1.1. Virulenzmechanismen Gram-negativer phytopathogener Bakterien

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1 EINLEITUNG 1 1. EINLEITUNG Pflanzenkrankheiten, die durch verschiedenste Phytopathogene wie Bakterien, Pilze und Nematoden hervorgerufen werden, führen jedes Jahr zu hohen Ernteverlusten. Obwohl sich Pflanzen gegen die Mehrzahl potentieller Krankheitserreger erfolgreich verteidigen können (inkompatible Interaktion), gelingt es spezialisierten Pathogenen, sich im Wirt zu vermehren und Krankheitssymptome hervorzurufen (kompatible Interaktion). Aufgrund ihrer guten experimentellen Zugänglichkeit wurden viele Gram-negative Bakterien, z.b. der Gattungen Pseudomonas, Xanthomonas, Ralstonia, Erwinia und Agrobacterium, als Modellorganismen in der molekularbiologischen Analyse der Pflanzen-Pathogen-Interaktion etabliert. Bakterielle Pathogene dringen gewöhnlich durch natürliche Öffnungen (Stomata, Hydathoden), Wunden oder Vektor-vermittelt über Pflanzensaft saugende Insekten in den Interzellularraum der Pflanze ein, wo sie sich zu hohen Zelldichten vermehren. Um eine Pflanze erfolgreich kolonisieren zu können, müssen sie zahlreiche Schutzmechanismen überwinden. Dazu zählen sowohl konstitutive mechanische und chemische Barrieren wie die Kutikula, Zellwände oder antimikrobielle Sekundärmetabolite, als auch Abwehrreaktionen, die durch die Erkennung des Pathogens in der Pflanze induziert werden (180). Phytopathogene Bakterien haben daher eine Reihe von Virulenzfaktoren evolviert Virulenzmechanismen Gram-negativer phytopathogener Bakterien Gram-negative Bakterien haben verschiedenste Virulenzfaktoren entwickelt, die in den einzelnen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen von unterschiedlicher Wichtigkeit sind. Viele phytopathogene Bakterien sind z.b. von einer Hülle aus extrazellulärem Polysaccharid (EPS) umgeben, das multiple Funktionen erfüllt. Aufgrund seiner starken Hydratisierung bietet es Schutz vor Austrocknung und gegen hydrophobe Moleküle, sein anionischer Charakter ermöglicht die Anreicherung von Nährstoffen und Immobilisierung toxischer Elemente, und seine adhäsiven Eigenschaften erlauben die Anheftung an biologische Oberflächen (44). EPS kann pflanzliche Abwehrreaktionen unterdrücken (259) und zur Symptombildung sowie zum bakteriellen Wachstum in planta beitragen (55). Für eine erfolgreiche Infektion der Pflanze ist häufig auch die Motilität der Bakterien von Bedeutung, die durch Flagellen (40, 222, 223) und Typ-4-Pili (124, 154, 236) vermittelt wird. Adhäsine unterstützen die Virulenz, indem sie z.b. zur Anlagerung an Wirtszellen beitragen (194, 197) und zusammen mit EPS und Typ-4-

2 EINLEITUNG 2 Pili die Bildung bakterieller Aggregate fördern (124, 153, 197). Letztere sind für das Überleben der Bakterien besonders während epiphytischer Phasen von Bedeutung (153). Pflanzenpathogene Bakterien können auch eine Reihe von Stoffen sekretieren, die gegen den Wirt gerichtet sind. Dazu zählen Phytotoxine (211), Phytohormone (230) sowie sekretierte Proteine und Peptide. Durch Typ-I-Sekretionssysteme werden z.b. Proteasen und Lipasen sekretiert (23). Das Typ-II-Sekretionssystem sekretiert unter anderem hydrolytische Enzyme zum Abbau der pflanzlichen Zellwand (201), während durch Typ-III- Sekretionssysteme hauptsächlich Effektorproteine direkt in die pflanzliche Zelle transloziert werden (221). Typ-IV-Sekretionssysteme übertragen sowohl Proteine als auch DNA in die Wirtszelle (37) Das Typ-III-Sekretionssystem Das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor in allen bislang untersuchten Gram-negativen phytopathogenen Bakterien (99, 221), mit Ausnahme von Agrobacterium tumefaciens (247) und Xylella fastidiosa (58), und auch in zahlreichen Tierund Humanpathogenen sowie in Symbionten wie Rhizobium spp. von Bedeutung (99, 221). Beim T3SS erfolgt der Transport von Proteinen ohne Prozessierung und periplasmatische Zwischenstufen über beide bakterielle Membranen in den Apoplasten bzw. direkt in das Zytosol der pflanzlichen Zelle. Das T3SS umfasst (i) den Basalapparat, der die innere und äußere bakterielle Membran durchspannt und dem Basalkörper des Flagellums ähnelt (221), (ii) den Hrp-Pilus, einen extrazellulären Appendix, der vermutlich als Tunnel zum Transport ungefalteter Proteine fungiert (99, 139) sowie (iii) das Translokon, welches wahrscheinlich eine Pore in der pflanzlichen Plasmamembran darstellt, die den Übertritt von Effektorproteinen ins Zytoplasma der Pflanzenzelle ermöglicht (32)(Abb. 1-1). Das T3SS pflanzenpathogener Bakterien setzt sich aus ungefähr 20 verschiedenen Proteinen zusammen. Diese werden von den hrp-genen (Hypersensitive Reaktion und Pathogenität) kodiert, deren Expression in der Pflanze induziert wird (33). hrp-mutanten sind nicht in der Lage, sich in der Pflanze effizient zu vermehren oder Krankheitssymptome hervorzurufen und lösen auch keine Resistenzgen-vermittelte Abwehr (Kapitel 1.2.2) in einer resistenten Pflanze aus (28, 132, 152, 179). Die hrp-gene liegen jeweils in einem Gencluster vor. Diese Gencluster werden basierend auf Genanordnung, Sequenzähnlichkeit und Regulation in zwei Gruppen eingeteilt. Zur Gruppe I gehören die hrp-gencluster von Pseudomonas syringae, Erwinia und Panthoea spp., während die von Xanthomonas spp. und

3 EINLEITUNG 3 Ralstonia solanacearum zur Gruppe II zählen (33). Elf hrp-gene kodieren Proteine, die in den T3SS tierpathogener Bakterien konserviert sind, und werden daher als "hrp konserviert" ("hrp conserved", hrc) bezeichnet (89). Die Hrc-Proteine bilden vermutlich den Basalapparat des T3SS (99, 221). Neun von ihnen zeigen auch Homologie zu Komponenten des Flagellarapparates, der sich vermutlich aus dem gleichen evolutionären Vorläufer wie das T3SS entwickelt hat (99, 221). Im Gegensatz zu den Hrc-Proteinen zeigen die Hrp-Proteine verschiedener Spezies keine oder nur geringe Sequenzidentität zueinander (99). Zu den Proteinen, die Typ-III-abhängig sekretiert, aber nicht in die Pflanzenzelle transloziert werden, zählen extrazelluläre Komponenten des T3SS (Piline und Translokonproteine) und Harpine. Bei letzteren handelt es sich um hitzestabile, Glycin-reiche Proteine ohne Cysteine, die vermutlich die Penetration der Zellwand durch den Hrp-Pilus oder den Translokationsprozess in die Pflanzenzelle unterstützen (99). Die meisten Substrate des T3SS sind jedoch Effektorproteine, die direkt ins Zytoplasma der Wirtszelle injiziert werden. Die Signale für die Sekretion und Translokation sind im 5 -Ende der Effektorgene kodiert, aber ihre genaue Natur ist unbekannt (172, 202). Obwohl auch eine Kodierung des Sekretionssignals in der mrna diskutiert wird (10, 172), gibt es vor allem eine Reihe von Gemeinsamkeiten in den N-Termini von T3SS-Substraten. Diese sind gewöhnlich amphipatisch, Serin- und Glycin-reich, enthalten fünf N-terminale hydrophile Reste und keine sauren Reste innerhalb der ersten 12 Aminosäuren (99, 221). Für die effiziente Sekretion werden in manchen Fällen Typ-III-Chaperone benötigt (33), die spezifisch mit Translokonproteinen (187) oder einem bzw. wenigen Effektoren interagieren (17, 122, 206, 242) oder die als globale Typ-III-Chaperone eine Vielzahl von Effektoren binden (34, 35). Typ-III-Chaperone erhöhen die Stabilität ihrer Substrate im bakteriellen Zytoplasma (77, 158, 206) und/oder halten sie in einem partiell ungefalteten und damit sekretionskompetenten Zustand (209). Typ-III-Chaperone können auch an der Rekrutierung der T3SS-Substrate zum Sekretionsapparat beteiligt sein (35).

4 EINLEITUNG 4 LPS Apoplast Flagellum Typ-III- Effektoren Gram - - Pathogen Basalapparat Zellwand MAMP- Rezeptoren T3SS Pilus Translokon PM Zytosol R-Protein Pflanzenzelle Zielprotein Abwehr Suppression der Abwehr Veränderung der Physiologie der Wirtszelle - Verstärkung der Zellwand - antimikrobielle Substanzen - ROS - lokaler Zelltod -... bakterielles Wachstum Freisetzung von Wasser und Nährstoffen andere Effekte Krankheitssymptome Restriktion von bakteriellem Wachstum und Verbreitung Verbreitung des Pathogens Abbildung 1-1: Die Rolle von Typ-III-Effektoren in der Pflanzen-Bakterien-Interaktion. Das Typ-III- Sekretionssystem (T3SS) transloziert Effektorproteine über beide bakterielle Membranen und die Plasmamembran der Pflanze (PM) direkt ins pflanzliche Zytosol, wo sie die Wirtszellphysiologie verändern. Dies kann zur Suppression pflanzlicher Abwehrreaktionen führen, die entweder durch MAMPs ( microbeassociated molecular patterns ) oder die Resistenz (R)-Protein-vermittelte Erkennung anderer Effektoren ausgelöst werden. MAMPs sind z.b. Bestandteile von Lipopolysacchariden (LPS) und des Flagellums, die Rezeptor-basiert an der PM der Pflanze erkannt werden. Durch die Unterdrückung der Abwehr und möglicherweise durch die Freisetzung von Wasser und Nährstoffen sowie andere Effekte fördern die Effektoren die bakterielle Vermehrung im Apoplasten, die Auslösung von Krankheitssymptomen und letztlich die Verbreitung des Pathogens. Abbildung modifiziert nach Kunkel und Chen (140).

5 EINLEITUNG Die Rolle von Typ-III-Effektoren in der Interaktion mit der Pflanze Einzelne Stämme von X. campestris und P. syringae translozieren ca. 15 bis 35 Effektoren (150, 226), für den sequenzierten Stamm von R. solanacearum wird von mehr als 40 Effektorproteinen ausgegangen (46). Obwohl die Effektoren essentiell für die Virulenz der Pathogene sind, d.h. die Vermehrung im Apoplasten und die Auslösung von Krankheitssymptomen, erschwert die funktionelle Redundanz häufig die Bestimmung des Beitrags eines einzelnen Effektors (140). Einige wenige Effektoren stellen Hauptvirulenzfaktoren dar, deren Deletion zumindest in bestimmten Wirten mit einem nahezu vollständigen Verlust der bakteriellen Virulenz einhergeht (11, 19, 61, 123, 196, 214, 233, 253). Es gibt verschiedene Möglichkeiten, wie Effektoren wirken können (Abb. 1-1). Weit verbreitet scheint die Schaffung eines Pathogen-freundlichen apoplastischen Milieus durch die Unterdrückung pflanzlicher Resistenz-mechanismen zu sein (47) Die Suppression der pflanzlichen Basalabwehr Die Basalresistenz der Pflanze beruht auf der Rezeptor-basierten Detektion konservierter mikrobieller Strukturen an der pflanzlichen Plasmamembran, sogenannter Pathogen- oder allgemeiner Mikroben-assoziierter molekularer Muster ("pathogen/microbe-associated molecular patterns", PAMPs/MAMPs) (25). Dies sind in der Regel Moleküle, die im Wirt nicht vorhanden sind und daher als "nicht-selbst" erkannt werden, z.b. Lipopolysaccharide, der Hauptbestandteil der bakteriellen äußeren Membran (261), oder abundante bakterielle Proteine wie Flagellin, die Hauptuntereinheit des Flagellums (67), Elongationsfaktor Tu (141), Kälteschockproteine (66) und Harpine (13, 98, , 144, 147, 243). Aber auch Bestandteile der pflanzlichen Zellwand, die durch mikrobiellen Abbau freigesetzt werden, können von der Pflanze erkannt werden (241). MAMP-Rezeptoren bestehen häufig aus einer extrazellulären Ligandenbindedomäne aus Leuzin-reichen Sequenzwiederholungen ( leucinerich repeats, LRRs), einer Transmembrandomäne und einer zytoplasmatischen Kinasedomäne für die Signalübermittlung (25). Die weitere Signalübertragung erfolgt unter anderem über Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Kaskaden (14, 118, 144, 182, 189, 263) sowie WRKY- und andere Transkriptionsfaktoren (14, 64, 65). Auch Ionenflüsse über die Plasmamembran (insbesondere Ca 2+ ), die Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies ("reactive oxygen species", ROS), Stickstoffmonooxid und Ethylen sind in die Signalweiterleitung involviert, die letztlich in Änderungen der Transkription zahlreicher Gene resultiert

6 EINLEITUNG 6 (25, 182). Die Basalabwehr manifestiert sich in der Verstärkung der pflanzlichen Zellwände durch Einlagerung von Kallose, Lignin und phenolischen Verbindungen, die vor dem Abbau durch das Pathogen schützt und den Austritt von Wasser und Nährstoffen aus den Pflanzenzellen beschränkt, sowie in der Synthese antimikrobieller Substanzen wie ROS, Phytoalexinen und PR-Proteinen ( pathogenesis-related )(25, 70, 83). In manchen Fällen, z.b. nach Harpin-Erkennung, kann auch eine HR-ähnliche Reaktion (hypersensitive Reaktion) ausgelöst werden (181). Die HR ist eine Form des programmierten Zelltods, der schnell und lokal an der Infektionsstelle auftritt und die weitere Verbreitung des Pathogens beschränkt (84, 136). Die Beobachtung, dass T3SS-defiziente Bakterienmutanten im Gegensatz zu Wildtyp- Stämmen basale Abwehrreaktionen in der Pflanze auslösen, führte zu der Vermutung, dass Typ-III-Effektoren die Basalresistenz unterdrücken können (30, 97, 111). Tatsächlich wird z.b. die Kalloseeinlagerung in Zellwände durch verschiedene Effektoren supprimiert (52, 54, 92, 93, 134, 262), und die Expression der Effektorgene in der Pflanze kann T3SS-defizienten Mutanten ein besseres Wachstum ermöglichen (52, 93, 134, 149) Die Resistenzgen-vermittelte Erkennung von Typ-III-Effektoren Konfrontiert mit Typ-III-Effektoren, die über die Suppression der Basalabwehr die bakterielle Vermehrung im Apoplasten ermöglichen, haben Pflanzen Resistenzgene (R) evolviert, die die spezifische Erkennung einzelner Effektorproteine vermitteln (Abb. 1-1). Letztere werden auch als Avirulenzproteine (Avr) bezeichnet. Nach der Gen-für-Gen-Hypothese erfordert die R- Gen-vermittelte Resistenz die Präsenz eines R-Gens in der Pflanze und eines korrespondierenden avr-gens im Pathogen (68). Es gibt hauptsächlich zwei Modelle, die den molekularen Mechanismus der spezifischen Erkennung beschreiben. Das Rezeptor-Ligand- Modell geht von einer direkten Interaktion von Avr-Protein (Ligand) und R-Gen-kodiertem Rezeptor aus. Der Effektor PopP2 aus R. solanacarum interagiert z.b. direkt mit dem R- Protein RRS1 aus Arabidopsis (56). Dieses Modell erinnert an die Erkennung von MAMPs durch MAMP-Rezeptoren im Rahmen der Basalresistenz (162). Die R-Gen-vermittelte Erkennung von bakteriellen Effektoren findet jedoch gewöhnlich innerhalb der pflanzlichen Zelle statt, während die MAMP-Erkennung an der Außenseite der Plasmamembran erfolgt (57, 120). Das zweite Modell der R-Gen-vermittelten Erkennung ist das guard -Modell (235). Dieses postuliert, dass das Avr-Protein nicht direkt mit dem R-Protein, sondern im Rahmen

7 EINLEITUNG 7 seiner Virulenzfunktion mit einem bestimmten Zielprotein ( pathogenicity target ) in der Wirtszelle interagiert. Das R-Protein erkennt den Avr/Zielprotein-Komplex bzw. eine Modifizierung des Zielproteins. Der Effektor AvrRpm1 aus P. syringae interagiert z.b. mit RIN4 aus Arabidopsis und induziert dessen Phosphorylierung (161). Diese Modifikation wird durch das R-Protein RPM1 erkannt und führt zur Auslösung der Abwehr (161). Das Guard- Modell erlaubt die Erkennung strukturell unterschiedlicher Avr-Proteine durch ein einziges R- Protein, sofern diese das gleiche Zielprotein modifizieren, als dessen Beschützer ("guard") das R-Protein agiert (235). So wird auch der Effektor AvrB, der nicht zur AvrRpm1- Proteinfamilie gehört (151), aber ebenfalls die Phosphorylierung von RIN4 induziert, durch RPM1 erkannt (161). Das Guard-Modell kann somit auch erklären, wie es einer Pflanze möglich ist, mit einer begrenzten Anzahl an R-Genen auf eine Vielzahl verschiedener Pathogene und Effektoren zu reagieren (57). Die meisten isolierten R-Gene kodieren Proteine, die eine konservierte Nukleotidbindestelle (NBS) und LRRs im C-Terminus besitzen (57). Auf Grund ihrer N- terminalen Struktur wird diese Klasse von R-Proteinen weiter unterteilt. TIR-NBS-LRR- Proteine besitzen eine N-terminale Domäne mit Homologie zu dem Toll-Protein aus Drosophila und dem Interleukin1-Rezeptor aus Säugetieren, die vermutlich sowohl in die Erkennung des Pathogen-Signals als auch in dessen Weiterleitung involviert ist (57). Die N- Termini von NBS-LRR-Proteinen ohne TIR-Domäne sind divers, enthalten jedoch häufig eine coiled coil -Domäne (57). Die Signalweiterleitung und -amplifizierung erfolgt unter anderem über MAPK-Kaskaden und WRKY-Transkriptionsfaktoren (64, 175, 189) und resultiert meist in der Auslösung der HR (84) Die Unterdrückung der R-Gen-vermittelten Resistenz Die Unterdrückung des Zelltods ("cell death suppression", CDS) stellt eine weit verbreitete Virulenzfunktion von Typ-III-Effektoren dar, wodurch die durch R-Gen-vermittelte Erkennung anderer Effektorproteine ausgelöste HR supprimiert wird (4, 72, 110, 112, 164, 231). Die Zysteinprotease AvrRpt2 aus P. syringae unterdrückt z.b. die durch AvrRpm1 und AvrB verursachte HR in resistenten Arabidopsis-Pflanzen, indem es ein Zielprotein der beiden Effektoren, RIN4, spaltet und dadurch dessen Degradation bewirkt (15, 128, 220). Der RIN4-Abbau verhindert die RPM1-vermittelte Erkennung von AvrRpm1 und AvrB (128). Allerdings hat RIN4 mit dem R-Protein RPS2 einen zweiten Beschützer, der die Aktivität von AvrRpt2 registriert und die HR auslöst (16, 161). Dies ist beispielhaft für das biologische

8 EINLEITUNG 8 Wettrüsten, als welches die Ko-Evolution von Pflanzen und phytopathogenen Bakterien interpretiert wird (120). Bakterielle Pathogene unterdrücken die durch MAMP-Erkennung aktivierte Basalabwehr mit Hilfe von Typ-III-Effektoren und können die Pflanze kolonisieren. Diese erkennt einzelne Effektoren in R-Gen-vermittelter Weise, was zur Abwehr der Bakterien und dem Schutz der Pflanze führt. Diese Abwehr wird wiederum durch andere Typ- III-Effektoren unterdrückt, die ihrerseits durch die nächste Generation von R-Genen erkannt werden (120). Diese Entwicklung ist im sogenannten Zickzack-Modell zusammengefasst (120)(Abb. 1-2). Oft können Typ-III-Effektoren neben der HR weitere Zelltodreaktionen in Pflanzen oder sogar in Hefe supprimieren, die z.b. durch das pro-apoptotische Mausprotein Bax (4, 112) bzw. durch Stress ausgelöst werden (4) oder die mit Krankheitssymptomen assoziiert sind (156). Das deutet auf konvergente Signalwege bei der Auslösung von Zelltod in der Pflanze hin, in die Effektoren an unterschiedlichen Stellen eingreifen. Krankheit Resistenz Basalabwehr HR MAMP- Erkennung MAMPs Typ-III- Effektoren Effektor- Erkennung Suppression der Basalabwehr Effektor- Erkennung Typ-III- Effektoren Suppression der R-Genvermittelten Abwehr Abbildung 1-2: Zickzack-Modell der Ko-Evolution von Pflanzen und Gramnegativen bakteriellen Pathogenen. Im ersten Schritt kommt es zur Rezeptorvermittelten Erkennung von MAMPs durch die Pflanze und der Etablierung der pflanzlichen Basalabwehr. Dadurch werden Wachstum und Verbreitung des Pathogens in der Pflanze beschränkt. Im zweiten Schritt translozieren die Bakterien Typ-III- Effektoren in die pflanzlichen Zellen, die mit der Basalabwehr interferieren und so die Besiedlung der Pflanze ermöglichen. Der dritte Schritt ist die R-Gen-vermittelte Erkennung eines einzelnen Effektors (blaues Hexagon) in der Pflanze. Dies führt zu einer verstärkten Abwehrreaktion, welche häufig mit der Auslösung der HR einhergeht. Im vierten Schritt ermöglichen der Verlust des erkannten Effektorproteins und/oder der Erwerb neuer Typ-III-Effektoren, z.b. durch horizontalen Gentransfer, dem Pathogen die Suppression der R-Gen-vermittelten Abwehr und erneute Kolonisierung der Pflanze. Durch Evolvierung neuer R-Gene kann die Pflanze wiederum andere, auch neu erworbene, Effektoren (rotes Hexagon) erkennen. Das Modell wurde verändert nach Jones und Dangl (120).

9 EINLEITUNG Der Einfluss von Typ-III-Effektoren auf das Transkriptom der Wirtszelle Eine der wichtigsten Regulationsebenen in der Interaktion mit Pathogenen ist die Transkription in der Pflanze. Sowohl inkompatible als auch kompatible Interaktionen führen zu umfangreichen Änderungen des Transkriptoms, was insbesondere durch Microarray- Studien in Arabidopsis und anderen Pflanzen gezeigt wurde (155, 224, 227, 229, 267). Bei erfolgreicher Abwehr des Pathogens werden z.b. Gene induziert, die MAMP-Rezeptoren, R- Proteine und WRKY-Transkriptionsfaktoren kodieren, oder deren Genprodukte antimikrobiell wirken (25, 64, 70). Die Aktivität vieler Typ-III-Effektoren reprimiert oder verzögert die Expression Abwehr-assoziierter Gene (52, 91, 93, 96, 112, 134, 149, 227, 229). Auch Gene für die Photosynthese werden durch Typ-III-Effektoren reprimiert (227, 229). Andererseits bewirken Effektoren die Induktion zahlreicher Pflanzengene, deren Genprodukte z.b. in Hormonantwort und -synthese oder in die Antwort auf abiotischen Stress involviert sind (43, 227, 229). Viele Typ-III-Effektoren beeinflussen die eukaryotische Transkription vermutlich indirekt, da sie nicht im Kern der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Mittels enzymatischer Aktivitäten, z.b. als Phosphothreoninlyase (262), Tyrosinphosphatase (63) oder mono-adp- Ribosyltransferase (71), können Typ-III-Effektoren pflanzliche Proteine posttranslational modifizieren und darüber z.b. in die Signalübertragung eingreifen. Manche Effektoren verändern die Stabilität ihrer Zielproteine über die kovalente Bindung von Ubiquitin, das bei Polyubiquitinierung als Signal für den Abbau durch das 26S-Proteasom dienen kann (12). Die E3-Ubiquitin-Ligase AvrPtoB aus P. syringae (3, 114) fördert auf diese Weise die Degradierung der Proteinkinase Fen in Tomate und verhindert damit die eigene Erkennung (199). Die Phosphothreoninlyase HopAI1 aus P. syringae inaktiviert über die Dephosphorylierung von MAPKs die Signalübertragung nach der Erkennung von MAMPs und unterbindet damit die Aktivierung Abwehr-assoziierter Gene (262). Ein direkter Eingriff in die Wirtstranskription wird dagegen für HvsB und HvsG aus Pantoea agglomerans (früher Erwinia herbicola)(178) sowie für die Mitglieder der AvrBs3-Familie aus Xanthomonas vermutet (89). Da Xanthomonas und die AvrBs3-Effektorfamilie im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen, soll darauf im Folgenden genauer eingegangen werden.

10 EINLEITUNG A 10 B C D E Abbildung 1-3: Durch Xanthomonas spp. ausgelöste Krankheitssymptome in Nutzpflanzen. (A) X. oryzae pv. oryzae (Xoo) verursacht die Weißblättrigkeit von Reis. Die Symptome beginnen als wässrige Läsionen an den Blattspreiten, nehmen an Länge und Breite zu und verfärben sich gelb bis grau-weiß, bevor das gesamte Blatt austrocknet. (B) X. axonopodis pv.citri (Xac) löst Zitruskrebs auf Früchten, Blättern und Zweigen von Apfelsine aus. Aus den typischen zirkulären Läsionen formen sich zunächst Pusteln und später braune, korkartige Tumoren. (C) Durch X. campestris pv. malvacearum (Xcm) verursachte Symptome der eckigen Blattfleckenkrankheit auf Baumwolle. Kleine, wässrige Läsionen weiten sich zu eckigen Blattflecken aus, die durch die Blattadern begrenzt werden und eine rotbraune Färbung annehmen. (D) X. campestris pv. vesicatoria (Xcv) löst die bakterielle Fleckenkrankheit auf Tomate aus. Die typischen Symptome sind wässrige Läsionen an Blättern und Früchten, die später nekrotisch werden. (E) Durch X. campestris pv. armoraciae (Xca) verursachte Symptome der Blattfleckenkrankheit auf Kohl. Individuelle wässrige und später nekrotische Läsionen verschmelzen miteinander und formen häufig nekrotische Streifen entlang der Blattadern. (Bildquellen: [A] T.W. Mew, International Rice Research Institute, Bugwood.org; [B] Timothy Schubert, Florida Department of Agriculture and Consumer Services, Bugwood.org; [C] und [D] Clemson University - USDA Cooperative Extension Slide Series, Bugwood.org; [E] AVRDC International Cooperators Fact Sheet: Crucifer diseases, Xanthomonas leaf spot; Die Gattung Xanthomonas Die Gattung Xanthomonas beinhaltet Gram-negative Bakterien, die hauptsächlich als hemibiotrophe Pathogene oder Epiphyten in Assoziation mit der Pflanze gefunden werden. Die meisten Xanthomonaden sind polar monotrich begeißelte Stäbchen von ca. 0,2-0,6 µm 0,8-2,9 µm Größe (216). Sie sind von einer Hülle aus dem EPS Xanthan umgeben und erhalten durch Xanthomonadine, Brom-haltige Polyenverbindungen, ihre charakteristische gelbe Färbung. Xanthomonas spp. befallen fast alle wichtigen Kulturpflanzen und wurden aufgrund ihres Wirtsbereichs in Pathovare (pv.) eingeteilt. So löst z.b. X. oryzae pv. oryzae (Xoo) die Weißblättrigkeit von Reis aus ( bacterial blight )(Abb. 1-3A), die besonders im asiatischen und afrikanischen Raum erhebliche Ernteverluste verursacht (177). X. axonopodis

11 EINLEITUNG 11 pv. citri (Xac), verursacht Zitruskrebs ( citrus canker )(Abb.1-3B) auf verschiedenen Citrus- Arten (82), und X. campestris pv. malvacearum (Xcm) ist der Erreger der eckigen Blattfleckenkrankheit auf Baumwolle ( angular leaf spot )(6)(Abb. 1-3C). Die Infektion der Pflanze erfolgt über natürliche Öffnungen wie Stomata und Hydathoden, oder über Verwundungen. Die Bakterien vermehren sich im Apoplasten und können nicht in die pflanzlichen Zellen eindringen. Während sich einige Pathogene wie Xoo über das Xylem systemisch in der Pflanze verbreiten können, vermehren sich andere, z.b. Xac, lokal begrenzt und müssen für die weitere Verbreitung an die pflanzliche Oberfläche zurückkehren. Die beiden Pathovare, die in dieser Arbeit verwendet wurden, sollen nachfolgend kurz vorgestellt werden X. campestris pv. vesicatoria X. campestris pv. vesicatoria (Doidge) Dye (Xcv), auch bezeichnet als X. axonopodis pv. vesicatoria (237) oder X. euvesicatoria (119), ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit auf Paprika (Capsicum spp.) und Tomate (Solanum lycopersicon und Lycopersicon spp.), die vor allem in Gebieten mit feucht-warmem Klima erhebliche Ernteausfälle verursacht (6). Xcv ist ein etablierter Modellorganismus für das Studium der molekularen Mechanismen der Pflanzen-Pathogen-Interaktion, dessen Genom kürzlich entschlüsselt wurde (226). Die Infektion erfolgt vorrangig über Stomata oder über Verwundungen. Die Bakterien vermehren sich lokal im Interzellularraum des Blattes und breiten sich nicht systemisch in der Pflanze aus. Die Verbreitung auf weitere Pflanzen erfolgt über Spritzwasser/Regen, nachdem die Bakterien wieder auf die Blattoberfläche gelangt sind. Symptome zeigen sich anfangs als wässrige Läsionen, die später nekrotisch werden (Abb.1-3D) X. campestris pv. armoraciae X. campestris pv. armoraciae (McCulloch) Dye (Xca) wurde erstmals 1929 aus Meerrettich (Armoracia rusticana) isoliert (169) und stellt ebenfalls ein nicht-systemisches Pathogen dar. Xca ist molekularbiologisch nicht so gut untersucht wie Xcv, aber auch seine Genomsequenz ist seit Kurzem verfügbar ( Xca besitzt zudem den Vorteil, dass es neben nahezu allen kultivierten Brassicaceen auch die Modellpflanze Arabidopsis thaliana befällt. Fabaceen wie Phaseolus vulgaris und Solanaceen

12 EINLEITUNG 12 wie Tomate (Solanum lycopersicon und Lycopersicon spp.), Paprika (Capsicum spp.) und Tabak (Nicotiana tabacum) gehören ebenfalls zum Wirtsspektrum von Xca (94, 264). Xca dringt über die Stomata bzw. über Verwundungen in den Apoplasten der Wirtspflanze ein (106) und verursacht die typischen Symptome der bakteriellen Fleckenkrankheit: zirkuläre, anfangs wässrige und später nekrotische Blattflecken mit chlorotischen Höfen, die oftmals gehäuft entlang der Blattadern auftreten (169, 264)(Abb. 1-3E) Die AvrBs3-Effektor-Familie Der namensgebende Vertreter der Familie, AvrBs3 aus Xcv (Abb. 1-4A), wurde 1989 aufgrund seiner Erkennung in Paprikapflanzen, die das korrespondierende R-Gen Bs3 enthalten (Abb. 1-4B), isoliert (29). AvrBs3 ist konstitutiv in Xcv exprimiert (137) und wird über das T3SS sekretiert und in die Pflanzenzelle transloziert (200, 219). Inzwischen wurden über 30 homologe Proteine aus verschiedenen Xanthomonas spp. hinsichtlich ihrer Aktivität in suszeptiblen und resistenten Pflanzen untersucht, und Southern- und Genomsequenz- Analysen zeigen die Präsenz zahlreicher weiterer Homologer, besonders in Stämmen von Xoo und Xcm (9, 27, 29, 48, 51, 105, 143, 183, 215, 250, 253). Entferntere Verwandte findet man auch in Ralstonia solanacearum (46, 101, 173), während bislang keine Homologen aus anderen Bakterienarten bekannt sind Struktur und mögliche Wirkungsweise von AvrBs3 und verwandter Proteine Die Mitglieder der AvrBs3-Familie aus Xanthomonas spp. zeichnen sich durch eine hohe Sequenzidentität (> 85% auf Proteinebene) und eine konservierte Struktur aus (Abb. 1-4A). Ein besonderes Merkmal ist die Region von 1,5 bis 28,5 Sequenzwiederholungen, sogenannter Repeats, mit einer Länge von meist 34 Aminosäuren (As) im mittleren Bereich der Proteine (89, 250). Ausnahmen finden sich in AvrXa7 (254) und anderen Proteinen, die einzelne 33-As-Repeats enthalten, sowie in zwei Proteinen aus Xca, Hax1 (E. Marois und U. Bonas, unveröffentlicht) und Hax2 (125), deren Repeats ausschließlich aus 35 As bestehen (Tab. 1-1). Die Sequenzwiederholungen sind nahezu identisch und variieren hauptsächlich an den As-Positionen 12 und 13 (244). Die Zahl und Anordnung der Repeats bestimmen die Spezifität der Virulenzfunktionen der Proteine (167, 255, 256) sowie die ihrer Erkennung in

13 EINLEITUNG A 288 As x 34 As 278 As H2N COOH Repeatregion Typ-III-Sekretions- und Translokationssignal B Bs3 imperfekter Leuzin-Zipper NLSs C AAD Bs3-E Abbildung 1-4: Proteinstruktur, Avirulenz- und Virulenzaktivität des Typ-IIIEffektors AvrBs3 aus Xcv. (A) Proteinstruktur von AvrBs3 (1164 As). Der NTerminus enthält die Signale für die TypIII-abhängige Sekretion und Translokation. Die zentrale Region von direkten, fast identischen Sequenzwiederholungen ( Repeats ) von je 34 As bestimmt die Spezifität der Proteinaktivität. Der CTerminus enthält einen imperfekten Leuzin-Zipper, zwei funktionale Kernlokalisierungssignale (NLSs) und eine saure Transkriptionsaktivierungsdomäne (AAD). (B und C) AvrBs3 löst die HR in resistenten Paprikapflanzen (Bs3) aus (B), während es in suszeptiblen Paprikapflanzen (Bs3-E) eine Hypertrophie und damit verbundene Pustelbildung hervorruft (C). Gezeigt ist jeweils die Blattunterseite. Es handelt sich um Laborphänotypen. resistenten Pflanzen (38, 100, 256, 265). C-terminal direkt an die Repeatregion angrenzend befindet sich ein imperfekter Leuzin-Zipper, der eine Rolle bei der Interaktion von AvrBs3 und Homologen mit anderen Proteinen oder mit DNA spielen könnte (257). Interessanterweise beeinflusst diese Region bei einigen Mitgliedern der AvrBs3-Familie die Spezifität der Proteinaktivität (108, 251, 253). Ein weiteres Charakteristikum der AvrBs3Familie sind Kernlokalisierungssignale ("nuclear localization signals", NLSs) und eine saure Aktivierungsdomäne ("acidic activation domain", AAD) im C-Terminus, die typisch für eukaryotische Transkriptionsfaktoren sind (89). Die NLSs ermöglichen die Interaktion mit Importin α (218), das zusammen mit Importin β (79) den Transport der Effektoren in den Nukleus vermittelt (219, 234, 254, 257). Die AAD stimuliert in Reporterassays die Transkription von Genen (218, 265, 266), vermutlich über eine Rekrutierung der eukaryotischen Transkriptionsmaschinerie (192). Mindestens eine NLS und die AAD sind essentiell für alle untersuchten Virulenzfunktionen von AvrBs3-Familienmitgliedern und auch für ihre R-Gen-vermittelte Erkennung in resistenten Pflanzen (72, 73, 167, 218, 234, 254, 265). Eine Ausnahme stellt AvrBs4 aus Xcv dar, welches in Tomate unabhängig von den NLSs und der AAD durch das TIR-NBS-LRR-Protein Bs4 erkannt wird (21, 205).

14 EINLEITUNG 14 Neben NLSs und AAD teilen die Mitglieder der AvrBs3-Familie weitere Gemeinsamkeiten mit vielen eukaryotischen Transkriptionsfaktoren. Dazu zählen die Dimerisierung und die Bindung an DNA. So kann AvrBs3 über seine Repeatregion Homodimere, aber auch Heterodimere mit AvrBs3-Derivaten bilden (88). AvrXa7 aus Xoo bindet in vitro an doppelsträngige DNA, wobei eine Präferenz für AT-reiche DNA, aber keine spezifische Bindesequenz ermittelt werden konnte (254). Zusammengenommen deutet dies auf eine Funktion der AvrBs3-Familienmitglieder als Transkriptionsaktivatoren im Kern der Wirtszelle hin (Abb. 1-5). In vorangegangenen Arbeiten wurden durch AvrBs3 induzierte AvrBs3 Apoplast Xcv Zellwand T3SS PM Zytosol Pflanzenzelle upa-gen Importin α Importin β pflanzliches Protein upa-gen Nukleus Abbildung 1-5: Modell der Wirkungsweise von AvrBs3. AvrBs3 wird über das T3SS von Xcv direkt ins Zytosol der pflanzlichen Zelle transloziert. Hier bildet es Homodimere und interagiert mit Importin α, das zusammen mit Importin β den Transport des Effektors in den Nukleus vermittelt. AvrBs3 induziert in Abhängigkeit von seiner AAD die Induktion von upa-genen ( upregulated by AvrBs3 ). Zu Beginn dieser Arbeit war unklar, ob der Effektor selbst an DNA binden kann oder ob die DNA-Bindung durch ein pflanzliches Protein vermittelt wird.

15 EINLEITUNG 15 Gene in Paprika identifiziert, die als upa-gene ("upregulated by AvrBs3") bezeichnet wurden (167). Dass einige upa-gene unabhängig von pflanzlicher Proteinneusynthese durch AvrBs3 induziert wurden, deutet auf eine direkte Aktivierung dieser Gene durch den Effektor hin (167). Kürzlich wurden auch in Reis Gene identifiziert, deren Expression durch AvrBs3- Homologe aus Xoo induziert wird (86, 212, 252) Virulenzfunktionen von AvrBs3-Familienmitgliedern Für viele Mitglieder der AvrBs3-Familie wurden Virulenzfunktionen beschrieben (Tab. 1-1). Dazu zählen die Unterdrückung von Abwehrreaktionen (72), die Steigerung des bakteriellen Wachstums im Apoplasten und die Auslösung von Krankheitssymptomen. Die Länge der durch Xoo verursachten Läsionen in Reis wird z.b. durch AvrXa7, Avrxa5 und ab4.5 gesteigert, wobei AvrXa7 essentiell für die Bildung der Läsionen ist und auch das Wachstum der Bakterien in der Pflanze fördert (19). Der Effektor PthA aus Xac ist essentiell für die Auslösung von Zitruskrebs und das Wachstum der Bakterien in Citrus (214). Die typischen Zitruskrebs-Symptome (Abb. 1-3B) gehen mit der Vermehrung, Vergrößerung und dem Tod von Wirtszellen einher und führen letztlich neben der Bildung von Tumoren zu einem Aufreißen der Epidermis (59, 214). Dies ermöglicht die Freisetzung der Bakterien aus dem infizierten Gewebe und damit ihre weitere Verbreitung (59). Avrb6 und andere Homologe aus Xcm sind erforderlich für die Ausbildung wässriger Läsionen auf Baumwolle und unterstützen ebenfalls den Austritt der Bakterien an die Blattoberfläche, haben aber im Gegensatz zu PthA keinen Einfluss auf das Wachstum in der Pflanze (255, 258). Eine Funktion bei der Freisetzung der Bakterien aus dem infizierten Blattgewebe wird auch für AvrBs3 vermutet. AvrBs3 verursacht eine Hypertrophie, d.h. Vergrößerung, von Zellen des Palisaden- und Schwammparenchyms in Paprika und Tomate, aber auch in anderen Solanaceen (167)(Abb. 1-4C). Die Verkleinerung des apoplastischen Raums könnte durch die daraus resultierende Druckerhöhung ein Herauspressen der Bakterien durch die Stomata zur Folge haben (167). Ein positiver Effekt von AvrBs3 auf die bakterielle Verbreitung in Paprika wurde in Feldstudien gezeigt (245). Übereinstimmend mit dem Hypertrophie-Phänotyp kodieren einige AvrBs3-induzierte upa-gene mögliche α-expansine und Auxin-induzierte Proteine, die eine Rolle bei der Zellvergrößerung spielen könnten (167).

16 EINLEITUNG 16 Tabelle 1-1: Mitglieder der AvrBs3-Familie mit bekannter Virulenz- und/oder Avirulenzaktivität. Hax4 14,5 x 34 As Chlorose und Nekrose auf Radieschen / HR in Tomate (Bs4) (21, 205) diese Arbeit (125), (21, 205) X. axonopodis pv.citri (Xac) Apl1 17,5 x 34 As # Zitruskrebs-Symptome**; HR-Suppression in Tabak / n.b. (72, 123) Apl2 15,5 x 34 As # Zitruskrebs-Symptome / n.b. (123) HssB3.0 14,5 x 34 As Reduktion der Aggressivität auf Citrus / n.b. (208) PthA 17,5 x 35 As # Zitruskrebs-Symptome und bakterielles Wachstum in Citrus** / Name Repeats Virulenzeffekt /Avirulenzaktivität* Referenzen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) AvrBs3 17,5 x 34 As Hypertrophie in Solanaceen / HR in Paprika (Bs3) (29, 167, 198) AvrBs4 17,5 x 34 As n.b. / HR in Tomate (Bs4) (21, 27, 205) X. oryzae pv. oryzae (Xoo) ab3.5s n.b. wässrige Läsionen in Reis / n.b. (19) ab3.6 n.b. wässrige Läsionen in Reis / n.b. (19) ab4.3 n.b. wässrige Läsionen in Reis / n.b. (19) ab4.5 n.b. wässrige Läsionen und bakterielles Wachstum in Reis / n.b. (19) Avr/pth3 1,5 x 34 As n.b. / HR in Reis (Xa3) (36, 250) AvrXa3 8,5 x 34 As # wässrige Läsionen in Reis / reduzierte Läsionen in Reis (Xa3) (36, 146) Avrxa5 5,5 x 34 As wässrige Läsionen auf Reis / HR in Reis (xa5) (19, 105, 109) AvrXa7 25,5 x 34 As #R wässrige Läsionen und bakterielles Wachstum in Reis**; HR- Suppression in Tabak / HR in Reis (Xa7) (19, 72, 105) AvrXa10 15,5 x 34 As HR-Suppression in Tabak / HR in Reis (Xa10) (72, 105) AvrXa27 16,5 x 34 As # n.b. / HR in Reis (Xa27) (86) PthXo1 23,5 x 34 As # wässrige Läsionen in Reis** / n.b. (253) PthXo2 21,5 x 34 As wässrige Läsionen in Reis** / n.b. (253) PthXo3 28,5 x 34 As #R wässrige Läsionen in Reis** / n.b. (253) PthXo6 22,5 x 34 As # wässrige Läsionen und bakterielles Wachstum in Reis / n.b. (212) PthXo7 21,5 x 34 As # wässrige Läsionen und bakterielles Wachstum in Reis / n.b. (212) X. campestris pv. armoraciae (Xca) Hax2 21,5 x 35 As Chlorose und Nekrose auf Radieschen / n.b. diese Arbeit (125) Hax3 11,5 x 34 As Chlorose und Nekrose auf Radieschen / HR in Tomate (Bs4) diese Arbeit (125), HR in Baumwolle (214, 215) PthA- KC21 17,5 x 34 As Zitruskrebs-Symptome** / n.b. (208) PthAW 17,5 x 35 As Zitruskrebs-Symptome** / n.b. (9) PthA* 17,5 x 35 As Zitruskrebs-Symptome** / n.b. (9) PthC 17,5 x 35 As Zitruskrebs-Symptome** / n.b. (9) X. citri pv. aurantifolii PthB 17,5 x 35 As Zitruskrebs-Symptome** / n.b. (61) X. campestris pv. malvacearum (Xcm) AvrB4 18,5 x n.b. n.b. / HR in Baumwolle (B1, B4) (50, 51) AvrB5 n.b. wässrige Läsionen auf Baumwolle / (258) Avrb6 13,5 x 34 As wässrige Läsionen auf Baumwolle und bakterielle Freisetzung** / HR in Baumwolle (B1, b6) (51, 258) Avrb7 18,5 x n.b. wässrige Läsionen auf Baumwolle / HR in Baumwolle (B1, b7) (50, 51, 258) AvrB101 22,5 x n.b. wässrige Läsionen auf Baumwolle / HR auf Baumwolle () (258) AvrB102 n.b. wässrige Läsionen auf Baumwolle / HR auf Baumwolle (B1) (51, 258) AvrB104 n.b. wässrige Läsionen auf Baumwolle / n.b. (258) AvrBln n.b. wässrige Läsionen auf Baumwolle / HR in Baumwolle (Bln) (50, 258) PthN 13,5 x 34 As # wässrige Läsionen auf Baumwolle** / n.b. (38) PthN2 n.b. wässrige Läsionen auf Baumwolle / n.b. (38) *korrespondierende(s) R-Gen(e) ist/sind in Klammern angegeben; n.b., nicht bekannt; # einzelne Repeats bestehen aus 33 As; R Insertion von sechs As in Repeat 13 (AvrXa7) bzw. 15 (PthXo3); **Hauptvirulenzfaktor

17 EINLEITUNG Thematik der Arbeit und Vorarbeiten Die vorliegende Arbeit hatte zwei Hauptziele. Zum einen sollte die Virulenzfunktion von AvrBs3, die zur Auslösung der Hypertrophie von Mesophyllzellen führt, genauer charakterisiert werden. Dreizehn upa-gene aus Paprika waren bereits bekannt (166, 167). Die Induktion von upa10 bis upa13 erfordert keine Proteinneusynthese in der Pflanze und könnte daher direkt durch AvrBs3 erfolgen. Zwei dieser Gene, upa12 und upa13, kodieren mögliche Transkriptionsfaktoren (166), waren aber in ersten Analysen nicht in der Lage, die Expression von upa1 bis upa9 zu aktivieren (E. Marois und U. Bonas, unveröffentlicht). In dieser Arbeit sollten daher weitere direkt durch AvrBs3 induzierte Gene isoliert und hinsichtlich einer möglichen Funktion in der Auslösung der Hypertrophie und der Induktion von upa1 bis upa9 analysiert werden. Weiterhin sollte der Mechanismus genauer untersucht werden, der zur Induktion der upa-gene durch AvrBs3 führt. Zu diesem Zweck sollten upa-promotorstudien durchgeführt werden, um ein mögliches AvrBs3-responsives DNA-Element zu identifizieren. Aus Vorarbeiten (166) lagen bereits zwei upa-promotoren vor, die in eine vergleichende Sequenzanalyse einbezogen werden konnten. Das zweite große Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von avrbs3-homologen aus einem Arabidopsis-Pathogen. Im Rahmen der vorangegangenen Diplomarbeit waren drei avrbs3-homologe Gene, hax2, hax3 und hax4 (Homolog von avrbs3 in Xanthomonas), in dem Brassicaceen-pathogenen Xca-Stamm 5 identifiziert, aber nicht in voller Länge isoliert bzw. sequenziert worden. Zur weiteren Analyse waren bereits Einzel- und Mehrfachmutanten erstellt worden, wobei bei den hax4-mutanten ein polarer Effekt nicht ausgeschlossen werden konnte. Erste Analysen dieser Mutanten zeigten keinen Effekt in der Interaktion des Xca- Stammes 5 mit Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia (Col-0), aber einen möglichen Beitrag zur Symptom-bildung auf Radieschen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten hax2, hax3 und hax4 genauer analysiert werden. Dazu zählten der Nachweis, dass es sich bei den entsprechenden Genprodukten um Typ-III-abhängig translozierte Effektoren handelt, sowie die Analyse möglicher Virulenz- und Avirulenzaktivitäten unter Verwendung neuer hax4-einzel- und hax- Mehrfachmutanten. Zur Analyse der Virulenzfunktion sollten verschiedene Radieschen- Akzessionen aus einer Genbank getestet werden, da in den Vorarbeiten eine handelsübliche Samenmischung genutzt wurde. Außerdem sollte im Rahmen dieser Arbeit auch an der Annotation des Genoms des Xcv-Stammes mitgewirkt werden.