prof. Dr. U. Bonas 2. Prof. Dr. R. Eichenlaub 3. Prof. Dr. D. Scheel Halle/Saale, 25.04.2008 urn:nbn:de:gbv:3-000013574 [http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3ade%3agbv%3a3-000013574]
I Teile dieser Arbeit wurden in Fachzeitschriften publiziert: Kay, S., S. Hahn, E. Marois, G. Hause, and U. Bonas. 2007. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science 318:648-651. Kay, S., J. Boch, and U. Bonas. 2005. Characterization of AvrBs3-like effectors from a Brassicaceae pathogen reveals virulence and avirulence activities and a protein with a novel repeat architecture. Mol. Plant-Microbe Interact. 18:838 848. Thieme, F., R. Koebnik, T. Bekel, C. Berger, J. Boch, D. Büttner, C. Caldana, L. Gaigalat, A. Goesmann, S. Kay, O. Kirchner, C. Lanz, B. Linke, A. C. McHardy, F. Meyer, G. Mittenhuber, D. H. Nies, U. Niesbach-Klösgen, T. Patschkowski, C. Rückert, O. Rupp, S. Schneiker, S. C. Schuster, F.-J. Vorhölter, E. Weber, A. Pühler, U. Bonas, D. Bartels, and O. Kaiser. 2005. Insights into genome plasticity and pathogenicity of the plant pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria revealed by the complete genome sequence. J. Bacteriol., 187:7254-7266.
II ZUSAMMENFASSUNG Das Typ-III-Effektorprotein AvrBs3 aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria wird über das Typ-III-Sekretionssystem in die Pflanzenzelle transloziert. AvrBs3 wird in den Kern der Pflanzenzelle importiert, induziert die Transkription von pflanzlichen Genen (upa, upregulated by AvrBs3 ) und löst eine Hypertrophie, d.h. Vergrößerung, von Mesophyllzellen aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 12 neue upa-gene mittels subtraktiver Hybridisierung aus Paprika isoliert. upa20, das einen Transkriptionsfaktor der bhlh-familie kodiert, erwies sich als notwendig und hinreichend für die Auslösung der Hypertrophie in verschiedenen Solanaceen. Upa20 induziert die Transkription zweier in früheren Arbeiten isolierter upa-gene, die ein α-expansin bzw. einen Transkriptionsfaktor kodieren. Mittels β- Glucuronidase als Reporter wurde die AvrBs3-responsive Region des upa20-promotors auf 55 bp eingegrenzt. Der Sequenzvergleich mit anderen upa-promotoren führte zur Identifizierung der upa-box, eines ca. 20 bp langen DNA-Motivs, das die AvrBs3-abhängige Aktivierung von Genen vermittelt. Dieses Motiv wurde durch upa20-promotormutanten näher charakterisiert. AvrBs3 nutzt einen alternativen Transkriptionsstart, der stromabwärts des für die Basalexpression hauptsächlich genutzten Startpunkts lokalisiert ist. Die upa-box befindet sich innerhalb von 100 bp stromaufwärts des Transkriptionsstarts, der in Anwesenheit von AvrBs3 verwendet wird. Die Gene upa14 und upa19 werden auch durch das AvrBs3-Derivat AvrBs3Δrep16 induziert, dem vier der 17,5 zentralen Sequenzwiederholungen in AvrBs3 fehlen. AvrBs3Δrep16 erkennt eine mutierte Version der upa-box im upa20-promotor. Um für zukünftige Analysen der AvrBs3-Familie auch die Modellpflanze Arabidopsis thaliana bzw. verwandte Spezies nutzen zu können, wurden im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die AvrBs3-Homologen Hax2, Hax3 und Hax4 aus dem Brassicaceen-Pathogen X. campestris pv. armoraciae analysiert. Ihre Typ-III-abhängige Translokation in die Pflanzenzelle wurde über Domänenaustauschexperimente mit AvrBs3 gezeigt. Alle drei hax-gene tragen zur Ausbildung Krankheits-assoziierter Chlorosen und Nekrosen in Radieschenpflanzen bei, wobei hax2 den stärksten Einfluss auf die Symptombildung hatte. Weiterhin löste hax2 bei transienter Expression in Arabidopsis thaliana Col-0 eine Akkumulation von Anthocyanen aus. Hax3 und Hax4, aber nicht Hax2, zeigen außerdem Avirulenzaktivität in Tomate, wo sie durch das Resistenzprotein Bs4 erkannt werden.
III SUMMARY The type III effector protein AvrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria is translocated into the plant cell by the type III secretion system. AvrBs3 is imported into the plant cell nucleus, induces the transcription of plant genes (upa, upregulated by AvrBs3) and elicits a hypertrophy, i.e. enlargement, of mesophyll cells in several solanaceous plants. In this work, 12 new upa genes were isolated from pepper by subtractive hybridization. upa20 encodes a transcription factor of the basic helix-loop-helix family and was necessary and sufficient for the elicitation of hypertrophy in several solanaceous plants. Upa20 induces the transcription of two previously isolated upa genes encoding an α-expansin and a transcription factor, respectively. Using β-glucuronidase as a reporter the AvrBs3-responsive region in the upa20 promoter could be restricted to 55 bp. Sequence comparisons with other upa promoters led to the identification of the upa box, a DNA motif of approximately 20 bp, which mediates AvrBs3-dependent gene activation. This motif was characterized further by upa20 promoter mutants. AvrBs3 uses an alternative transcription initiation site which is located upstream of the transcription start generally used for basal expression. The upa-box is localized within 100 bp upstream of the transcription start used in the presence of Avrbs3. The genes upa14 and upa19 are induced also by the AvrBs3 derivative AvrBs3Δrep16 which lacks four out of the 17.5 central repeats in AvrBs3. AvrBs3Δrep16 recognizes a mutated version of the upa box in the upa20 promoter. To allow the use of the model plant Arabidopsis thaliana and related species in future analyses of the AvrBs3 family, in the second part of this work the AvrBs3 homologs Hax2, Hax3 and Hax4 from the crucifer pathogen X. campestris pv. armoraciae were analyzed. Their type III-dependent translocation into the plant cell was shown by domain swap experiments. All three hax genes contribute to the formation of disease-associated chlorosis and necrosis in radish plants with hax2 having the strongest influence on symptom formation. In addition, transiently expressed hax2 caused an accumulation of anthocyanins in Arabidopsis thaliana Col-0. Hax3 and Hax4, but not Hax2, show avirulence activity in tomato where they are recognized by the resistance protein Bs4.
IV DANKSAGUNG Mein besonderer Dank gilt Frau Professor Dr. Ulla Bonas für die Möglichkeit, dieses interessante Thema zu bearbeiten. Für ihre Unterstützung bei praktischen und theoretischen Problemen jeglicher Art und ihr reges Interesse am Voranschreiten der Experimente bin ich sehr dankbar. Ein herzliches Dankeschön auch an Jens Boch, Ralf Koebnik, Simone Hahn, Daniela Büttner, Ernst Weber und Oliver Kirchner für die vielen Diskussionen zu Arbeitsthemen und darüber hinaus, ihre Hilfsbereitschaft und Freundschaft. Ralf sei an dieser Stelle auch für die abwechslungsreichen Wanderausflüge gedankt und Simone für die Überredung zu mehr sportlicher Betätigung. Bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Bonas bedanke ich mich für die erhaltene Unterstützung und die freundliche Arbeitsatmosphäre, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Angelika, Carola, Hannelore und Marina danke ich für die ausgezeichnete technische Assistenz und Bianca für ihren großen grünen Daumen bei der Anzucht zahlreicher von mir gequälter Pflanzen. Der großen Kooperatorin Simone Hahn danke ich auch für ihre unschätzbaren Beiträge zu den Publikationen. Ein großes Dankeschön auch an Eric Marois für seine Ermutigungen, besonders zu Beginn der Arbeit, und für die interessanten Hinterlassenschaften, die ich weiter untersuchen konnte. Vielen Dank auch an Gerd Hause für die fruchtbare Kooperation und die wunderbaren Mikroskopiebilder. Außerdem möchte ich allen Korrekturlesern der Publikationen für ihre hilfreichen Kommentare danken. Bei Jens Boch und Frank Thieme bedanke ich mich ganz herzlich für das Korrekturlesen der Arbeit und die konstruktiven Ratschläge. Mein aufrichtiger Dank gilt meiner Familie für ihre immerwährende Liebe und Unterstützung. Ganz besonders danke ich Frank für die beständige und geduldige seelisch-moralische Unterstützung, insbesondere in der Endphase der Arbeit.
V INHALTSVERZEICHNIS Zusammenfassung... II Summary... III Danksagung... IV Inhaltsverzeichnis... V Abbildungs- und Tabellenverzeichnis... VII Abkürzungsverzeichnis...VIII 1. Einleitung... 1 1.1. Virulenzmechanismen Gram-negativer phytopathogener Bakterien... 1 1.1.1. Das Typ-III-Sekretionssystem... 2 1.2. Die Rolle von Typ-III-Effektoren in der Interaktion mit der Pflanze... 5 1.2.1. Die Suppression der pflanzlichen Basalabwehr... 5 1.2.2. Die Resistenzgen-vermittelte Erkennung von Typ-III-Effektoren... 6 1.2.3. Die Unterdrückung der R-Gen-vermittelten Resistenz... 7 1.2.4. Der Einfluss von Typ-III-Effektoren auf das Transkriptom der Wirtszelle... 9 1.3. Die Gattung Xanthomonas... 10 1.3.1. X. campestris pv. vesicatoria... 11 1.3.2. X. campestris pv. armoraciae... 11 1.4. Die AvrBs3-Effektor-Familie... 12 1.4.1. Struktur und mögliche Wirkungsweise von AvrBs3 und verwandter Proteine... 12 1.4.2. Virulenzfunktionen von AvrBs3-Familienmitgliedern... 15 1.5. Thematik der Arbeit und Vorarbeiten... 17 2. Ergebnisse... 18 2.1. Analyse der Virulenzfunktion des Typ-III-Effektors AvrBs3 aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria... 18 2.1.1. Identifizierung und Charakterisierung eines durch AvrBs3 direkt induzierten Transkriptionsfaktors aus Paprika... 18 2.1.1.1. Publikation... 18 2.1.1.2. Anlagen zur Publikation... 22 2.1.1.3. Zusammenfassung der Ergebnisse... 35
VI 2.1.2. Charakterisierung der Erkennungsspezifität von AvrBs3 und dessen Derivat AvrBs3Δrep16... 36 2.1.2.1. Manuskript... 36 2.1.2.2. Zusammenfassung der Ergebnisse... 58 2.1.3. Zusätzliche Ergebnisse... 59 2.2. Analyse von AvrBs3-Homologen aus Xanthomonas campestris pv. armoraciae... 60 2.2.1. Publikation... 60 2.2.2. Zusammenfassung der Ergebnisse... 71 2.2.3. Zusätzliche Ergebnisse... 72 2.3. Die Analyse der Genomsequenz des Xcv-Stammes 85-10... 73 2.3.1. Publikation... 73 2.3.2. Zusammenfassung der Ergebnisse... 86 2.4. Eigenanteil an den Publikationen und dem Manuskript... 87 3. Diskussion und Ausblick... 89 3.1. AvrBs3 induziert eine Hypertrophie durch Manipulation des Wirtstranskriptoms... 89 3.1.1. Upa20 ist der Schlüsselregulator der durch AvrBs3 ausgelösten Hypertrophie... 89 3.1.1.1. Upa20 induziert die Expression von upa7 und upa13... 91 3.1.2. Die mögliche Funktion anderer upa-gene... 93 3.2. Der Mechanismus der Geninduktion durch AvrBs3... 95 3.2.1. Die upa-box ist die AvrBs3-Bindestelle... 95 3.2.2. Die Repeats und der C-Terminus von AvrBs3 sind in die Geninduktion involviert... 97 3.2.3. Wirkt AvrBs3 als TATA-Bindeprotein?... 99 3.2.4. Agiert AvrBs3 als regulatorischer Transkriptionsfaktor?... 101 3.2.5. Der direkte Eingriff in die Wirtstranskription ist nicht auf AvrBs3 beschränkt... 102 3.3. AvrBs3 und die Hax-Proteine tragen vermutlich zur Virulenz von Xanthomonas bei... 103 3.3.1. Die Rolle der Hypertrophie in der Pflanzen-Pathogen-Interaktion... 103 3.3.2. Die hax-gene fördern die Bildung von Krankheitssymptomen... 105 3.3.3. Hax2 induziert eine Akkumulation von Anthocyanen in Arabidopsis... 106 3.4. Die Virulenzfunktion als Schlüssel zur Erzeugung dauerhafterer Resistenzen... 107 4. Literaturverzeichnis... 109
VII ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS Abbildungen: Abbildung 1-1: Die Rolle von Typ-III-Effektoren in der Pflanzen-Bakterien- Interaktion.... 4 Abbildung 1-2: Zickzack-Modell der Ko-Evolution von Pflanzen und Gram-negativen bakteriellen Pathogenen.... 8 Abbildung 1-3: Durch Xanthomonas spp. ausgelöste Krankheitssymptome in Nutzpflanzen.... 10 Abbildung 1-4: Proteinstruktur, Avirulenz- und Virulenzaktivität des Typ-III-Effektors AvrBs3 aus Xcv.... 13 Abbildung 1-5: Modell der Wirkungsweise von AvrBs3.... 14 Abbildung 2-1: Upa20 aktiviert die Transkription von upa13.... 59 Abbildung 2-2: Die transiente Expression von hax2 führt zur Akkumulation von Anthocyanen in Arabidopsis.... 72 Abbildung 3-1: Modell der AvrBs3-Funktion in Paprika.... 94 Abbildung 3-2: Promotorpolymorphismen von Xa27 und Os8N3 in verschiedenen Reislinien.... 96 Abbildung 3-3: Modell der molekularen Wirkungsweise von AvrBs3 am Beispiel der upa20-induktion.... 100 Tabellen: Tabelle 1-1: Tabelle 3-1: Tabelle 3-2: Mitglieder der AvrBs3-Familie mit bekannter Virulenz- und/oder Avirulenzaktivität.... 16 bhlh-transkriptionsfaktoren aus A. thaliana mit bekannter oder vermuteter Funktion bei der Zellelongation.... 90 Analyse von upa-gen-promotoren auf Präsenz von upa- und E-Boxen.... 92
VIII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A AAD ABA As avr, Avr bhlh bp C CDS Col-0 COG DNA dpi ECW EMSA EPS ERF FMO G GFP GRF GTF GUS hax, Hax hpi HR hrc hrp kb LPS LRR MAMP MAPK Mb mrna NBS NLS PAMP pcbp Adenin(nukleotid) acidic activation domain, saure Transkriptionsaktivierungsdomäne abscisic acid, Abscisinsäure Aminosäuren Avirulenz basic helix-loop-helix Basenpaare Cytosin(nukleotid) cell death suppression, Unterdrückung von Zelltod Columbia, Ökotyp von Arabidopsis thaliana cluster of orthologous genes desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure days post infiltration, Tage nach Infiltration Early Californian Wonder, Kultivar von Capsicum annuum electromobility shift assay extrazelluläres Polysaccharid ethylene response factor Flavin-abhängige Monooxygenase Guanin(nukleotid) grün fluoreszierendes Protein growth-regulating factor genereller Transkriptionsfaktor β-glucuronidase Homolog von AvrBs3 in Xanthomonas hours post infiltration, Stunden nach Infiltration hypersensitive Reaktion hrp conserved hypersensitive Reaktion und Pathogenität Kilobasenpaare Lipopolysaccharid leucine-rich repeat microbe-associated molecular pattern, Mikroben-assoziiertes molekulares Muster Mitogen-aktivierte Proteinkinase Megabasenpaare messenger RNA, Boten-RNA Nukleotidbindestelle nuclear localization signal, Kernlokalisierungssignal pathogen-associated molecular pattern, Pathogen-assoziiertes molekulares Muster polyc-bindeprotein
IX PCR polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion PM Plasmamembran PR pathogenesis-related pv. Pathovar R, R Resistenz RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure RT-PCR reverse transcribed PCR, reverse Transkription und PCR spp. Spezies T Thymin(nukleotid) T3SS Typ-III-Sekretionssystem TAF TBP-assoziierter Faktor TBP TATA-Bindeprotein upa, Upa upregulated by AvrBs3 VIGS Virus-induziertes Gensilencing Xac Xanthomonas axonopodis pv. citri Xca Xanthomonas campestris pv. armoraciae Xcm Xanthomonas campestris pv. malvacearum Xcv Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Xoo Xanthomonas oryzae pv. oryzae