Immunhistochemie kompakt

Immunhistochemie kompakt Eine Einführung in die wichtigsten Grundlagen zu Theorie und Praxis Esther Osterwalder, immunhistochemischen www.kantonsspitalbaden.ch/baden. Beispiel einer Untersuchung an einem Darmtumor. Esther Osterwalder ICH 1/30

Themen Seite Anwendung/Panel 3-6 Verarbeitung/Merkpunkte 6-9 Was sind Antigene 9 / 10 Was sind Antikörper (AK) 11-14 Bindung zwischen den beiden 14 / 15 Methoden 15-18 Chromogene 18-20 Gegenfärben 20 Eindecken 21 Arbeitstechnik 21 / 22 Ein möglicher ICH-Färbevorgang 22-24 Problemmanager 24 / 25 Hintergrund 25 / 26 Einkauf von AK 27 ICH-Färbevorgang Resultat 28-30 Bildmaterial aus Unterlagen der Firma DAKO Schweiz. Basiswissen / Stein Unterlagen Knochenseminar Heidelberg / E.Osterwalder Internetrecherchen PathoPic Esther Osterwalder ICH 2/30

Immunhistochemie kompakt Eine Einführung in die wichtigsten Grundlagen zu Theorie und Praxis Immunhistochemie = IHC Immun = Prinzip der Antigen-Antikörperreaktion Histo = das biologische Untersuchungsgut ist Gewebe Chemie = enzymatische (histochemische) Reaktion zur Sichtbarmachung Warum IHC? Primärtumor/Metastase? Klassifizierung und Diagnose von wenig differenzierten malignen Tumoren (Ursprung) Klassifizierung von Lymphomen und Leukämien Identifikation von Erregern Aus dem Resultat lässt sich eine korrekte Diagnose ableiten und diese wiederum bildet die Grundlage für die bestmögliche Therapie und prognostische Aussagen. Anwendung in der Pathologie Erste Begutachtung des HE-Schnittes durch die ärztliche Person ergibt eine Verdachtsdiagnose, die mit entsprechender Immunhistochemie (Marker/pAK) gesichert werden muss. Eine Befunddiagnose allein aufgrund der ICH kann irreführend sein. Meist werden mehrere Marker, sogenannte Panels zur Diagnosefindung mittels Ausschlussverfahren eingesetzt. Esther Osterwalder ICH 3/30

Beispiel : Panel zur Diagnosefindung bei einer Schlecht differenzierten Neoplasie Es werden 5 verschiedene Marker eingesetzt 1. Cytokeratin (CK) 2. Vimentin (Vim) 3. Leukozyten-communes Antigen (LCA) 4. Desmin (Des) 5. S-100 Es sind folgende Resultatkombinationen möglich a) CK+ Möglicherweise handelt es sich hier um ein Karzinom. Vim+/- LCA- weitere Marker notwendig Des- S-100+/- b) CK- Möglicherweise handelt es Vim+/- sich hier um ein Melanom LCA- speziellen Melanoma - Des- Marker verwenden S-100+/- Esther Osterwalder ICH 4/30

c) CK- Möglicherweise handelt es sich hier um ein Lymphom. Vim+/- LCA+ spezielle Lymphoma- Des- Marker verwenden S-100- z.b. bei Verdacht auf ein Mantelzelllymphom (B- Zellen) Panel: CD 5 (pos) CD 10 (neg) CD 23 (neg) Leichketten > Cyclin D 1 (pos) d) CK-/+ Möglicherweise handelt es sich hier um ein Sarkom. Vim+/- LCA- speziellen Sarkoma-Marker verwenden Des- S-100+/- Esther Osterwalder ICH 5/30

e) Falls alle 5 Marker positiv oder alle negativ sind, liegt der Verdacht einer Fehlmanipulation nahe Wiederholung der Nachweise mit Kontrollgewebe ist angezeigt. Beispiele für Fragestellungen, die immunhistochemisch angeklärt werden: Abklären des Ursprungs eines Tumors (Primärtumor oder Metastase) und von Mikrometastasen im Sentinel-Lymphknoten Undifferenzierte/ niedrig differenzierte Malignome wie grosszellig: Karzinome, Lymphome, Sarkome kleinzellige: Lymphome, Neuroblastom, Wilms-Tumor spindelzellig: Karzinome, Melanome, Sarkome Differentialdiagnostische Unterscheidung von Mesotheliom zu Adenokarzinom z.b. bei Lungentumoren prognostisch relevanter Nachweise wie Rezeptoren, Proliferationsmarker, Onkoproteine z.b. bei Mammatumoren Heute kann IHC an folgendem Material angewendet werden - Gefrierschnitt - Paraffinschnitt - Zellpräparate der Zytologie Es kann mit den laborüblichen Verarbeitungsmethoden gearbeitet werden unter Beachtung einiger Merkpunkte: Formalin nur bis höchstens 48 Std. anbieten (besser 24 Std.) - 4-10% gepuffertes Formalin ph 7.0 7.4 - natives Gewebe innerhalb von 30 min. fixieren Merke: Die Fixierung mit 4% gepuff. Formalin vernetzt Proteine = Maskierung. Die Epitope der Antigene werden durch die Vernetzung in ihrer räumlichen Struktur verändert und überlagert. Sie können von den Antikörpern nicht mehr erkannt werden. Hitze / proteolytische Vorbehandlung bricht teilweise diese Vernetzung auf und stellt die Konformation der Epitope am Antigen wieder her. Störende Ca ++ - Ionen werden mit dem verwendeten Zitratpuffer gebunden. Die Fixation - Fixierungsmittel, Dauer, Konzentration, Temperatur - des Gewebes kann das Ergebnis der ICH entscheidend beeinflussen. Esther Osterwalder ICH 6/30

Zu kurze Fixierung: - Beeinträchtigung der Morphologie und - erhöhte Empfindlichkeit der Epitope auf Reagenzien und Temperatur beim Einbettungsprozess Zu lange Fixation: - Epitope werden bei vernetzenden Fixierungsmitteln durch zu starke Veränderung nicht mehr zugänglich. Keine Beschleunigung der Fixierung durch Wärme Kleine Proben - maximal 10x10x3 mm Wenn möglich Fettgewebsanteil reduzieren (z.b. bei Mamma, Lymphknoten) Vermeiden von Wochenend-/Feiertagprogrammen im Einbettautomaten Optimale Mikrotomie - Entwässern und Einbetten weichen leicht von der Routine ab: optimale Temperatur des Ethanols und des Intermediums < 45 C und des Paraplast < 60 C. - je nach Nachweis variiert die Schnittdicke von 2 bis 5 µm; nur einwandfreie Schnittqualität verwenden und auf Superfrost-Plus-Objektträger/Spezial-OTs montieren. Abschwimmen verhindern durch Absaugen des Wassers unter dem Schnitt nach der Schnitt-Montage sowie Antrocknen der Schnitte mindestens 60 Min. bei höchstens 60 C. Schonender: über Nacht im 37 C / 54 C im Wärmeschrank. Korrekte Vorbehandlung der Schnittpräparate inkl. der Kontrollschnitte Vorbehandlungen erfolgen nach dem Entparaffinieren mit Xylol und der absteigenden Ethanolreihe bis A. dest./puffer Merke: Schnitte nie austrocknen lassen! Entparaffinieren: - Xylol, mindestens 20 Min - rehydrieren bis A. dest - einstellen in Pufferlösung: Esther Osterwalder ICH 7/30

Häufige Puffer in der IHC Stammlösung TRIS-Puffer 0.05 M ph 7.6 Rezept : 6.1 gr TRIS-Base (Trishydroxymethylaminomethan) in 50 ml A. dest. lösen. 37 ml HCl 1N hinzufügen und mit A. dest. auf 1000 ml auffüllen. ph-wert bei 25 C 7.6 (+/- 0.2 Abweichung) Gebrauchslösung TBS = TRIS-gepufferte Kochsalzlösung Es werden 100 ml Stammlösung TRIS mit 900 ml physiologischer Kochsalzlösung gemischt. Dieser Puffer nützt bei der Reduzierung der Hintergrundanfärbung. PBS-Puffer = phosphatgepufferte Kochsalzlösung 0.01 M, ph 7.2 Puffer werden gebraucht bei Antikörperverdünnung Tris PBS, ph 7,0 TBS, ph 7,6 Medium mit Tween 20 oder Waschpuffer PBS, ph 7,0 TBS, ph 7,6 Tween 20 oder Antigendemaskierung mit Hitze (Vorbehandlung) Citratpuffer, ph 6,0 Target Retrieval Lösung, ph 6,1 Target Retrieval Lösung, ph 9,9 EDTA-Puffer, ph 8,0 Tris-HCl, 5% Harnstoff, ph 9,5 - Nicht vergessen: Positivkontrollschnitt, der das gesuchte Antigen gesichert enthält; wenn möglich gleich fixiert usw. wie die Probe. Kommt das Antigen im gesunden Gewebe vor, kann man auf eine zusätzlich pos. Ko verzichten = interne Kontrolle Negativkontrollschnitt, der das gesuchte Antigen auf keinen Fall enthält oder man trägt anstelle des pak Normalserum auf (pak = primärer Antikörper) Esther Osterwalder ICH 8/30

IHC - geeignetes Detektionssystem wählen Mikroskop : Qualitätssicherung aller IHC-Nachweise vor deren Abgabe zur Diagnose (Datenblätter erstellen) Was sind Antigene? Antigene sind zb. hochmolekulare Proteine, Glykoproteide, Lipoproteide, Nukleoproteide, die eine Antikörperbildung gegen bestimmte determinante Gruppen, Epitope, auslösen und mit solchen Antikörpern eine spezifische Bindung eingehen. Eigenschaften 1. Die Fähigkeit Antikörperbildung hervorzurufen (Immunogenität) 2. Spezifisch mit dem gebildeten Antikörper zu reagieren (Spezifität) Von aussen eindringende Proteine werden als körperfremd identifiziert und so zum Antigen. Antigen-Demaskierung / Antigen-Retrieval ergibt sich als Folge der Vernetzungsreaktionen mit Formalin. Der verunmöglichte/ erschwerte Zugang zu den Epitopen der Antigenoberfläche wird als Maskierung bezeichnet. Diese Maskierung gilt es vor der eigentlichen AG-AK-Reaktion aufzubrechen und der Vorgang heisst Demaskierung. Es sind je nach Epitop bzw. Antikörper verschiedene Methoden der Demaskierung auszuführen. Demaskierung oder Versteckte Antigene sichtbar machen mit: Mikrowelle Esther Osterwalder ICH 9/30

Dampfkochtopf Autoklav Wasserbad 90 95 C Steamer Proteolytischer Vorbehandlung mit Enzymen wie: Kombination der Methoden zb. Mikrowelle + Trypsin Trypsin Pronase Proteinase K Pepsin Papain Esther Osterwalder ICH 10/30

Was sind Antikörper? Von Plasmazellen (aus B-Zellen differenziert) produzierte Serumproteine, die bei Kontakt mit dem Antigen gebildet werden. Typische Y-förmige Struktur mit 2 leichten und 2 schweren Ketten. Herstellung von Antikörper Subkutane Injektion des Antigens beim Tier (Kaninchen, Maus) B-Zellen werden aktiviert differenzieren zu Plasmazellen und produzieren nun Antikörper. Jede Plasmazelle bildet immer nur gegen dasselbe Epitop des Antigens ihren Antikörper. zb.: Besitzt ein Antigen 5 verschiedene Epitope, so produzieren 5 Plasmazellen je einen Antikörper dagegen. Es entsteht ein Gemisch. Esther Osterwalder ICH 11/30

Polyklonale Antikörper (häufig Kaninchen) - Polyklonale Antikörper finden ein Antigen über die verschiedenen Epitope Bleibt ein Epitop maskiert (Formalin), so kann es dennoch über die andere Epitope erkannt werden - Hintergrundfärbung möglich Bevorzugt gearbeitet wird heute mit: Monoklonalen Antikörpern (häufig Maus) -Sie erkennen nur ein Epitop ihres Antigenes -Sie scheinen spezifischer -Demaskierung meist notwendig Esther Osterwalder ICH 12/30

Arbeitsverdünnung der Antikörper/Antikörper austesten Die Antikörper können bereits gebrauchsfertig oder als Konzentrat eingekauft werden. Konzentrat: Je mehr spezifische Antikörper-Moleküle pro ml, desto höher ist der Titer (Konzentration des Antikörpers) und desto höher ist die erforderliche Arbeitsverdünnung, die keine Hintergrundreaktion mehr aufzeigt. Je höher die Arbeitsverdünnung eines Antikörpers, desto weniger unspezifische Hintergrundanfärbung. z.b. 1:5 = niedrig 1:500 = mittel 1: 9'000 = hoch Verdünnungsmedien für Antikörper ist Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS, ph 7.2-7.6): 1. richtige Menge Puffer vorlegen 2. und gibt dann den Antikörper dazu Ansonsten binden sich die Antikörper an die Behälterwand anstatt an das Trägerprotein. Geeignete Behälter aus Polypropylen und carbonat verwenden. Man kann Antikörper stärker verdünnen, wenn man die Inkubationszeit verlängert oder bei Verwendung sensitiver Detektionssystemen. Inkubationszeit : 30 60 Min. Schnellkits heute : 10 Min. Pro Schnitt werden 100-200 µl verdünnter Antikörper benötigt (je nach Grösse des Schnittepräparates) Beeinflussung des Resultates durch : Temperatur Esther Osterwalder ICH 13/30

Wahl der Verdünnungslösung Art der Fixierung Gewebeart Jedes Labor muss die optimale Antikörper-Verdünnung selber ermitteln. Antigen Antikörperreaktionen gehören zu den spezifischsten Reaktionen in der Biologie. Die Antigen-Antikörper-Bindung (Affinität/Bindungsstärke) beruht auf - elektrostatischer Anziehung - Wasserstoffbrückenbindung - Van-der-Waals-Bindung - keiner kovalente Bindung Esther Osterwalder ICH 14/30

Man kennt folgende 3 Reaktionsmuster von Antikörpern, die sich aus dem Ort des Antigens ergeben - zytoplasmatisch - nukleär - membranständig Je nach Nachweis und Antikörper können verschiedene Methoden angewandt werden. Signalverstärkte Methoden sind sensitiver als die anderen. Bildlegende zu häufig angewandten Methoden / www.dako.ch blaue Dreiecke = Biotin rote Kreuze = (Strept)Avidin Häufig angewandte indirekte Methoden/Synonyme*: PAP, APAAP, ABC, LSAB, Envision TM *, EPOS*, CAS Esther Osterwalder ICH 15/30

Indirekte 2 Schritt- Methode 1. Unkonjugierter Antikörper bindet an Epitop 2. Enzymkonjugierte sekundäre Antikörper binden an primären Antikörper (Direkte Methode (Kein Bild) 1. Enzymkonjugierter primärer AK bindet an das Epitop) PAP Methode Peroxidase-Anti-Peroxidase 1. Unkonjugierter primärer AK (nicht aus Kaninchen) bindet an antigene Determinante. 2. Sekundärer AK (=Brückenantikörper, aus Kaninchen) bindet an primären AK. 3. PAP-Komplex besteht aus Peroxidase und Antikörper der gegen Peroxidase gerichtet ist, sowie aus einem Maus-AK (tertiärer AK), der gegen Kaninchen gerichtet ist. PAP-Komplex bindet an den sekundären AK. Antikörper = AK APAAP Methode Alkalische Phosphatase Anti Alkalische Phosphatase 1. Unkonjugierter primärer AK bindet an Epitop 2. Sekundärer AK (Brückenantikörper), der mit Maus- IgG-Antikörper gegen alkalische Phosphatase konjugiert ist, bindet an primären AK Esther Osterwalder ICH 16/30

ABC Methode (Strept)Avidin-Biotin-Complex- Methode 1. Unkonjugierter primärer AK bindet an Epitop 2. Biotinmarkierter (biotinylierter) Sekundärantikörper bindet an primären AK 3. Enzymmarkierter (Strept)Avidin-Biotin-Komplex reagiert mit biotinyliertem sekundären AK LSAB Methode Labeled (Strept) Avidin-Biotin-Methode 1. Primärer AK bindet an antigene Determinante 2. Sekundärer biotinylierter Brückenantikörper bindet an primären AK 3. Enzymmarkiertes (Strept)Avidin bindet an Biotin des Brückenantikörpers. Envision TM Polymerkonjugat-Methode 1. Sekundärer AK ist mit enzymmarkiertem Polymer-konjugat konjugiert 2. Primärer unkonjugierter AK bindet an Epitop 3. Sekundärer AK bindet an primären AK Der Nachweis besteht aus zwei Schritten mit Doppelmarkierung Esther Osterwalder ICH 17/30

EPOS TM Enhanced Polymer One Step Staining 1. Primärer AK ist mit einem polymerkonjugat aus Dextran gekoppelt. 2. Primärer AK bindet an Epitop. Zusätzlich befinden sich auf dem Polymer ein Reihe von Enzymen (Meerrettichperoxodase). Neben durchschnittlich 70 Enzymmolekülen können 10 AK an das Polymer gebunden werden CAS-Methode Catalyzed Signal Amplifikation 1. Primärer AK bindet an Epitop 2. Biotinylierter sekundärer AK (= Brückenantikörper) bindet an primären AK 3. Enzymmarkierter Avidinkomplex bindet an Brückenantikörper 4. Spezielles Amplifikationsreagenz enthält Biotin-haltiges Substrat, das durch die gebundene Peroxidase katalytisch in eine reaktive und unlösliche Form überführt wird 5. Das abgelagerte Biotin vermittelt die Bindung von Peroxidase-markiertem Streptavidin es werden zusätzlich Enzymmoleküle angelagert zur Signalverstärkung Der letzte Schritt bei den obigen Methoden ist jeweils nicht erwähnt: die Visualisierung durch Zugabe eines Chromogens (Substrat). Das Enzym wandelt das farblose Chromogen in einen Farbkomplex um. NBT - Neufuchsin = (rot) Esther Osterwalder ICH 18/30

DAB-Reaktion: Enzyme HRP (Peroxidase aus Meerrettich) AP (Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm) Chromogene werden kurz vor Gebrauch nach Vorschrift hergestellt. Immunenzymatische Färbemethoden nutzen Enzym-Substratreaktionen, um farblose Chromogene in gefärbte Endprodukte umzuwandeln (vergl. auch Indikatoren der Enzymnachweise). Drei häufige Chromogene DAB = Diaminobenzidin Farbreaktion braun Substrat Peroxidase in organischen Lösungsmitteln unlöslich AEC = 3-Amino-9-Ethylcarbazol Farbreaktion rotbraun Substrat Peroxidase in organischen Lösungsmitteln löslich Esther Osterwalder ICH 19/30

Neufuchsin Farbreaktion rot Substrat Alkalische Phosphatase: teilweise in org. Lösungsmitteln löslich Jede Inkubationszeit und -temperatur hat Einfluss auf die Qualität eines immunhistochemischen Nachweises. So besteht zwischen Inkubationszeit und Antikörpertiter ein umgekehrtes Verhältnis: je höher der Antikörpertiter, desto kürzer die Inkubationszeit. Häufig verwendet man als Inkubationszeit 10-60 Minuten für z.b. Primärantikörper. Das Gleichgewicht der Antikörper-Antigen-Reaktion wird bei 37 C rascher erreicht als bei Raumtemperatur. Eine Erhöhung Inkubationstemperatur erlaubt eine höhere Antikörperverdünnung und verkürzte Inkubationszeit. Bei 4 C (Kühlschrank) wird über Nacht inkubiert. Dauert eine Inkubation länger als 10 Minuten, sollten die Schnitte in einer feuchten Kammer inkubiert werden, damit sie nicht austrocknen ( Hintergrund) Diese Regel ist auch für Enzymnachweise gültig. Eine horizontale Lage der OTs gewährleistet eine gleichmässige Konzentration der aufgetragenen Lösungen. Gegenfärbung Zur Kontrastbildung zwischen positiven Arealen/menschliches Auge = schnelleres Lokalisieren der positiven Reaktion, macht man eine Gegenfärbung. Häufig verwendete Gegenfärbungist das Hämalaun nach P. Mayer Esther Osterwalder ICH 20/30

Eindecken sanft schräg absetzen Beim Verarbeiten vor dem Eindecken muss man darauf achten, ob das Chromogen alkohol- und xylollöslich ist oder nicht. Je nachdem muss man mit Glyceringelatine oder Eukitt/Pertex eindecken. DAB AEC Eukitt/Pertex wasserlösliches Eindeckmedium/Glyceringeatine Arbeitstechnik - Schnittdicke 2 5 µm zu dick: so viele Bindungsstellen, dass alles braun/rot wirkt. zu dünn : zu wenig Bindungsstellen. Das Resultat wirkt flau, fraglich positiv. Nachweise in den Zellkernen wie ER,PR, Cyclin D1 : 4-5µm ; lange antrocknen lassen (45-60 Min. bei 60 C); bei sehr viel Fettgewebe löst sich oft in der Mikrowelle der Gewebeschnitt leicht vom OT ab (über Nacht trocknen). Paraffinschnitte eventuell zuerst auf normalem OT strecken und dann auf speziell beschichtete IHC-OTs aufziehen. Trocknen wie die Routineschnitte.(20-30 Min. bei 60 C) Zytologiematerial benötigt weder Mikrowelle noch Enzyme, wohl aber allfällige Kontollschnitte aus der Histologie, die eine Vorbehandlung brauchen. Bei Zytologien können oft höhere AK-Verdünnungen gewählt werden. zb. Progesteron: Histo 1:25 / 3 Std. Zyto 1:50 / 1 Std. Mikrowelle : Schnitthalter immer ganz auffüllen (mit leeren OTs). Stets die gleiche Anzahl Behälter und Schnitte für ein Rezept verwenden. Ändert das Volumen, ändern die angegebenen Zeiten, evt. die Wattzahl. Verdampfte Flüssigkeit immer mit A. dest. nachfüllen: Schnitte dürfen nie austrocknen Esther Osterwalder ICH 21/30

Dampfkochtopf : Mindestens 700 ml zb. Azetatpuffer in den Topf geben. Schnitte in ein horizontales Metallgestell einfüllen und in die Lösung stellen. Kochtopf verschliessen, Heizplatte auf Maximum stellen. Nach Erscheinen des 2. Ringes vom Ventil wird der Kochtopf von der Platte genommen und die Stoppuhr eingestellt: 3 Min. warten. Sofort unter fliessendem kalten Wasser den Topf abkühlen (bis das Zischen aufhört). Öffnen und das heisse! Gestell in A. dest. 5 Min. abkühlen lassen. Pronaselösung : PBS-Spülpuffer ohne Tween 50,0 ml Protease (Tiefkühler) 50,0 mg CaCl 2 * 2 H 2 O 50,0 mg Mischen. ph 7.8 einstellen. Immer frisch! CD 21: bei Zimmertemperatur 8 Min. einstellen Ein möglicher IHC Färbevorgang: Qualitätskontrolle: Kontrollschnitte sind mitzuführen, 1x pos. + 1x neg.; Mikroskop und Datenblätter 1. Entparaffinieren a. beschriften der Objektträger (OTs) b. in OT Halter sortieren c. entparaffinieren nach Rezept: 2x 5 Min. und 1x 3 Min. Clear Rite 2x 3 Min. abs. Flex 2x 3 Min. 95% Flex - 1x 3 Min. 80% Flex A. demin. (Man kann auch das im eigenen Labor übliche Rezept verwenden.) d. in Leitungswasser spülen 2. Vorbehandlung a. OTs kurz in Citratpuffer 10 mm, ph 6.0 b. in Mikrowelle für 4 Min./120 C/Citratpuffer c. abkühlen des Behälters unter Leitungswasser 10 Min. Esther Osterwalder ICH 22/30

d. OTs in Trispuffer/Tween überführen 3. Färbung (manuell und mit Autostainer) Mit Autostainer: CD 34 a. OTs in Autostainer einlegen b. starten des Programmes. Es dauert 1: 35 h. c. nach Ablauf des Programmes die OTs in A. dest. überführen Manuell: CD 3 und CD 20 a. OTs mit Hydrogen Peroxidase Block bedecken 10 Min. einwirken lassen spülen mit Tris-Puffer b. 3 4 Tropfen Antikörper CD 3 bzw. CD 20 (grüne Lösung) auf OTs 30 Min. einwirken lassen spülen mit Tris-Puffer c. 3 Tropfen biotinylierter sekundärer Antikörper (gelbe Lösung) auf OTs 10 Min. einwirken lassen spülen mit Tris-Puffer d. 3 4 Tropfen Enzym-markiertes Streptavidin (rosa Lösung) auf OTs 10 Min. einwirken lassen spülen mit Tris-Puffer e. Herstellen der AEC-Lösung (1 Tropfen in 1 ml) Achtung: kanzerogen! 3 4 Tropfen AEC-Lösung (rote Lösung) auf OTs 20 Min. einwirken lassen spülen mit Tris-Puffer f. Alle OTs in A. dest. überführen 4. Gegenfärbung in Hämatoxylin für 1 Min. in Leitungswasser spülen Esther Osterwalder ICH 23/30

(Änderungen vorbehalten) in Blueing - Lösung (bläuen) für 30 Sek. in Leitungswasser spülen mit Mount-Medium eindecken Qualitätskontrolle: Sie mikroskopieren die fertigen Präparate nach dem Eindecken auf die Qualität des Schnittes, der Reaktion und möglicher Artefakte. Problemmanager/ Trouble shooting Häufigste Probleme Ursachen Mögliche Lösungen Hintergrundfärbung Schwache Anfärbung Ausgetrocknete Präparate Primärer Antikörper zu konzentriert Unspezifische Bindung ans Gewebe Hohe Zimmertemperatur (Sommer) beschleunigt die Reaktion des Chromogens Nekrose, ungenügende Fixierung Verbrauchte Substrat- Chromogen-Lösung Zu dünne Schnitte Verdünnungseffekt mit Spülpuffer zu gross Nie an der Luft stehen lassen; Feuchtkammern verwenden Höher verdünnen Geeignetes Proteinblockierreagenz verwenden Kürzere Inkubationszeit Anderes Gewebestück verarbeiten Neu ansetzen 2 µm oder nach Angabe Überschüssigen Puffer abklopfen Esther Osterwalder ICH 24/30

Keine Anfärbung Inkubationszeiten zu kurz Entparaffiniert? Reagenzien frisch? Reihenfolge? Mikrowelle korrekt bedient? Zeiten einhalten oder verlängern Diese vier Punkte nachkontrollieren (Datenblatt führen) Hintergrund Hie und da zeigt die IHC kein eindeutiges, klares Resultat. Eine positive Reaktion muss klare Anfärbung der Zellen zeigen: Membranoberfläche, Zytoplasma, Zellkern. Aufgrund unterschiedlicher Mechanismen entsteht unerwünschte Positivität ( Hintergrund / Hintergrundreaktion ) wie z.b.: Diffuse Anfärbung bei - Quetschartefakt - Nekrose - unvollständigem Entparaffinieren Ungleichmässig verteilte Anfärbung bei - austrocknen des Schnittes - unregelmässige Schnittdicke/Unebenheiten - OT schräg gelagert ungleichmässige Verteilung der Antikörper - Luftblasen während der Inkubation Hydrophobe Wechselwirkungen - ionische und elektrostatische Wechselwirkungen - Endogene Enzymaktivitäten Esther Osterwalder ICH 25/30

Proteine sind vor allem im Bindegewebe, Plattenepithelien und Fettzellen - oft hydrophob. Sie neigen dazu sich aneinander zu binden und Wasser zu meiden, ebenso die Immunglobuline. Der Hydrophobie kann man entgegenwirken durch optimale Verdünnungsmittel mit korrektem ph-wert und Hintergrund reduzierende Mittel wie z.b. Zusatz von 1% Rinderserumalbumin, Verwendung von Normalserum 1-5%, fettarmes Milchpulver, Casein oder der Verwendung von Detergens z.b. Tween 20. Hintergrund infolge endogener (körpereigener) Enzymaktivität Da die Farbstoffentwicklung bei der IHC durch Chromogenumsetzung durch Enzymen erfolgt, müssen endogene Enzyme blockiert oder inaktiviert werden um falsch positive Resultate zu vermeiden. Es sind dies vor allem die Peroxidase in Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrom, Katalase und die Alkalische Phosphatase in Dünndarmepithel, Leber, Nierentubuli, Knochengewebe, neutrophile Granulozyten, Endothelzellen usw. Vor der Immunreaktion: Blockierung der endogenen Peroxidase mit H 2 O 2.. Blockierung der endogenen Alkalischen Phosphatase durch 0.2-0.3 mm Levamisol in der Substrat-Chromogenlösung. Endogenes Biotin (Vitamin H) kommt in Leber, Niere, Darm, lymphatischem Gewebe vor. Es bindet an Avidin und bildet einen Avidin-Biotin-Enzymkomplex. Dies führt zu falsch positiven Resultaten bei der ABC-Methode. Hier kann man Detektionssysteme ohne Avidin und Biotin - nämlich PAP, APAAP, Dextran-Polymer - wählen. Antigendemaskierung mit Hitze fördert das Auftreten von endogenem Biotin. Blockierung von endogenem Biotin durch Inkubation mit ca. 0.05% Avidinlösung und dann mit ca. 0.01% Biotinlösung. Diese käuflichen Lösungen wirken folgendermassen: das Avidin der Lösung bindet an das endogenes Biotin noch offene Bindungsstellen des Avidin in der Lösung werden mit der Biotinlösung abgesättigt. Das gebundene endogene Biotin steht als Bindungspartner nicht mehr zur Verfügung. Qualitätskontrolle: negative Positivkontrolle oder positive Negativkontrolle bedeuten, unaufgefordert den Nachweis zu repetieren. Esther Osterwalder ICH 26/30

Antikörper einkaufen/mikroskopieren: CD 3 Formalinfixierung möglich? Ja Paraffintechnik möglich? Ja Reaktion mit menschlichem Gewebe? Ja Ist wo lokalisiert? Zellmembran Positives Kontrollgewebe? Tonsille, human Klonalität? Polyklonal Vorbehandlung? Ja Haltbarkeit? Kühlschrank, 24 Monate CD 20 Formalinfixierung möglich? Ja Paraffintechnik möglich? Ja Reaktion mit menschlichem Gewebe? Ja Ist wo lokalisiert? Zellmembran und Zytoplasma Positives Kontrollgewebe? Tonsille, human Klonalität? Polyklonal Vorbehandlung? Ja Haltbarkeit? Kühlschrank, 24 Monate CD 34 Formalinfixierung möglich? Ja Paraffintechnik möglich? Ja Reaktion mit menschlichem Gewebe? Ja Ist wo lokalisiert? Zellmembran und Zytoplasma Positives Kontrollgewebe? Tonsille, human Klonalität? Monoklonal Welcher Klon? Klon QBEnd/10 Vorbehandlung? Ja Haltbarkeit? Kühlschrank, 24 Monate Esther Osterwalder ICH 27/30

Ergebnis der Immunhistochemie (Beispiele) CD 3 T-Lymphozyten Esther Osterwalder ICH 28/30

CD 20 B-Lymphozyten Esther Osterwalder ICH 29/30

CD 34 (Clone QBEnd/10) Histologie: Endothelien CD 34 Stammzellmarker: zeigt auch Endothelien an Esther Osterwalder ICH 30/30