Enantiomerenanalytik und CE

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1 Quelle: www. quarks. de Enantiomerentrennung von Arzneistoffen Geschichte omenklatur Eigenschaften von chiralen Arzneistoffen enantiomeric excess Beispiele von chiralen Arzneistoffen Anforderung an die Enantiomerenanalytik Trennung durch Kristallisation als Diastereomerensalze Chromatographische Trennung (Bsp.: PLC, GC) Kapillarelektrophoretische Trennung

2 1815 J.B. Libout Rotation von polarisiertem Licht in αquarz 1848 L. Pasteur Trennung von atriumammoniumtartrat 1874 Van`t off / Le Bel Asymmetrisches CAtom, Tetraedermodell 1938 E. Fischer Konfiguration der ()Glucose 1966 R.S. Cahn, C. Ingold, V. Prelog R/S omenklatur GilAviv Geschichte Gaschromatographische Trennung omenklatur von Isomeren Isomere Stereoisomere Strukturisomere (optisch inaktiv) Enantiomere (optisch aktiv) Diastereomere Atropisomere MesoVerbindungen (optisch inaktiv) Epimere (optisch aktiv) Anomere (optisch aktiv)

3 Eigenschaften von Enantiomeren Gleiche chemische und physikalische Eigenschaften gegenüber achiralen Medien Schmelzpunkt spektroskopische Eigenschaften (UV, IR, Fluoreszenz, MS) pk a /pk b Werte, Redoxpotential, ucleophilie... Unterschiedliche Eigenschaften gegenüber chiralen Medien linear polarisiertes Licht ( Drehwertbestimmung im Polarimeter) chemische Umsetzungen mit chiralen Reagenzien Wichtig für Arzneistoffe: Wechselwirkungen mit Proteinen Chirale Arzneistoffe Pharmakodynamische Unterschiede (Wechselwirkungen mit Enzymen, Rezeptoren, Ionenkanälen...) Pharmakokinetische Unterschiede (Proteinbindung, Metabolisierung und Verteilung) ca. 80 % der synthetischen chiralen Arzneistoffe sind als Racemat im andel 98% der semisynthetischen oder natürlich vorkommenden AS sind enantiomerenrein im andel

4 Chirale Arzneistoffe Wirkstoff (R)Enantiomer (S)Enantiomer Asparagin süß bitter Adrenalin 30x aktiver als (S) Chloramphenicol (R,R) antibakteriell (S,S) inaktiv Thalidomid nicht (?) teratogen teratogen Ethambutol (R,R) Erblindung (S,S) tuberkulostatisch Dopa passive Diffusion aktive Diffusion Ibuprofen Tranylcypromin (R) inaktiv, aber Inversion zu (S) () MAemmer, () AReuptakehemmer (antidepressiv) Enantiomerenüberschu berschuß ( enantiomeric excess, ee ) ( E 1 E 2 ) ee (%) = x 100 ( E 1 E 2 ) E 1 = Konzentration des Enantiomers 1 E 2 = Konzentration des Enantiomers 2 Was sagt mir eine ee Angabe? ee = 0% bedeutet Es liegt ein Racemat (50:50) vor! ee = 100% bedeutet Die Substanz ist enantiomerenrein! ee = 90% bedeutet Es liegt ein 95:5 Gemisch zweier Enantiomere vor!

5 Chirale Zentren (außer vierbindiger Kohlenstoff) G. Subramanian (ed.): A Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography, VC Weinheim (1994) p2 Als Racemat werden eingesetzt: Ibuprofen Pyrantel Methadon Propranolol Thiopental Cetirizin Chloroquin Warfarin Promethazin Rosiglitazon xazepam Bisoprolol Metoprolol Verapamil Phenprocoumon Salbutamol floxacin meprazol (chiraler Schwefel) Cyclophosphamid (chiraler Phosphor) Ifosfamid (chiraler Phosphor) Chirale Arzneistoffe mit einem chiralen Zentrum Als reines Enantiomer werden eingesetzt: Acetylcystein (R) Cetirizin (R) Levodopa (S) Pramipexol (S) Folsäure (S) Ibuprofen (S) Methotrexat (S) Levomethadon (R) Levofloxacin (S) Adrenalin (R) meprazol (S)

6 Chirale Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (I) Ascorbinsäure (4R,5S) Diltiazem (2S,3S) Chloramphenicol (1R,2R) 5 4 C C S Captopril (S,S) C Pilocarpin (3S,4R) C 3 S 2 3 C3 C 3 2 C 1 C 2 C CCl 2 C Cl 2 C C C 3 Chirale Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (II) Ephedrin (1R,2S) 3 C 1 2 C C 3 C C 3 C 3 3 C 1 2 C 3 1R,2S L()Ephedrin 1S,2R D()Ephedrin 1R,2R L()Pseudoephedrin 1S,2S D()Pseudoephedrin erythroreihe threoreihe Tramadol (1S,2S 1R,2R / ZRacemat) 3 C C C C C3 3 C

7 Anforderungen an die Enantiomerenanalytik hohe Empfindlichkeit (achweisgrenze << 1%) gute Reproduzierbarkeit kostengünstig (Geräte, Durchführung der Messung) geringer Substanzbedarf geringer Zeitaufwand Messung ohne aufwändige Probenvorbereitung keine Artefaktbildung (v.a. keine Racemisierung) Anwendungen von Enantiomerentrennungen in Industrie und Forschung präparativ: Isolierung des enantiomerenreinen Arzneistoffes nach der Synthese analytisch: Bestimmung der Enantiomerenreinheit während der Produktion Untersuchungen zur Pharmakokinetik und zum Metabolismus invitro und invivo

8 Trennung von Enantiomeren mittels Kristallisation als Diastereomerensalze Prinzip: für Basen: Zum Racemat (RS) wird ein enantiomerenreines (R oder S) Fällungsreagenz gegeben Äpfelsäure, Mandelsäure, Weinsäure und derivate, Camphersulfonsäure Base (R,S) Säure (R) diastereomere Salze ( Kation (R), Anion (R) und Kation (S), Anion (R) ) für Säuren: achteile: Ephedrin, Brucin, Chinin, Phenylethylamin zeitaufwändig, nicht für analytische Anwendungen geeignet Chromatographische Trennung von Enantiomeren (Ia) 1. Trennung als Diastereomere nach Derivatisierung zu mit (S)1Phenylethylisocyanat (PEIC) für Aminosäuren S 2 C C 3 S C S C S SPhenylalanin C 3 Diastereomere R C 2 C 3 S C R C S RPhenylalanin Trennung bspw. an RP18 möglich achteile: quantitative Umsetzung notwendig Reagenz muss sehr rein sein zeitaufwändig, nur für analytische Anwendungen C 3

9 Chromatographische Trennung von Enantiomeren (Ib) 1. Trennung als Diastereomere nach Derivatisierung mit enantiomerenreiner/m MosherSäure/Chlorid Derivatisierung von F 3 C Me (S)Mosher SCl 2 A/ERkt. Cl F 3 C Me (R)MosherChlorid Alkoholen mit Säure zum Ester Aminen mit Säurechlorid zum Amid Mit MosherReagenz derivatisierte Enantiomere können mit ilfe von 19 FMR auf ihre Reinheit (% ee) überprüft werden (R)MosherChlorid Me 2 (S) Cl F 3 C (S) Me Me (S) (R)MosherChlorid Me 2 (R) Cl F 3 C (S) Me Me (R) Diastereomere Chromatographische Trennung von Enantiomeren (II) 2. Direkte Trennung an chiralen (pseudo)stationären Phasen Methoden: Prinzip: Vorteil: PLC, GC, CE Unterschiedlich starke Wechselwirkungen (WW) der Enantiomere in einer chiralen Umgebung (π π, ionisch, Wasserstoffbrücken, DipolWW) analytisch und präparativ nutzbar

10 Chirale stationäre Phasen (CSP`s) für r die PLC Typ Autor Jahr Chiraler Selektor Interaktion Fließmittel Substrate Bemerkungen I Pirkle ,5dinitrobenzoyl)phenyglycin Wasserstoffbrücken rganisch elektronenreiche enges Einsatzgebiet und andere ASDerivate π π Wechselwirkungen Aromaten II kamoto 1986 PolysaccharidDerivate Wasserstoffbrücken, rganisch oder viele Substrate auch chemische Selektivität Inklusionskomplexe wässrig mit Ionenzusatz hohe Probenkapazität III Armstrong u.a Cyclodextrine Inklusionskomplexe wässrig einige A`s, AS Blaschke 1974 Polacryl und metacrylamide Inklusionskomplexe rganisch einige A`s hohe Probenkapazität Cram 1975 Kronenether Inklusionskomplexe rganisch wenige IV Davankow u.a Prolin Ligandenaustausch wässrig mit Cu 2 Aminosäuren mit Metallkomplexen V Allenmark u.a Protein hydrophobe und wässrige Puffer viele Substrate geringe Probenkapazität (αagp, BSA, vomuceid) Wasserstoffbrücken geringe Stabilität Beispiele für f direkte Enantiomerentrennungen: PirkleSäulen (Typ I) Chiraler Selektor: R(()(3,5Dinitrobenzoyl) phenylglycin) (DBPG) Mobile Phase: nexan / 2Propanol 80/20 (V/V) Flussrate: 1 ml/min Detection: UV 254 nm Probe:xazepam (0.5mg/ml)

11 Beispiele für f direkte Enantiomerentrennungen: PolysaccharidDerivate (Typ II) Chiralpak AD: Amylosederivat Warfarin Verapamil Mobile Phase: nexan/2propanol/ Diethylamin = 90:10:0.1 (V:V:V) Flussrate: 1.0 ml/min Mobile Phase: nexan/ethanol/ Diethylamin = 50:50:0.1 (V:V:V) Flussrate: 0.7 ml/min Beispiele für f direkte Enantiomerentrennungen: PolysaccharidDerivate (Typ II) SFC = supercritical fluid chromatography Chiralpak: Amylosederivat Welch et al.; CIRALITY, Issue 3, Volume 19, 2007

12 Beispiele für f direkte Enantiomerentrennungen: PolysaccharidDerivate (Typ II) Chiralpak: Amylosederivat Welch et al.; CIRALITY, Issue 3, Volume 19, 2007 Beispiele für f direkte Enantiomerentrennungen: PolysaccharidDerivate (Typ II) Chiracel D: Cellulosetrisphenylcarbamat Ibuprofen Propranolol nexan/2propanol/cf 3 C=100:1:0.1(V:V:V) Flussrate: 1 ml/min nexan/2propanol/diethylamin=80:20:0.1(v:v:v) Flussrate: 1 ml/min

13 Beispiele für direkte Enantiomerentrennungen: Polyacrylamide (Typ III) Chiraspher T: poly(acryloylsphenylalanine ethyl ester) xazepam Mobile Phase: neptan/tetrahydrofuran 50/50 (V/V) Flussrate: 1.0 ml/min Beispiele für direkte Enantiomerentrennungen: Aminosäurederivate (Typ IV) Jung et al.; CIRALITY, Issue 3, Vol. 19, 2007 Enantiomeric Analysis of Aminoacids by Using GCxGC

14 Enantiomerentrennung an Proteinphasen (Typ( V): α1glycoprotein (AGP) Kapillar elektrophorese

15 Instrumenteller Aufbau ochspannungsquelle Die Elektrophoretische Mobilität AAME: Die Kapillarwand hat keinen Einfluß Wanderungsrichtung und Wanderungsgeschwindigkeit der Analyten sind nur von der Ladung und der elektrophoretischen Mobilität abhängig z. e v eff = E 6πη πηr z. e E η r eff. Ladung Feldstärke Viskosität Ionenradius

16 Der Elektroosmotische Fluss Si Si pabhängigkeit des EF Deprotonierung der Silanolgruppen v EF = ε ζ 4πη E E ζ η ε Quarz Feldstärke ZetaPotential Viskosität Dielektrizitätskonstante LM a b a starre Grenzschicht b diffuse Grenzschicht Der Elektroosmotische Fluss Definition: Durch Dissoziation der Silanolgruppen der inneren berfläche der Quarzkapillare wird die Kapillarwand negativ aufgeladen und die Pufferlösung im Inneren der Kapillare erhält einen Überschuß an positiven Ladungsträgern (Kationen). Durch elektrostatische Anziehung lagern sich die Kationen der Pufferlösung an die Kapillarwand an, und zwar zum einen in Form einer starren (unbeweglichen) Grenzschicht direkt an der Kapillaroberfläche und zum anderen in einer diffusen (beweglichen) Grenzschicht in weiterem Abstand zur Kapillarwand. Bei Anlegen einer Spannung beginnen sich die Kationen der diffusen Grenzschicht in Richtung Kathode zu bewegen. Infolge eines osmotischen Effektes bewegt sich auch das sie umgebende Lösungsmittel mit und es kommt zu einem ettostrom der Pufferlösung in Richtung der Kathode. Diesen Effekt bezeichnet man als elektroosmotischen Fluss (EF).

17 Elektrophoretische und Elektroosmotische Mobilität t M Stempelförmiges Flussprofil Zeit [min] pabhängigkeit von v EF und v EFF Deprotonierung der Silanolgruppen Protonierungsgrad der Analyten v = v EF v EFF Möglichkeiten zur Beeinflussung des EF Veränderung des Trennsystems Auswirkungen auf den EF pwert des Puffers EF wenn p Pufferkonzentration EF wenn Pufferkonz. Temperatur rg. Lösungsmittel (AC, Me...) Viskositätsveränderung, evtl. auch Selektivitätsänderung Komplexe Veränderungen, meist Änderung der Selektivität Chem. Veränderung der Reduzierung / Umkehr des EF Kapillarwand (lin. Polyacrylamid, Methylcellulose)

18 Chirale Selektoren in der CE Cyclodextrine native (α, β, γcd) substituierte CD nichtionische (Methyl, ydroxypropyl, ydroxyethyl...) anionische (Carboxymethyl, Sulfobutyl, Sulfoethyl...) kationische (Trimethylammoniumhydroxypropyl...) Chirale Kronenether C C C C 18Krone6Tetracarbonsäure Chirale Mizellbildner (SDSDigitonin, Gallensäuren,...) Glykopeptide (Vancomycin, Rifamycin) Proteine (SA, BSA, AGP) ative Cyclodextrine als chirale Selektoren 62% aller Enantiomerentrennungen in der CE mit Cyclodextrinen als chirale Selektoren α Cyclodextrin => 6 αdglucoseeinheiten β Cyclodextrin => 7 αdglucoseeinheiten γ Cyclodextrin => 8 αdglucoseeinheiten b a c Durch die chirale Information in der Struktur der Zucker wird im Cyclodextrin eine chirale Umgebung erzeugt! CD α β γ Dimension a b c Kavitätsvolumen Å

19 floxacin Formel: F C C F C 3 * C 3 3 C * C3 Chemische Eigenschaften: Zwitterion (saure Carboxylfunktion, basischer Stickstoff am Piperazinring); IEP = 7,4 ein Chiralitätszentrum (*) (Das S()Enantiomer ist je nach Keimart 8128 mal stärker wirksam als das R()Enantiomer) andelsnamen: Tarivid : R,S(±)floxacin (1984) Tavanic : S()floxacin (Levofloxacin, 1998) Praktikumsaufgabe Qualitative Bestimmung von floxacinenantiomeren in umanurin mit ilfe der Kapillarelektrophorese Elektrophoretische Bedingungen: Laufpuffer: 100mM 3 P 4 mit Triethylamin auf p 2,0 eingestellt Chiraler Selektor: 45mM ydroxypropylβcyclodextrin (D.S.=0,8) Kapillare: fused silica; 20/27 cm 50 µm I.D. x 375 µm.d. Spannung: 20kV Injektion: hydrodynamisch; 5 sec (Urinproben) bzw. 10 sec (wässrige Standardlösung) bei 0,5 psi Detektion: UVDetektion, 280 nm λ max =294 nm

20 Literaturhinweise CE Grundlagen:. Engelhardt: Kapillarelektrophorese F. Tagliaro, G. Manetto, F. Crivellente, F.P. Smith: A brief introduction to capillary electrophoresis, Forensic Science International, 92 (1998), Wätzig: Grundlagen der Kapillarelektrophorese, PZ Prisma, 3 (1996), Chirale Trennungen: S. Fanali, Z. Aturki, C. Desiderio: ew strategies for chiral analysis of drugs by capillary electrophoresis, Forensic Science International, 92 (1998),