Elektrophoretische Methoden Teil 2: Kapillarelektrophorese

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1 Elektrophoretische Methoden Teil 2: Kapillarelektrophorese Dr. Cornelia Kasper Universität Hannover Institut für Callinstr Hannover Germany

2 Gliederung Prinzip der Kapillarelektrophorese Gerätetechnik Kapillaren, Injektionsmethoden, Detektionsmethoden Elektrophoretische Wanderung Elektroosmotischer Fluss (EOF) Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE) Micellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC) Kapillargelelektrophorese (CGE) Isoelektrische Fokussierung (CIEF) Isotachophorese (ITP) Beispielgerät für die Kapillarelektrophorese

3 Prinzip der Kapillarelektrophorese

4 Prinzip der Kapillarelektrophorese Kapillarelektrophorese: Trägerfrei in einem offenen Rohr (Kapillare) CE (capillary( electrophoresis) Kapillarlängen: cm Innendurchmesser der Kapillare: µm cm µm

5 Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Stromtransport, konstanter ph-wert Beispiele: Phosphat- und Citratpuffer bei saurem ph Borat- und TRIS-Puffer bei basichen ph Auch zwitterionische Puffer Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehreren hundert V/cm Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µa) Detektion: on-column UV-Absorption direkt durch die transparente Kapillare

6 Gerätetechnik

7 fused-silica Silica-Kapillare Hochspannungs- versorgung 2 Elektroden Pufferreservoirs On-Column Column-Detektor Moderne Geräte: Probengeber Fraktionssammler Hydrodynamischen Injektionssystem Kapillarthermo- statisierungseinheit Gerätetechnik

8 Kapillaren UV transparente Materialien: fused-silica amorpher Quarz Borsilikatglas Teflon Geringer Durchmesser: Effiziente WärmeableitungW Mechanische Stabilität: t: Außenoberfl enoberfläche der Kapillare mit Polyimidschicht geschützt Entfernen für f Detektion nötig (Skalpell oder Flamme)

9 Hydrodynamische Injektion Vakuum auf der Detektionsseite Druck auf der Einlassseite Gravitationskraft durch Anheben der Einlassseite Elektrokinetische Injektion Injektionsmethoden

10 Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese Geringes Injektionsvolumen keine Bandenverbreiterung Gesamtvolumen der Kapillare wenige µl Probenvolumen einige nl Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Routineanalytik Probenvolumen V i bei der hydrodynamischen Injektion V i = 4 p Π r 8 η L t Abhängig von: Druckdifferenz p, Injektionszeit t, Kapillarlänge L, Viskosität η,, Kapillarradius r

11 Elektrokinetische Injektion Aufgebrachtes Probenmenge nimmt mit der Mobilität der Proben-Ionen zu Injizierte Proben- menge hängt von der Probenmatrix ab Hydrodynamische Injektion Unhabhängig ngig von der Mobilität t der Probenmatrix Electrode Electrode

12 Detektionsmethoden Absorptions-Detektor I Lambert-Beersche Beersche-Gesetz = log = ε c I UV-Detektor Diodenarray-Detektor Detektor (DAD) Photodiodenarray-Detektor (PDA) Empfindlichkeit: mol Anwendungen: Proteine, aromatische Verbindungen 0 A d Indirekte UV-Detektion (Proben ohne Absorption im UV-Bereich) Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption Negatives Signal Empfindlichkeit: mol Anwendungen: Organische und anorganische Ionen, Zucker UV-Detektion Detektorzelle TCI Kapillare Negatives Signal Institut für

13 Fluoreszenz-Detektor Molekülanregung lanregung Abgabe der Anregungsenergie durch spontane Emission (Fluoreszenz) Signalintensität ist direkt proportional der Intensität der eingestrahlten Anregungsenergie Lampenanregung: Empfindlichkeit: mol Anwendungen: derivatisierte Aminosäuren, DNA, Peptide, Protein Laserinduzierte Fluoreszenz: Hohe Empfindlichkeit: mol Anwendungen: DNA-Fragmente, derivatisierte Aminosäuren TCI Kapillare Fluoreszenz Institut für

14 Massenspektrometrie-Detektor Empfindlichkeit: mol Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring z.b. ESI-MS (Electrospray( Ionization)

15 Elektrophoretische Wanderung

16 Elektrophoretische Wanderung Zunehmende Spannung und damit wachsende Feld- stärke E führt zu Erhöhung der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit v EPH der Ionen LEFF v EPH = µ EPH E = t Elektrophoretische Mobilität µ EPH, effektive Kapillarlänge L EFF Migrationszeit t M Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegt Kräftegleichgewicht + K R E +z M K B - EFF, K R = Reibungskraft K B = Beschleunigungskraft v EPH

17 Beschleunigungskraft K B Reibungskraft K R (Stokesches Gesetz) Wanderungsgeschwindigkeit v EPH = z F E 6 π η r N A K B K R z F E = N = 6 A π η r v z = effektive Ladung des Ions F = Faraday-Konstante N A = Avogadrozahl η = dynamische Viskosität r = Stokescher Radius des Ions Für die elektrophoretische Mobilität µ EPH ergibt sich damit: z F µ EPH = 6 π η r N A

18 Anlegen von Spannung (10 bis 30 kv) Trennung aufgrund verschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten der Probe im Trennpuffer Berechnung der Mobilität µ EPH im elektrischen Feld E µ EPH L U Elektrisches Feld fällt f über gesamte Länge L der Kapillare ab (L GES ) Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge L (L EFF ) (bis zum Detektor) in der Migrationszeit (t M ) E Elektrophoretische Trennungen nur möglich m bei unterschiedlicher Mobilität t der Ionen = L t M EFF = L EFF t M GES

19 Elektroosmotischer Fluss

20 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Negativ geladene Kapillarwand (fused( silica) Hydratisierte Kationen akkumulieren nahe der Kapillarwand Elektroosmotischen Fluß (EOF) in Richtung der Kathode bei Anlegen eines elektrischen Feldes

21 Trennungsprinzip Interaktionen der Analyten mit dem EOF Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol) Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)

22 Unbehandelte Kapillaren (uncoated( uncoated) Elektrophoretische Geschwindigkeit Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF) Gesamtgeschwindigkeit: Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (v EPH ) und elektroosmotischer (v( EOF )Geschwindigkeit Diffuse Doppelschicht Zeta-Potenital

23 Ladungsunterschiede an der Innenseite der Kapillare (diffuse Doppelschicht) resultieren in Zeta-Potential (ζ) Zeta-Potential und damit der EOF ist abhängig von der Dissoziation der Silanolgruppen und dadurch vom ph- Wert der Elektrolytlösung Basischer ph EOF höher h her als Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen Auch Anionen werden durch den EOF zur Kathode transportiert Saurer ph EOF geringer als Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen

24 Flussprofil des EOF ist stempelförmigen Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterung bei Wanderungsgeschwindigkeit (v( EOF ) des EOF: v EOF ε E ζ = 4 π η Dielektrizitätskonstante tskonstante ε, Zeta-Potential ζ,, Viskosität η

25 Elektrischer Stromfluss führt f zu Joulescher Wärme- entwicklung Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand resultierender Temperaturgradient Maximale Trenneffizienz kleiner Temperaturgradient Verringerung Kapillarinnendurchmesser Flüssigk ssigkühlung der Kapillare Temperaturgradient verursacht Viskositätsgradienten tsgradienten Auswirkung aufs Flussprofil Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität t (Kapillarwand) Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität t (Kapillarmitte)

26 Kapillarzonenelektrophorese

27 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Trennung nach Unterschied in Größe und Ladung Zunächst wird die Probe (AB) in die Kapillare injiziert Unter Einfluss des elektrischen Feldes wird die Probe in diskrete Zonen (A und B) unterteilt, die ihrerseits Analyten mit der gleichen elektrophoretische Mobilität enthalten Puffer, ph-wert, elektrische Feldstärke bleiben konstant

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29 Peakverbreiterung Verursachung durch longitudinale Diffusion Eingangsprofil sei unendlich schmal örtliche Varianz der Konzentrationsverteilung durch die Einstein- Gleichung bestimmt 2 σ = 2 D t z 2 σ z Diffusionskoeffizient D; Zeit t Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zu

30 Elektrodispersion zusätzlicher Peakverbreiterung Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede Mobilität t von Analyt-Ion und Puffer-Ion nicht ähnlich Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größ ößer als Analyt- Ion (> Faktor 100) Mobilität t des Proben-Ion ua < Puffer-Ion uce Peak-Tailing ua > uce Peak-Leading (Fronting)

31 Auflösung R zweier Peaks R t 2 4 σ Migrationszeiten t 1 und t 2 zweier aufeinanderfolgender Peaks; gemittelte Standardabweichung σ t = Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert: = N 4 Theoretische Trennstufen N, Mobilität u t t 1 u u 2 1 R u

32 Anforderungen an den Puffer Selektivität t für f r die zu trennenden Ionen ph-wertstabilit Wertstabilität,, Pufferkapazität t (Reproduzierbarkeit) Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge nge Anpassung der Mobilität t zwischen Probe- und Pufferion Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität t besitzen (kleine Ströme) Reproduzierbare Herstellung des Puffers Stabilität t des Puffers

33 Trennungsoptimierung Variation folgender Parameter: ph-wert Ionenstärke Temperatur Kapillarbelegung Pufferzusätze

34 Beispiel-Electropherogramm

35 Kapillaraffinitätselektrophorese

36 Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE) Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einem Rezeptor und Liganden Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie Unterschied in der Mobilität t zwischen Protein und dem gebildeten Komplex Ligand trägt eine Ladung Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlich von der des Proteins

37 Micellarelektrokinetische Chromatographie

38 Micellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC) Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien)) zum Puffersystem pseudostationäre Phase aus geladenen Micellen Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischen Lösung und Micelleninneren

39 Neutralmoleküle le erhalten elektrophoretische Mobilität t u i u i ' ki 1+ k = umc ' i Abhängig von Mobilität t der Mizelle u MC und dem Kapazitätsfaktor tsfaktor k i Kapazitätsfaktor tsfaktor k i ist Verhältnis der Analytaufenthalts- zeit in der mobilen zur pseudostationären Phase k ' i = t o t i 1 t 0 t t i MC

40 Auflösung R zweier Komponenten t0 1 ' N α 1 k 2 tmc R = ' { α 1+ k t 2 0 ' 1+ k Effizienz 1 Selektivität tmc Re tention Verbesserung der Auflösung durch: Steigende Micellbildnerkonzentration Vergröß ößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs Wahl unterschiedlicher Micellbildner Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen w Phase

41 Kapillargelelektrophorese

42 Kapillargelelektrophorese (CGE) Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungs Ladungs- verhältnissen DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzen bei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/ Ladungsverhältnissen Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert die elektrophoretische Wanderung der größeren Moleküle stärker als die der kleineren Vergleich mit klassischen Gelelektrophorese Vorteile Schneller Trennzeiten Online-Detektion Geringer Arbeits- und Geräteaufwand Nachteile Keine präparative Probensammlung Keine parallele Trennung mehrerer Proben Nicht zweidimensional durchführbar

43 Isoelektrische Fokussierung

44 Isoelektrische Fokussierung (CIEF) Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in die Kapillare Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt( Anolyt), eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt( Katholyt). Anlegen der Spannung ph-gradient Ampholyt- Ionen wandern entsprechend ihrem pi. Bei pi = ph endet die elektrophoretische Wanderung. Anode + Diffusion E-Feld Kathode + Ladung des - - Verd. H 3 PO 4 Analytmoleküls ph = pi ph-gradient Verd. NaOH

45 Isotachophorese

46 Isotachophorese (ITP) Trennung nach Größe und Ladung Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt (TE) Mobilität t Leitelektrolyt > Mobilität t aller Analyt-Ionen Mobilität t Endelektrolyt < Mobilität t aller Analyt-Ionen Anlegen konstanten Stroms Bildung eines Feldstärken rken- gradients Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B) an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte Feldstärkengradient verhindert Diffusion scharfer Zonengrenzen

47 Beispielgerät für die Kapillarelektrophorese

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50 Quellen F. Lottspeich/H. Zorbas,, Bioanalytik H.Engelhardt, W.Beck,, T. Schmitt, Kapillarelektrophorese Altria,, Kevin; Oliver J. Schmitz; P.W. Atkins, Physikalische Chemie

51 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!