Quelle: www. quarks. de!geschichte!nomenklatur!eigenschaften von chiralen Arzneistoffen! enantiomeric excess!beispiele von chiralen Arzneistoffen!Anforderung an die Enantiomerenanalytik!Trennung durch Kristallisation als Diastereomerensalze!Chromatographische Trennung (Bsp.: HPLC, GC)!Kapillarelektrophoretische Trennung 1
1815 J.B. Libout Rotation von polarisiertem Licht in!quarz 1848 L. Pasteur Trennung von Natriumammoniumtartrat 1874 Van`t Hoff / Le Bel Asymmetrisches CAtom, Tetraedermodell 1938 E. Fischer Konfiguration der ()Glucose 1966 R.S. Cahn, C. Ingold, V. Prelog R/S Nomenklatur GilAviv Gaschromatographische Trennung Isomere Stereoisomere Strukturisomere (optisch inaktiv) Enantiomere (optisch aktiv) Diastereomere Atropisomere MesoVerbindungen (optisch inaktiv) Epimere (optisch aktiv) Anomere (optisch aktiv) 2
!! Gleiche chemische und physikalische Eigenschaften (gegenüber achiralen Medien) Schmelzpunkt spektroskopische Eigenschaften (UV, IR, Fluoreszenz, MS) pk a /pk b Werte, Redoxpotential, Nucleophilie...!! Unterschiedliche Eigenschaften gegenüber chiralen Medien linear polarisiertes Licht (! Drehwertbestimmung im Polarimeter) chemische Umsetzungen mit chiralen Reagenzien Wichtig für Arzneistoffe: Wechselwirkungen mit Proteinen!! Pharmakodynamische Unterschiede (Wechselwirkungen mit Enzymen, Rezeptoren, Ionenkanälen...)!! Pharmakokinetische Unterschiede (Proteinbindung, Metabolisierung und Verteilung)!! ca. 80 % der synthetischen chiralen Arzneistoffe sind als Racemat im Handel!! 98% der semisynthetischen oder natürlich vorkommenden AS sind enantiomerenrein im Handel 3
Wirkstoff (R)Enantiomer (S)Enantiomer Asparagin süß bitter Adrenalin 30x aktiver als (S) Chloramphenicol (R,R) antibakteriell (S,S) inaktiv Thalidomid nicht (?) teratogen teratogen Ethambutol (R,R) Erblindung (S,S) tuberkulostatisch Dopa passive Diffusion aktive Diffusion Ibuprofen Tranylcypromin (R) inaktiv, aber Inversion zu (S) () MAOHemmer, () NAReuptakehemmer (antidepressiv) ( E 1 E 2 ) ee (%) = x 100 ( E 1 E 2 ) E 1 = Konzentration des Enantiomers 1 E 2 = Konzentration des Enantiomers 2 Was sagt mir eine ee Angabe? ee = 0% bedeutet Es liegt ein Racemat (50:50) vor! ee = 100% bedeutet Die Substanz ist enantiomerenrein! ee = 90% bedeutet Es liegt ein 95:5 Gemisch zweier Enantiomere vor! 4
G. Subramanian (ed.): A Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography, VCH Weinheim (1994) p2 Als Racemat werden eingesetzt: Ibuprofen Pyrantel Methadon Propranolol Thiopental Cetirizin Chloroquin Warfarin Promethazin Oxazepam Metoprolol Verapamil Phenprocoumon Salbutamol Ofloxacin Omeprazol (chiraler Schwefel) Cyclophosphamid (chiraler Phosphor) Ifosfamid (chiraler Phosphor) Als reines Enantiomer werden eingesetzt: Acetylcystein (R) Cetirizin (R) Levodopa (S) Pramipexol (S) Folsäure (S) Ibuprofen (S) Methotrexat (S) Levomethadon (R) Levofloxacin (S) Adrenalin (R) Omeprazol (S) 5
Ascorbinsäure (4R,5S) Diltiazem (2S,3S) Chloramphenicol (1R,2R) Captopril (S,S) Pilocarpin (3S,4R) Ephedrin (1R,2S) Tramadol (1S,2S 1R,2R; trans bzw. ZRacemat) 2 1 1 2 6
!! hohe Empfindlichkeit (Nachweisgrenze << 1%)!! gute Reproduzierbarkeit!! kostengünstig (Geräte, Durchführung der Messung)!! geringer Substanzbedarf!! geringer Zeitaufwand!! Messung ohne aufwändige Probenvorbereitung!! keine Artefaktbildung (v.a. keine Racemisierung) präparativ:!! Isolierung des enantiomerenreinen Arzneistoffes nach der Synthese analytisch:!! Bestimmung der Enantiomerenreinheit während der Produktion!! Untersuchungen zur Pharmakokinetik und zum Metabolismus invitro und invivo 7
Prinzip: für Basen: Zum Racemat (RS) wird ein enantiomerenreines (R oder S) Fällungsreagenz gegeben Äpfelsäure, Mandelsäure, Weinsäure und derivate, Camphersulfonsäure Base (R,S) Säure (R)! diastereomere Salze ( Kation (R), Anion (R) und Kation (S), Anion (R) ) für Säuren: Nachteile: Ephedrin, Brucin, Chinin, Phenylethylamin zeitaufwändig, nicht für analytische Anwendungen geeignet 1. Trennung als Diastereomere nach Derivatisierung zu mit (S)1Phenylethylisocyanat (PEIC) für Aminosäuren S S S S SPhenylalanin Diastereomere R S R S RPhenylalanin Trennung an RP18 möglich Nachteile: quantitative Umsetzung notwendig Reagenz muss sehr rein sein zeitaufwändig, nur für analytische Anwendungen 8
1. Trennung als Diastereomere nach Derivatisierung mit enantiomerenreiner/m MosherSäure/Chlorid Derivatisierung von!alkoholen mit Säure zum Ester!Aminen mit Säurechlorid zum Amid Mit MosherReagenz derivatisierte Enantiomere können mit Hilfe von 19 FNMR auf ihre Reinheit (% ee) überprüft werden Diastereomere 2. Direkte Trennung an chiralen (pseudo)stationären Phasen Methoden: Prinzip: Vorteil: HPLC, GC, CE Unterschiedlich starke Wechselwirkungen (WW) der Enantiomere in einer chiralen Umgebung ("!"!, ionisch, Wasserstoffbrücken, DipolWW) analytisch und präparativ nutzbar 9
Chiraler Selektor: R(()N(3,5Dinitrobenzoyl) phenylglycin) (DNBPG) Mobile Phase: nhexan / 2Propanol 80/20 (V/V) Flussrate: 1 ml/min Detection: UV 254 nm Probe:Oxazepam (0.5mg/ml) 10
Chiralpak AD: Amylosederivat Warfarin Verapamil Mobile Phase: nhexan/2propanol/ Diethylamin = 90:10:0.1 (V:V:V) Flussrate: 1.0 ml/min Mobile Phase: nhexan/ethanol/ Diethylamin = 50:50:0.1 (V:V:V) Flussrate: 0.7 ml/min SFC = supercritical fluid chromatography Chiralpak: Amylosederivat Welch et al.; CHIRALITY, Issue 3, Volume 19, 2007 11
Chiralpak: Amylosederivat Welch et al.; CHIRALITY, Issue 3, Volume 19, 2007 Chiracel OD: Cellulosetrisphenylcarbamat Ibuprofen Propranolol nhexan/2propanol/cf 3 COOH=100:1:0.1(V:V:V) Flussrate: 1 ml/min nhexan/2propanol/diethylamin=80:20:0.1(v:v:v) Flussrate: 1 ml/min 12
Chiraspher NT: poly(nacryloylsphenylalanine ethyl ester) Oxazepam Mobile Phase: nheptan/tetrahydrofuran 50/50 (V/V) Flussrate: 1.0 ml/min Jung et al.; CHIRALITY, Issue 3, Vol. 19, 2007 Enantiomeric Analysis of Aminoacids by Using GCxGC 13
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Hochspannungsquelle ANNAHME: Die Kapillarwand hat keinen Einfluß Wanderungsrichtung und Wanderungsgeschwindigkeit der Analyten sind nur von der Ladung und der elektrophoretischen Mobilität abhängig N v eff = z. e 6"#r E z. e eff. Ladung E Feldstärke #$ Viskosität r Ionenradius 15
S i O H S i O H phabhängigkeit des EOF Deprotonierung der Silanolgruppen v EOF = & % 4"# E Quarz a b a starre Grenzschicht b diffuse Grenzschicht E Feldstärke$ % ZetaPotential #$ Viskosität &$ Dielektrizitätskonstante LM$ Definition: Durch Dissoziation der Silanolgruppen der inneren Oberfläche der Quarzkapillare wird die Kapillarwand negativ aufgeladen und die Pufferlösung im Inneren der Kapillare erhält einen Überschuß an positiven Ladungsträgern (Kationen). Durch elektrostatische Anziehung lagern sich die Kationen der Pufferlösung an die Kapillarwand an, und zwar zum einen in Form einer starren (unbeweglichen) Grenzschicht direkt an der Kapillaroberfläche und zum anderen in einer diffusen (beweglichen) Grenzschicht in weiterem Abstand zur Kapillarwand. Bei Anlegen einer Spannung beginnen sich die Kationen der diffusen Grenzschicht in Richtung Kathode zu bewegen. Infolge eines osmotischen Effektes bewegt sich auch das sie umgebende Lösungsmittel mit und es kommt zu einem Nettostrom der Pufferlösung in Richtung der Kathode. Diesen Effekt bezeichnet man als elektroosmotischen Fluss (EOF). 16
N N N Stempelförmiges Flussprofil t M Zeit [min] phabhängigkeit von v EOF und v EFF Deprotonierung der Silanolgruppen Protonierungsgrad der Analyten v = v EOF v EFF Veränderung des Trennsystems Auswirkungen auf den EOF phwert des Puffers EOF wenn ph Pufferkonzentration EOF wenn Pufferkonz. Temperatur Org. Lösungsmittel (ACN, MeOH...) Viskositätsveränderung, evtl. auch Selektivitätsänderung Komplexe Veränderungen, meist Änderung der Selektivität Chem. Veränderung der Reduzierung / Umkehr des EOF Kapillarwand (lin. Polyacrylamid, Methylcellulose) 17
Cyclodextrine native (', (, )CD) substituierte CD nichtionische (Methyl, Hydroxypropyl, Hydroxyethyl...) anionische (Carboxymethyl, Sulfobutyl, Sulfoethyl...) kationische (Trimethylammoniumhydroxypropyl...) Chirale Kronenether Chirale Mizellbildner (SDSDigitonin, Gallensäuren,...) Glykopeptide (Vancomycin, Rifamycin) Proteine (HSA, BSA, AGP) 62% aller Enantiomerentrennungen in der CE mit Cyclodextrinen als chirale Selektoren! Cyclodextrin => 6!DGlucoseEinheiten " Cyclodextrin => 7!DGlucoseEinheiten # Cyclodextrin => 8!DGlucoseEinheiten b a c Durch die chirale Information in der Struktur der Zucker wird im Cyclodextrin eine chirale Umgebung erzeugt! CD ' ( ) Dimension a b c 5.7 13.7 7.8 7.8 15.3 7.8 9.5 16.9 7.8 Kavitäts 3 volumen Å 174 262 427 18
Formel: * * Chemische Eigenschaften: Zwitterion (saure Carboxylfunktion, basischer Stickstoff am Piperazinring); IEP = 7,4 ein Chiralitätszentrum ( * ) (Das S()Enantiomer ist je nach Keimart 8128 mal stärker wirksam als das R()Enantiomer) Handelsnamen: Tarivid : R,S(±)Ofloxacin (1984) Tavanic : S()Ofloxacin (Levofloxacin, 1998) Qualitative Bestimmung von OfloxacinEnantiomeren in Humanurin mit Hilfe der Kapillarelektrophorese Elektrophoretische Bedingungen: Laufpuffer: 100mM H 3 PO 4 mit Triethylamin auf ph 2,0 eingestellt Chiraler Selektor: 45mM Hydroxypropyl(Cyclodextrin (D.S.=0,8) Kapillare: fused silica; 20/27 cm 50!m I.D. x 375!m O.D. Spannung: 20kV Injektion: hydrodynamisch; 5 sec (Urinproben) bzw. 10 sec (wässrige Standardlösung) bei 0,5 psi Detektion: UVDetektion, 280 nm * max =294 nm 19
Grundlagen: H. Engelhardt: Kapillarelektrophorese F. Tagliaro, G. Manetto, F. Crivellente, F.P. Smith: A brief introduction to capillary electrophoresis, Forensic Science International, 92 (1998), 7588 H. Wätzig: Grundlagen der Kapillarelektrophorese, PZ Prisma, 3 (1996), 126136 Chirale Trennungen: S. Fanali, Z. Aturki, C. Desiderio: New strategies for chiral analysis of drugs by capillary electrophoresis, Forensic Science International, 92 (1998), 137155 20