PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TESTS 72741

PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TESTS 72741 TESTKIT ZUM QUALITATIVEN/QUANTITATIVEN NACHWEIS VON ANTI-TOXOPLASMA GONDII IgG IM HUMANSERUM ODER -PLASMA DURCH ENZYMIMMUNOASSAY IVD Alle hergestellten und kommerziell erhältlichen Reagenzien unterliegen einem umfassenden Qualitätskontrolsystem, das vom Eingang der Rohmaterialien bis zur Vermarktung des Produktes reicht. Jede Charge unterliegt einer Qualitätskontrolle und wird nur für den Vertrieb freigegeben, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind. Die Produkt- und Kontrolldokumentation jeder einzelnen Charge wird in der Firma aufbewahrt.

INHALTSVERZEICHNIS 1- VERWENDUNGSZWECK................................63 2- KLINISCHE BEDEUTUNG................................63 3- TESTPRINZIP..........................................64 4- INHALT DES TESTKITS..................................64 5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN..............66 6- ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL.......................68 7- VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN............68 8- PROBEN............................................69 9- TESTDURCHFÜHRUNG..................................70 10- BERECHNUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE...........72 11- LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN DES VERFAHRENS........75 12- LITERATUR...........................................78 62

1- VERWENDUNGSZWECK Platelia TM Toxo IgG TMB ist ein In-Vitro-Diagnostik-Testkit zum qualitativen und quantitativen Nachweis der gegen Toxoplasma gondii (T. gondii) gerichteten IgG-Antikörper im Serum. 2 KLINISCHE BEDEUTUNG T. gondii ist ein Protozoon, das zahlreiche Säugetier- und Vogelarten infizieren kann. Diese Infektionen treten sehr häufig beim Menschen und bei Tieren auf und verlaufen oft klinisch ganz symptomlos. Die Prävalenz dieser Infektion in der Population wird durch das Vorhandensein spezifischer Antikörper im Humanserum nachgewiesen und variiert je nach Gegend und Alter. Im Falle einer Primärinfektion bei schwangeren Frauen kann diese Infektion schwere Folgen für den Fötus (insbesondere zerebrale Funktionsstörungen) oder sogar Fehlgeburten verursachen. Eine durch den Nachweis von IgG- Antikörpern zu Beginn der Schwangerschaft festgestellte auch lange zurückliegende Immunität der Mutter schützt den Fötus vor der Infektion durch diesen Parasiten Eine zweite durch diese Infektion gefährdete Gruppe sind immunsupprimierte Patienten, insbesondere AIDS-Patienten. Diese Infektionen sind fast ausschließlich auf eine aus einem ruhenden parasitären Herd (Zyste) reaktivierte Infektion, die vor der HIV-Infektion bestand, zurückzuführen. Eine sichere Diagnose der Toxoplasmose-Infektion wird durch den Parasitennachweis erbracht, aber seine Bestimmung durch eine direkte Untersuchung ist schwierig, wenn nicht sogar ungewiss. Die Serologie stellt die Grundlage für Diagnostik und Follow-up der Toxoplasmose dar. Durch den Nachweis spezifischer Antikörper kann eine Infektion mit T. gondii bestätigt werden. Die gleichzeitige Untersuchung einer Probe auf verschiedene Antikörper ermöglicht es generell, den Infektionszeitpunkt festzulegen und ggf. bei neueren Infektionen das therapeutische Vorgehen zu bestimmen bzw. auch dem Erscheinungsrisiko einer Toxoplasmose angemessene Vorbeugungsmaßnahmen zu empfehlen: hygienischdiätetische Maßnahmen bei seronegativen schwangeren Frauen, Chemoprophylaxe bei immunsupprimierten, T. gondii-seropositiven Patienten. 63

3- TESTPRINZIP Das Prinzip dieser Methode ist ein Festphasen-Enzymimmunoassay, ein sogenannter "indirekter ELISA-Test". Das lösliche, zur Beschichtung der Mikrotiterplatte verwendete T. gondii-antigen wird aus einem Tachyzoiten- Sonikat mit hoher Konzentration an Membranproteinen gewonnen. Ein monoklonaler, an Peroxidase gekoppelter, Human-Gammaketten (IgG) spezifischer Antikörper wird als Konjugat verwendet. 1. Schritt Die zu untersuchenden Seren sowie die Kontrollseren werden 1:101 verdünnt und anschließend in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert. Während der 1stündigen Inkubation bei 37 C binden die in der Probe vorhandenen Anti-T. gondii-igg-antikörper an das in den Mikrotiterplattenvertiefungen fixierte Toxoplasma-Antigen. IgG ohne anti- T. gondii-spezifizität werden nach der Inkubation durch Waschen eliminiert. 2. Schritt Das Konjugat (peroxidasemarkierter, Human-Gammaketten-spezifischer monoklonaler Antikörper) wird in alle Mikrotiterplattenvertiefungen pipettiert. Während dieser zweiten 1stündigen Inkubation bei 37 C bindet der markierte Antikörper an die Serum-IgG-Antikörper, die mit dem Toxoplasma-Antigen reagiert haben. Nicht gebundenes Konjugat wird nach der Inkubation durch Waschen eliminiert. 3. Schritt Das Vorhandensein des Immunkomplexes (Toxoplasma-Ag / Anti-T. gondii- Serum-IgG / Anti-IgG-Konjugat) wird durch Zugabe einer enzymatischen Entwicklungslösung nachgewiesen. 4. Schritt Nach halbstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die enzymatische Reaktion durch Zusetzen von 1N Schwefelsäurelösung gestoppt. Die bei 450/620 nm abgelesene Extinktion ist proportional der Anti-T. gondii- IgG-Menge. Durch Ablesen gegen eine Eichkurve wird der Serumtiter in IE/ml (Internationale Einheit) bestimmt. Die Kontrollseren (R4a, R4b, R4c) sind gegen den WHO-Standard (TOXM 185) kalibriert. 4- INHALT DES TESTKITS Alle Reagenzien sind nur für die In vitro-diagnostik bestimmt. 64

Label ART DER REAGENZIEN Darreich. R1 Microplate Mikrotiterplatte : 12 Streifen zu je 8 Vertiefungen, 1 Platte Vertiefungen, beschichtet mit T.gondii-Antigen (RH-Stamm). R2 Concentrated Waschlösung : 10 fach-konzentriert, TRIS-NaCl 1 Flasche Washing -Puffer ph 7,4, 1% Tween 20. 100 ml Solution Konservierungsmittel: 0,01 % Thimerosal. R3 Calibrator 0 Kontrollserum 0 : Humanserum, negativ anti-t. gondii 1 Flasche -IgG-Antikörper und negativ für HBs-Antigen 1ml sowie für Antikörper gegen HIV1, HIV2 und HCV Konservierungsmittel: < 0.01 % Thimerosal R4a Calibrator 6 Kontrollserum 6 IE/ml : TRIS-NaCl-Puffer (ph 8 ± 0,2), 1 Flasche Humanserum, reaktiv für anti-t. gondii-igg-antikörper 1 ml und negativ für das HBs-Antigen sowie für Antikörper gegen HIV1, HIV2 und HCV, Rinderserumalbumin, Glyzerin, E 102 und E 122, Konservierungsmittel: < 0,01% Thimerosal und < 0,5% Proclin. R4b Calibrator 60 Kontrollserum 60 IE/ml : TRIS-NaCl-Puffer (ph 8 ± 0,2), 1 Flasche Humanserum, reaktiv für anti-t. gondii-igg-antikörper 1 ml und negativ für das HBs-Antigen sowie für Antikörper gegen HIV1, HIV2 und HCV, Rinderserumalbumin, Glyzerin, E 102 und E 122, Konservierungsmittel: < 0,01% Thimerosal und < 0,5% Proclin. R4c Calibrator 240 Kontrollserum 240 IE/ml : TRIS-NaCl-Puffer (ph 8 ± 0,2), 1 Flasche Humanserum reaktiv für anti-t. gondii-igg-antikörper 1 ml und negativ für das HBs-Antigen sowie für Antikörper gegen HIV1, HIV2 und HCV, Rinderserumalbumin, Glyzerin, E102 und E122, Konservierungsmittel : < 0.01 % Thimerosal und < 0.5 % Proclin. R6 Conjugate Konjugat : An Peroxidase gekoppelter, 1 Flasche (50x) gegen Human-Gammaketten gerichteter monoklonaler 0,6 ml Mausantikörper; flüssig, 50 fach konzentrier. R7 Diluent Verdünnungsmittel : für Proben und Konjugat, 2 Flasches gebrauchsfertig, TRIS-NaCl-Puffer (ph 7,7 ± 0,15), 80 ml Rinderserumalbumin, 0,1% Tween 20 und Phenolrot Konservierungsmittel: < 0,01% Thimerosal. R8 TMB Substratpuffer : Lösung aus Zitronensäure 1 Flasche Substrate und Natriumzitrat, ph 4.0, 60 ml Buffer enthält 0,015% H 2 O 2 und 4% DMSO. R9 Chromogen: Chromogen : Tetramethylbenzidin (TMB)-Lösung 1 Flasche TMB Solution 5 ml R10 Stopping Stopplösung : 1 Flasche Solution 1N Schwefelsäure 28 ml Klebefolien 4 65

5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN 66 Vorsichtsmaßnahmen Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt davon ab, dass folgende Regeln der Guten Laborpraxis beachtet werden: Keine verfallenen Reagenzien verwenden. Keine Reagenzien aus unterschiedlichen Kitchargen in einem Testansatz verwenden. Hinweis: Von folgenden Reagenzien kann auch eine andere Charge als die im Kit vorhandene, jedoch immer nur jeweils eine pro Testansatz, verwendet werden: Waschlösung (R2, Etiketten-Kennung: 10 x blau gefärbt), Substratpuffer (R8, Etiketten-Kennung: TMB buf. blau gefärbt), Chromogen (R9, Etiketten-Kennung: TMB sol., grün gefärbt) und Stopplösung (R10, Etiketten-Kennung: 1N, rot gefärbt). Diese Reagenzien können mit anderen Produkten verwendet werden. Auskunft hierzu erteilt Ihnen unser Technischer Service. Vor Gebrauch müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden (ca. 30 Min.). Reagenzien sorgfältig auflösen und Verunreinigung vermeiden. Den Test nicht in Gegenwart reaktiver Dämpfe (von Säuren, Alkalien, Aldehyden) oder Staub durchführen. Die Enzymaktivität des Konjugats könnte dadurch beeinträchtigt werden. Wenn möglich, Einmalartikel verwenden. Glaswaren müssen vor Gebrauch gründlich gereinigt und mit entionisiertem Wasser gespült werden. Die Mikrotiterplatte(n) darf / dürfen nach dem Waschen nicht austrocknen. Das Enzym reagiert sehr empfindlich mit Metallionen. Folglich dürfen die verschiedenen Konjugat- und Substratlösungen nicht mit Metallen in Berührung kommen. Die Entwicklungslösung (Substratpuffer + Chromogen) muss farblos sein. Eine Lösung, die sich innerhalb von wenigen Minuten nach dem Ansetzen blau verfärbt, darf nicht verwendet, sondern muss erneuert werden. Die Entwicklungslösung sollte in einem Einmalgefäß aus Kunststoff oder einem Gefäß aus Glas hergestellt werden, das zuvor mit 1N Salzsäure gereinigt, gründlich mit Aqua. dest. gespült und anschließend getrocknet wurde. Die Lösung unter Lichtabschluss aufbewahren. Bei jeder neuen Probe die Pipettenspitze wechseln. Sorgfältiges Waschen der Mikrotiterplatte ist von kritischer Bedeutung. Die vorgeschriebenen Waschzyklen sind unbedingt einzuhalten. Die

Vertiefungen müssen vollständig gefüllt und dann vollständig geleert werden. Nicht vorschriftsmäßiges Waschen kann zu ungenauen Ergebnissen führen. Niemals dasselbe Gefäß oder dieselbe Pipettenspitze für Konjugat- und Entwicklungslösung verwenden. Pipetten und Geräte auf Genauigkeit und korrekte Funktion prüfen. Die Testdurchführung nicht ändern. Hygiene- und Sicherheitshinweise Alle im Testkit enthaltenen Reagenzien sind nur für die in vitro-diagnostik bestimmt. Beim Arbeiten mit den Reagenzien sind Einmalhandschuhe zu tragen. Nicht mit dem Mund pipettieren. Das zur Herstellung der Reagenzien verwendete menschlich Ausgangsmaterial wurde auf das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg, auf Antikörper gegen das Hepatitis-C-Virus (HCV) und gegen die humanen Immundefizienzviren (HIV-1 und HIV-2) getestet und für negativ gefunden. Weil keine der bekannten Testmethoden gewährleisten kann, dass keine infektiösen Erreger vorhanden sind, sollte mit Reagenzien menschlichen Ursprungs und Patientenproben so umgegangen werden, als könnten sie Infektionen übertragen. Materialien, die mit Proben und Reagenzien menschlichen Ursprungs unmittelbar in Berührung kommen, desgleichen der Waschabfall, sind als potentiell infektiös anzusehen. Probenspritzer bzw. Spritzer probenhaltiger Lösungen vermeiden. Spritzer müssen mit 10%iger Natriumhypochloritlösung behandelt werden. Säurehaltige Spritzer sind zunächst mit Natriumbicarbonat zu neutralisieren, anschließend mit Natriumhypochloritlösung zu reinigen und schließlich mit saugfähigem Papier trocken zu wischen. Das zum Reinigen verwendete Material ist in einem Behälter für biologischen Anfall zu entsorgen. Proben, Reagenzien menschlichen Ursprungs sowie alle kontaminierten Materialien und Produkte sollten, ehe sie entsorgt werden, dekontaminiert werden. Die Dekontamination kann erfolgen: - entweder durch Behandlung mit 5%iger Natriumhypochloridlösung (Endkonzentration; 30 Min Einwirkzeit), - oder durch Autoklavieren für mindestens 2 Std. bei 121 C. Autoklavieren für mindestens 1 Std. bei 121 C ist die beste Methode zum Inaktivieren der HIV- und HB-Viren. 67

VORSICHT: NATRIUMHYPOCHLORITHALTIGE LÖSUNGEN DÜRFEN NICHT AUTOKLAVIERT WERDEN. VORSICHT: Einige Reagenzien enthalten: * Proclin 300 < 0,5%: REIZEND R43: Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. S28-37: Bei Ber hrung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Xi-reizend Wasser und Seife waschen. Geeignete Schutzhandschuhe tragen. Chemikalien sollten entsprechend den Regeln der Guten Laborpraxis verwendet und entsorgt werden. Jeglicher Haut- und Schleimhautkontakt mit dem Substratpuffer, dem Chromogen und der Stopplösung ist zu vermeiden (Vergiftungs-, Reizungsoder Verbrennungsgefahr). Das Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage erhältlich. 6- ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL Rührgerät Typ Vortex. Mikrotiterplattenphotometer* (mit Filtern 450 nm und 620 nm). Wasserbad oder Trockeninkubator*, mit Thermostat auf 37±1 C einstellbar. Behälter für infektiösen Abfall. Natriumhypochloritlösung (Natronbleichlauge) und Natriumbicarbonat. Destilliertes Wasser. Messzylinder der Größe 25, 50, 100 und 1000 ml. Einmalhandschuhe. Schutzbrille. Saugfähiges Papier. Automatische oder halbautomatische Pipetten bzw. Multipipetten, variabel oder fest, zum Verteilen von 10 bis 1000 µl und 1, 2 und 10 ml. Automatisches*, halbautomatisches* oder manuelles Waschsystem für Mikrotiterplatten. Einmal-Röhrchen. * Genaue Auskunft über empfohlene Geräte erteilt Ihnen unser Technischer Service. 7- VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Der Testkit ist bei +2-8 C zu lagern. Jedes Element des bei +2- +8 C gelagerten ungeöffneten Testkits kann bis zum auf der Verpackung angegebenen Verfalldatum verwendet werden. 68

Hinweis: die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (+18-30 C) bringen. 1)Gebrauchsfertige Reagenzien Reagenz 1 (R1): Mikrotiterplatte Jeder Halterahmen mit 12 Streifen mit je 8 Vertiefungen ist einzeln in einem Folienbeutel eingeschweißt. Beutel mit Schere oder Skalpell 0,5-1 cm oberhalb der Schweißnaht aufschneiden. Überzählige Streifen sofort wieder in den Beutel zurücklegen. Beutel sorgfältig wieder verschließen und erneut bei +2-8 C lagern. Die Streifen sind dann 1 Monat haltbar. Reagenz 3 (R3), Reagenz 4a (R4a), Reagenz 4b (R4b), Reagenz 4c (R4c), Reagenz 10 (R10): Alle Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum verwendbar, wenn sie bei +2-8 C gelagert werden. 2)Reagenzien zum Rekonstituieren Reagenz 2(R2): 10 fach konzentrierte Waschlösung Gebrauchsfertige Lösung durch Verdünnen 1:10 mit Aqua. dest herstellen (100 ml R2 in 900 ml destilliertem Wasser). Bei manuellem Waschen 350 ml für eine Mikrotiterplatte mit 12 Streifen vorbereiten. Nach dem Verdünnen ist die Waschlösung 2 Wochen bei +2-8 C haltbar. Die konzentrierte Lösung sollte bei +2-25 C gelagert werden. Konjugatlösung: Reagenz 6 (R6) + Reagenz 7 (R7) Das Konjugat R6 liegt in flüssiger Form 50fach konzentriert vor. Für eine Mikrotiterplatte 0,5 ml des Konjugats (R6) frisch in 25 ml Verdünnungslösung (R7) verdünnen. Diese Volumen für einen Streifen durch 10 teilen. Das verdünnte Konjugat ist innerhalb von einer Stunde nach dem Ansetzen zu verwenden. Enzymatische Entwicklungslösung: Reagenz 8 (R8) + Reagenz 9 (R9) Die Chromogen-Lösung (R9) 1:11 im Substratpuffer (R8) verdünnen (z. B.: 1 ml Reagenz R9 + 10 ml Reagenz R8). Die verdünnte Lösung kann 6 Stunden bei Raumtemperatur (+18-30 C) unter Lichtabschluss gelagert werden. 8- PROBEN Eine Blutprobe unter Beachtung anerkannter Technik abnehmen. Der Test wird mit unverdünnter Probe durchgeführt. Serum oder Plasma (mit Antikoagulanzien wie EDTA, Heparin oder Citrat entnommen) von Gerinnsel oder roten Blutkörperchen so bald wie möglich trennen, um eine Hämolyse zu 69

vermeiden. Eine starke Hämolyse kann die Testleistung beeinträchtigen. Sichtbare Partikel in einer Probe sind vor der Testdurchführung durch Zentrifugieren zu entfernen. Suspendierte Fibrinpartikel oder Aggregate können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Die Proben können bei +2-8 C gelagert werden, falls die Bestimmung innerhalb von 5 Tagen erfolgt. Bei -20 C ist eine Lagerung über mehrere Monate möglich. Plasma muss durch Erwärmen in einem Wasserbad bei 40 C rasch aufgetaut werden, um ein Ausfällen von Fibrin zu vermeiden. Bei Versand müssen die gefahrgutrechtlichen Vorschriften beachtet werden. KEINE MIKROBIELL BEFALLENEN, HYPERLIPÄMISCHEN ODER STARK HÄMOLYTISCHEN SEREN ODER PLASMEN VERWENDEN. 9- TESTDURCHFÜHRUNG 70 Die vorliegende Beschreibung ist strikt zu befolgen. Zur Validierung der Testergebnisse sollten die Kontrollseren bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Die folgenden Regeln der Guten Laborpraxis beachten. 1. Einen Plan zur Verteilung und Identifizierung der Proben erstellen. 2. Die gebrauchsfertige Waschlösung (R2) herstellen (siehe Abschnitt 7). 3. Halterahmen und Streifen (R1) aus der Schutzhülle nehmen. 4. Alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte einmal mit der Arbeitswaschlösung R2 waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und auf saugfähigem Papier trocknen. 5. Die zu testenden Proben und die Kontrollseren 1:101 verdünnen: 10 µl Serum + 1 ml Verdünnungsmittel R7. Gut mischen (Vortex). 6.Bei manueller Abarbeitung des Tests, die Kontrollseren und die Patientenproben gemäß folgendem Schema verteilen: Vertiefung A1: 200 µl Kontrollserum 0 (R3) Vertiefung B1: 200 µl Kontrollserum 6 IE/ml (R4a). Vertiefung C1: 200 µl Kontrollserum 60 IE/ml (R4b). Vertiefung D1: 200 µl Kontrollserum 240 IE/ml (R4c). Vertiefung E1, F1, G1, H1: 200 µl verdünnte Probe. 7. Vorzugsweise die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken; dabei fest auf die ganze Mikrotiterplatte drücken, um diese luftdicht zu verschließen. Dann die Mikrotiterplatte 1 Stunde ± 5 Minuten bei 37 C ± 1 C in ein per Thermostat kontrolliertes Wasserbad oder einen Mikrotiterplatten- Trockeninkubator geben.

8. Kurz vor Ende der ersten Inkubation die Konjugatlösung R6 auf 1:50 verdünnen: 0,50 ml des Konjugats R6 + 25 ml R7-Lösung (Volumen für eine Mikrotiterplatte) (siehe Abschnitt 7) Gut mischen. 9. Nach Ende der ersten Inkubation die Klebefolie abziehen. Den Inhalt der Vertiefungen in ein (Natriumhypochlorit enthaltendes) Gefäß für biologischen Flüssigabfall absaugen und die Mikrotiterplatte 3mal waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und auf saugfähigem Papier ausklopfen. Bei Einsatz eines automatischen Waschgeräts die gleiche Vorgehensweise beachten (siehe Abschnitt 10). 10.200 µl der Konjugatlösung (R6 + R7) in alle Vertiefungen geben. Die Lösung vor Gebrauch schütteln. 11.Die Mikrotiterplatte vorzugsweise mit einer neuen Klebefolie abdecken und die Mikrotiterplatte in einem per Thermostat kontrollierten Wasserbad oder in einem Mikrotiterplatteninkubator 1 Stunde ± 5 Minuten lang bei 37± 1 C bebrüten. 12.Am Ende der zweiten Inkubation die Klebefolie entfernen, den Inhalt aller Vertiefungen in ein Gefäß für biologischen Flüssigabfall absaugen und 4mal waschen. Die Mikrotiterplatte umdrehen und auf saugfähiges Papier ausklopfen. Bei Einsatz eines automatischen Waschgeräts sind die gleichen Waschzyklen durchzuführen. 13.Schnell in jede Vertiefung 200 µ der zuvor vorbereiteten enzymatischen Entwicklungslösung (R8 + R9) pipettieren. Die Reaktion 30 Minuten lang unter Lichtabschluss bei Raumtemperatur (+18-30 C) ablaufen lassen. Bei dieser Inkubation keine Klebefolie verwenden. 14.100 µl Stopplösung (R10) in jede Vertiefung pipettieren, gleiche Reihenfolge und Geschwindigkeit wie beim Pipettieren der Entwicklungslösung einhalten. 15.Unterseite der Streifen vorsichtig abwischen. Die Extinktion innerhalb von 30 Minuten nach Stoppen der Reaktion mit Hilfe eines Mikrotiterplattenphotometers bei 450/620 nm messen. Bis zum Ablesen sind die Streifen vor Licht zu schützen. 16.Ehe die Ergebnisse protokolliert werden, sollte die Verteilung der Proben mit dem Pipettierschema kontrolliert werden. 71

10- BERECHNUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE 1)Referenz der Kalibration Vorkommen und Menge der gegen T. gondii gerichteten Antikörper der IgG-Klasse in der untersuchten Probe werden bestimmt, indem die Extinktion der Probe mit den Werten einer Eichkurve verglichen wird. Die Kontrollseren R4a, R4b, R4c sind gegen den WHO-Standard (TOXS M 185) kalibriert. Obgleich die in diesem Testkit enthaltenen Kontrollseren gegen den WHO- Standard kalibriert wurden, können gewisse Titerabweichungen für dasselbe Serum beobachtet werden, wenn es mit verschiedenen serologischen Nachweisverfahren getestet wird. Solche Abweichungen sind darauf zurückzuführen, dass die bei den verschiedenen Techniken verwendeten TOXOPLASMA-Antigene unterschiedliche Membran- und lösliche Antigenanteile enthalten 2) Testvalidierung Analyse der mit den Kontrollseren bei jeder Mikrotiterplatte in jedem Test erhaltenen Ergebnisse. Für die Validierung des Tests müssen folgende Kriterien eingehalten werden. Extinktion:. DO R3 0,200. DO R4c 1,000 Verhältnis:. DO R4a / DO R3 2 Werden diese Spezifikationen nicht erfüllt, so ist der Test zu wiederholen. 72 3)Verlauf der Eichkurve a) Erstellung der Eichkurve Auf Millimeterpapier werden auf der vertikalen Achse (Y-Achse) die DE- Werte der Kontrollseren (R4a, R4b, R4c) und R3 aufgetragen. Die entsprechende Konzentration in IE/ml wird auf der horizontalen Achse (X- Achse) aufgetragen. Die Kurve einzeichnen. b) Bestimmung der Antikörper-Konzentration (IE/ml) der untersuchten Probe An Hand des für jede untersuchte Probe ermittelten DE-Werts kann die jeweilige Konzentration an anti-t. gondii IgG-Antikörpern bestimmt werden: 1) Auf der Y-Achse den der Probenextinktion entsprechenden Wert suchen, anschließend eine horizontale Linie bis zur Standardkurve ziehen 2) Am Schnittpunkt eine Senkrechte bis zur X-Achse fällen. Die Konzentration in IE/ml am Schnittpunkt mit der X-Achse ablesen.

NB: Die IE/ml einer Probe können nur dann berechnet werden, wenn die für die 1:101 oder 1:1010 verdünnte Probe ermittelte Extinktion zwischen den DE-Werten für R4a und R4c der Eichkurve liegt. Bei Kontrollseren, die auf 1:1010 verdünnt wurden, sind die auf der X- Achse erhaltenen Werte mit 10 zu multiplizieren. 4)Auswertung der Ergebnisse Durch die quantitative Bestimmung der gegen T. gondii gerichteten IgG- Antikörper mit dem Platelia TM Toxo IgG TMB Testkit kann der Immunstatus eines Patienten bestimmt werden. Titer < 6 IE/ml: keine signifikante Konzentration bei dieser Methode = kein Immunschutz. 6 IE/mL Titer 9 IE/mL keine signifikante anti-t. gondii-igg-konzentration = das Ergebnis dieses Tests allein ist kein ausreichender Beweis für den Immunstatus des Patienten gegenüber T. gondii gemäß den in Frankreich von der Nomenklatur vorgesehenen Bestimmungen; es ist daher mit einer neuen Blutprobe eine Kontrolluntersuchung mit mindestens 2 Methoden vorzunehmen, darunter mindestens eine, die von der bei der ersten Untersuchung verwendeten abweicht. 9 IE/mL < Titer 240 IE/mL signifikante anti-t. gondii-igg-konzentration = frühere Immunität bzw. Serokonversionsbeginn Titer > 240 IE/ml hohe anti-t. gondii-igg-konzentration = kürzliche Serokonversion bzw. persistierende hohe Antikörperkonzentration bei bestimmten Patienten. Verfahrensgrenzen Die Diagnose einer kürzlich erfolgten Infektion durch den Parasiten kann nur auf der Basis von klinischen und serologischen Daten gestellt werden. Das Ergebnis einer einzigen Bestimmung stellt keinen ausreichenden Beweis für die Diagnose einer rezenten Infektion dar. Nur die Kombination klinischer und serologischer Daten (signifikante Erhöhung des anti-t. gondii-igg-titers von 2 Seren eines Patienten, die im Abstand von mindestens 3 Wochen entnommen und im Laufe einer einzigen Bestimmung getestet wurden mit dem Nachweis von anti-t. gondii-igm- Antikörpern in signifikanter Konzentration) erlaubt die Diagnose einer rezenten Infektion durch den Parasiten. Es ist notwendig, auch IgG- Antikörper gegen T. gondii im Rahmen der serologischen Überwachung 73

von schwangeren Frauen nachzuweisen, da die IgG-Antikörper gegen T. gondii eventuell etwas später als die IgM-Antikörper auftreten können (Platelia TM Toxo IgM TMB-Testkit). 5)Fehlerursachen Nicht validierte oder nicht reproduzierbare Reaktionen haben häufig folgende Ursachen: Unzureichendes Waschen der Mikrotiterplatte, Verunreinigung negativer Proben durch Serum oder Plasma mit hohem Antikörpertiter, Verunreinigung der Entwicklungslösung durch Oxidationsmittel (Natronbleichlauge, Metallionen...), Verunreinigung der Stopplösung. 6)Beispiele für mit PLATELIA TM TOXO IgG TMB erzielte Ergebnisse Hinweis: Folgende Daten werden nur als Beispiele angeführt und dürfen nicht anstelle der vom Benutzer erzielten Ergebnisse verwendet werden. Ergebnistabelle Seren und Standards E gemessen bei Endkonzentration in IE/ml 450 nm - 620 nm STANDARDS R3 0,121 0 R4a 0,615 6 R4b 1,466 60 R4c 2,099 240 SEREN / VERDÜNNUNGEN Serum Nr. 1 (1:101) 0,108 Negativ Serum Nr. 2 (1:101) 0,675 7 IE/ml Serum Nr. 3 (1:101) 0,808 12 IE/ml Serum Nr. 4 (1:101) 2,080 231 IE/ml Serum Nr. 5 (1:101) 1,283 43 IE/ml *Hinweis: Bei Verdünnungen auf 1:1010 das erzielte Ergebnis mit 10 multiplizieren Testvalidierung: - Extinktion:. DO R3 0,200. DO R4c 1,000 74 Verhältnis: - DO R4a / DO R3 2

11- LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN DES VERFAHRENS Es wurden Studien mit Proben in Trockenröhrchen, Röhrchen mit Serumseparator, Röhrchen mit Gerinnungsaktivator oder Röhrchen mit verschiedenen Antikoagulanzien (EDTA, Heparin und Citrat) durchgeführt. 1.Leistungen Die nachstehend aufgeführten Leistungen des Platelia TM Toxo IgG TMB wurden an 2 verschiedenen Standorten mit frischen Serumsproben von schwangeren Frauen, immundeprimierten Patienten oder als gesund betrachteten Blutspendern sowie mit tiefgefrorenen negativen und positiven Serumsproben ermittelt. Vergleichende Studien Bei diesen Studien wurde Platelia TM Toxo IgG TMB mit anderen handelsüblichen EIA-Tests verglichen. Die Analyse der abweichenden Ergebnisse wurde mit einer anderen Methode, der sogenannten Direktagglomeration, durchgeführt. Die relative Übereinstimmung, die relative Spezifizität und die relative Sensitivität bei frischen Seren wurden an 1 Standort bestimmt (ausschließlich der 23 zweifelhaften Proben). Platelia TM Toxo IgG TMB Ergebnis Negativ Positiv Insgesamt Anderer EIA-Test Negativ 488 0 488 Positiv 5 271 276 Insgesamt 493 271 764 Ergebnisse der prospektiven Studie Relative Spezifizität 488/488 100% (99,0 100,0) Relative Sensitivität 271/276 98,2% (95,6 99,3) Relative Übereinstimmung 759/764 99,3% - (98,8 99,9) Sensitivitätsstudien: Die Sensitivität des Tests Platelia TM Toxo IgG TMB wurde an 2 unabhängigen Standorten ermittelt. Die für die vorherige Charakterisierung der Proben verwendeten Tests Toxo IgG ELISA sind käuflich. Ein Agglutinationstest wurde als 3. Methode zur Lösung der abweichenden Ergebnisse verwendet. 75

Die Ergebnisse der Spezifizität (außer zweifelhaften Proben) sind: - Standort 1: 100 % (196/196) - Standort 2: 98,2 % (271/276) Insgesamt: 98,9 % (467/472) Die Serokonversions- (Standorte 1 und 2) oder Infektionsbehandlungs- Paneels (Standort 1) setzten sich wie folgt zusammen: 84 Proben von 33 schwangeren Frauen 48 Proben von 14 schwangeren Frauen die mit Platelia TM Toxo IgG TMB getestet wurde. Die für die vorherige Charakterisierung der Proben verwendeten Tests Toxo IgG ELISA sind käuflich. Ein Agglutinationstest wurde als 3. Methode zur Lösung der abweichenden Ergebnisse verwendet. Am Standort 1 weist Platelia TM Toxo IgG TMB in 5 Fällen die Serokonversionen jeweils mit einem Vorsprung von 1 oder 2 Blutproben gegenüber dem als Vergleich verwendeten EIA-Test nach. Am Standort 2 weist Platelia TM Toxo IgG TMB in 6 Fällen eine Verspätung von 1 oder 2 Proben gegenüber dem als Vergleich verwendeten Test auf. Spezifizitätsstudien Die Spezifizität des Tests Platelia TM Toxo IgG TMB wurde an 2 unabhängigen Standorten ermittelt. Die für die vorherige Charakterisierung der Proben verwendeten Tests Toxo IgG ELISA sind käuflich. Ein Agglutinationstest wurde als 3. Methode zur Lösung der abweichenden Ergebnisse verwendet. Die Ergebnisse der Spezifizität (außer zweifelhaften Proben) sind: Standort 1: 99,8 % (403/404) Standort 2: 100 % (488/488) Insgesamt: 99,9 % (891/892) Prävalenz Die Prävalenz der positiven Antwort auf spezifische Antikörper vom Typ IgG gegen T. gondii ist von Land zu Land, ja selbst von Region zu Region sehr verschieden. In der Pariser Region beträgt sie 67,6% bei den Blutspendern. 76

FREQUENZ 80 70 60 50 40 30 20 10 0 68 69 0 <2 [2-4[ Histogramm der Verteilung 10 1 1 3 2 5 0 0 0 TITER IE/ml MIT 216 SEREN 30 32 34 31 23 65 [4-6[ [6-8[ [8-10[ [10-20[ [20-40[ [40-80[ [80-160[ [160-240[ Platelia Toxo G TMB EIA Assay 22 17 19 > 240 0 2.Präzision Intraassay-Varianz: 3 positive und 1 negative Probe wurden 30mal in demselben Ansatz getestet. Probe Negativ Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 Verhältnis Titer IE/ml Titer IE/ml Titer IE/ml Mittelwert 0,25 11 38 110 Standardabweichung 0,02 0,83 1,35 9,53 VK % 6,29 7,57 3,55 8,64 Interassay-Varianz: 3 positive und 1 negative Probe wurden in Dreifachbestimmung an 5 verschiedenen Tagen von jeweils 2 Technikern getestet Probe Negativ Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 Verhältnis Titer IE/ml Titer IE/ml Titer IE/ml Mittelwert 0,22 11,8 39,2 127,5 Standardabweichung 0,08 1,65 5,14 14,13 VK % 34,11 13,90 13,10 11,08 77

Kreuzreaktivitätsstudien 141 für Marker, die Kreuzreaktionen erzeugen können, positive Proben: Spezifizität = 99,29 % (140/141). Probe / Marker Zahl Zahl Bemerkung reaktiv CMV IgG 5 1 Negativ nach Kontrolle CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0 Mumps IgG 7 0 Mumps IgM 3 0 Rubeola IgG 7 0 Rubeola IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0 Rubella IgG 5 0 Rubella IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Myelom 8 0 RF 15 0 ANA 10 0 HAMA 3 0 Insgesamt 141 1

12 REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443. 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581. 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285. 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxo-plasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 18, 271-275. 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315. 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIVinfected patients.aids 1996; 10, 1521-1527. 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J.: Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234. 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988). 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906. 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913. 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G.: Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977. 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. : Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158. 13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158. 14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805. 15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222. 16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262. 17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxo-plasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49. 18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332. 19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660-663.

20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269. 21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983. 22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69. 23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115. 25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316.

ZUSAMMENFASSUNG DER TESTDURCHFÜHRUNG 1. Den Thermostaten des Inkubators auf 37±1 C einstellen. 2. Das Chromogen R9 im Substrat R8 auf 1:11 verdünnen (Entwicklungslösung: R8+R9). 3. Die Waschlösung R2 auf 1:10 verdünnen (R2d). 4. Ale Vertiefungen 1mal mit der verdünnten Waschlösung waschen (R2d). 5. Die Kontrollseren und Proben mit R7 auf 1:101 verdünnen. 6. Die auf 1:101 verdünnten Kontrollseren und Proben wie folgt in die Vertiefungen geben. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Für 1 Stunde bei 37 C bebrüten. 8. Die Konjugatlösung durch Verdünnung von R6 in R7 auf 1:50 herstellen 9. Absaugen, dann 3mal mit der verdünnten Waschlösung (R2d) waschen. 10.200 µl Konjugatlösung (R6 + R7) in alle Vertiefungen geben. 11.1 Stunde lang bei 37 C bebrüten. 12.Absaugen, dann 4mal mit der verdünnten Waschlösung (R2d) waschen. 13.200 µl enzymatische Entwicklungslösung (R8+R9) in alle Vertiefungen pipettieren. 14.30 Minuten lang bei Raumtemperatur (+18-30 C) unter Lichtabschluss pipettieren. 15.100 µl Stopplösung (R10) in alle Vertiefungen pipettieren. 16.Die Extinktionen mit dem Spektrophotometer bei 450/620 nm ablesen. 79

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