Institut für Pathologie Neuherberg (Direktor: Prof. Dr. Heinz Höfler) Institute of Pathology Neuherberg (Director: Prof. Dr. Heinz Höfler) DIE INSTITUTE Die Forschungsaktivitäten des Institutes konzentrieren sich auf die Entwicklung molekular-biologischer Verfahren und ihren Einsatz in Diagnostik und Prädiktion der Therapieresponse von Tumoren. Schwerpunkt dieser Forschungsarbeit ist weiterhin die Identifizierung neuer Marker und die Beziehung zwischen ihrer Expression und den histopathologischen Parametern. Da das Institut einerseits Zugang zu definierten Tumorkollektiven hat, andererseits high-throughput genomische Assays wie Expressions-Mikroarrays, Q-RT PCR, FISH, CGH sowie Proteomic-Arrays und Immunohistochemie einsetzen zu können, konzentrieren wir uns nun auf die Entwicklung diagnostischer Tools, die das Verhalten und das Potenzial eines Tumors individuell für jeden Patienten vorhersagen können. Am Jahresende waren im Institut 8 wissenschaftliche Mitarbeiter und Mitarbeiterinnen, 1 Nachwuchswissenschaftler, 2 Gast- und 3 sonderfinanzierte Wissenschaftler sowie 14,5 Techniker beschäftigt. R esearch in the Institute focuses on developing clinical molecularbiological tools for the diagnosis, and prediction of therapy response, of tumours. The mainstay of our work continues to be the identification of new markers and linking their expression with histopathological parameters. The Institute has unparalleled access to both defined tumour collections and high-throughput genomic assays such as expression microarrays, Q-RTPCR, FISH, and CGH, as well as proteomic arrays and immunohistochemistry. Using these, we have begun to concentrate on developing diagnostic tools that predict parameters of tumour behaviour and biology at the level of the individual patient, including predictive indicators of individual cancer susceptibility. At the end of the year, there were 8 scientists, 1 junior scientist, 2 visiting scientists, 3 scientists supported by grant funds, and 14.5 technicians at the Institute. Fluoreszenz in-situ Hybridisierung, sequentielle Mehrfachmarkierung an histologischen Schnitten Strategien für Mehrfachmarkierungen (Multi-color-FISH) sind sehr nützlich, um die Verwandtschaft von Sequenzen zu ermitteln, und ermöglichen die Darstellung von komplexen Amplifikationsmustern von Genen auf Tumorgewebe sowie auf Einzelzellebene durch den gleichzeitigen Nachweis von mehreren FISH-Sonden. Bisher wurden Mehrfachmarkierungen mit FISH simultan an Einzelzellen vorgenommen, so dass man bei der Auswertung sofort ein relevantes Ergebnis bekommt. Die Zahl der üblicherweise verwendeten Fluorochrome ist zur Zeit auf sieben beschränkt. Durch kombinatorisches Labelling lassen sich 181
verschiedene Farbmischungen erzeugen, so dass man alle 24 Chromosomen abdecken kann. Aber nicht jedes Fluorochrom detektiert gleich gut, so kann es bei der Auswertung zu erheblichen Schwierigkeiten kommen. Des weiteren können durch zu viele angewandte Parameter (mehrere DNA-Sonden) eine Vielzahl von Signalen in Fällen von Co-Amplifikationen bei mehreren Genen Probleme bei der Auswertung bereiten. Obwohl einige eindrucksvolle Anwendungsbeispiele der Multi-color-FISH-Methode in der Zytogenentik gezeigt worden sind, gibt es bisher keinerlei Berichte an histologischen Gewebeschnitten in der Molekularen Pathologie. Es scheint trotz vieler Verbesserungen in den Protokollen keine einfache Handhabung an histologischen Schnitten zu sein. Das Hauptproblem stellt die 3. Dimension bei Gewebeschnitten dar. Die Darstellung der 3-dimensionalen Auflösung ist limitierend. Es kann zu komplexen Überlagerungen von Fluoreszenzsignalen im Zellkern führen, und somit ist eine saubere Segmentierung der Signale bei überlappenden Kernen nicht eindeutig möglich. Um diese technischen Probleme zu umgehen, wurde bei uns eine modifizierte Fluoreszenz in situ Hybridisierung etabliert, die SML-FISH (Walch et al., 2001), die es erlaubt, eine Vielzahl von Genen auf Einzelzellebene innerhalb eines Gewebeverbandes zu untersuchen. Die Methode beruht auf mehrmals hintereinander folgenden (sequentiell) Hybridisierungen, die jeweils in denselben Zellen eines Gewebes durch ein Laser Scanning Mikroskop (LSM) erfasst werden können. Nach der ersten Hybridisierung mit einer fluoreszenzmarkierten Sonde wird mit dem LSM ein Bildstapel aufgenommen. Die Hybridisierungsstellen der verschiedenen DNA-Sonden können teils mit Hilfe digitaler Bildverarbeitung analysiert werden, der größte Teil der Auswertung wird zur Zeit noch visuell interaktiv durchgeführt. Anschließend wäscht man die Sonde ab, versetzt das Präparat mit einer neuen Sonde und schließt eine weitere Runde mit Denaturierung und Hybridisierung an. Nur so kann man eine gezielte Aussage über die unterschiedlichen Aberrationsmuster auf Einzelzellebene machen. Der große Vorteil der SML- FISH liegt darin, dass man jeder Zeit eine neue Hybridisierung mit einem interessanten Gen anschließen kann und durch die Auswertung sofort einen Bezug zu anderen relevanten Genen an der Einzelzelle hat. In Walch et al (2001) wurde mittels der SML-FISH (Proto-) Onkogene identifiziert, die mit der Karzinogenese des Barrett-Karzinoms assoziiert sind. In 16 Ösophagektomie-Präparaten wurden die Hybridisie- Rote Drüse Grüne Drüse Blaue Drüse Cyclin D1 Disomie Polysomie Amplifikation CEP 11 Disomie Polysomie Disomie Her-2/neu Amplifikation Amplifikation Amplifikation CEP 17 Polysomie Polysomie Disomie D7S486 (c-met) Polysomie Polysomie Polysomie CEP 7 Polysomie Polysomie Polysomie c-myc Polysomie Polysomie Polysomie CEP 8 Polysomie Polysomie Polysomie 20q13 Polysomie Polysomie Polysomie CEP 20 Polysomie Polysomie Polysomie Tab. 1: Heterogenitätsauswertung zu Abb. 1. 182
A Cyclin D1 B Her-2/neu DIE INSTITUTE C D CEP 11 CEP 17 E F D7S486 20 µm Abb. 1: Projektionsbilder von konfokalen Bildervolumenstapel eines gleichen Tumorareals beim Barrett-Karzinom. Die Zellkerne wurden mit DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) gefärbt. Die fluoreszenzmarkierten Sonden sind spezifisch für Cyclin D1 (A, rote Signale), Her-2/neu (B, grüne Signale), Zentromer 11 (C, gelbe Signale), Zentromer 17 (D, blaue Signale) und D7S486 (c-met) (E, orange Signale), in F sind Bereiche unterschiedlicher Kombinationen von Aberrationen farblich markiert (vgl. auch Tab. 1). 183
Untersuchung von allelischer Imbalance in Tumoren durch polymorphe Microsatelliten-Marker oder Einzel-Basen- Polymorphismen (SNPs) Normalgewebe (heterozygot) Tumor (Alleleverlust) Abb. 2: Allelotypen des Tumors (untere Reihe) und des entsprechenden Normalgewebes (obere Reihe) beim Osteosarkom eines Patienten (links) und einer Maus (rechts). Beim Menschen erfolgte die Allelotypisierung mittels Fluoreszenz-markierter, polymorpher Mikrosatelliten-Marker und bei der Maus mittels eines Tbx18-spezifischen Sequenzpolymorphismus (SNP). In beiden Fällen erkennt man deutlich den Verlust der Heterozygotie im Tumor. rungsmuster für 5 Locus-spezifische Sequenzen (c-met, c-myc, CyclinD1, Her-2/neu und 20q13) und deren korrsepondierenden Zentromersonden (CEP 7, CEP 8, CEP 11, CEP 17, CEP 20) bestimmt. Aus dieser Arbeit resultierte die Darstellung der genetischen Heterogenität beim Barrett-Karzinom und seine Vorläuferläsionen, die sich als unterschiedliches Muster von Amplifikationen innerhalb morphologischer gleicher Tumorzellen zeigt. In Tabelle 1 werden die unterschiedlichen Hybridisierungsergebnisse bei 3 Drüsen inmitten eines Tumorareals des Barrett-Karzinoms aufgezeigt. Eine vergleichende Analyse der genetischen Veränderungen in einzelnen Tumorzellen wird schematisch in Bildausschnitt F gezeigt. Die Drüsen wurden zur Veranschaulichung unterschiedlich farbig markiert (Abb. 1), dies erleichtert die Zuordnung von bestimmten Zellpopulationen, die ein spezifisches genetisches Veränderungsmuster aufweisen. Durch die modifizierte Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (SML-FISH) wurde eine Methode etabliert, die sich für zahlreiche multiparametrisch genotypische Darstellungen in situ eignet. Kartierung von Osteosarkom-spezifischen Tumorsuppressorgenen in konservierten Regionen des menschlichen und des murinen Genoms Knochentumoren stellen in der klinischen Praxis trotz ihres relativ seltenen Auftretens nach wie vor eine große Herausforderung dar. Etwa die Hälfte aller Fälle treten bei Kindern und Jugendlichen auf, wobei das Ansprechen des individuellen Tumors auf die verschiedenen chemotherapeuti- 184
D9Mit307 D9Mit133 D9Mit196 D9Mit113 D9Mit134 D9Mit9 MMU 9 Dk 5 Maus/Mensch Homologie LOC51167 HSA 6 D6S284 LOH Bereich in humanen Osteosarkome D6S1609 DIE INSTITUTE MS5 MS1 LOH Bereich in Osteosarkomen der Maus Tbx18 Nt 5 Kleinste gemeinsame Verlustregion ~ 1 Mb Tbx18 NT 5 D6S1627 D6S1601 D9Mit291 D9Mit269 Rasgrf 1 SLC35A1 tel HSA15 MMU4 tel D6S434 Abb. 3: Genomische Abschnitte mit konservierter Syntenie auf dem Maus-Chromosom 9 und dem humanen Chromosom 6 (K. Imai et al, 12. IMGC 1997). Abschnitte mit häufigem Allel-Verlust sind rechts für humane Knochentumoren durch einen blauen Balken und links für Knochentumoren der Maus durch einen roten Balken dargestellt. sche Protokolle kaum vorhersagbar ist mit der Konsequenz einer insgesamt relativ schlechten Prognose. Auf molekularer Ebene widerspiegelt sich die Heterogenität dieser Tumoren in einem breiten Spektrum mutierter Gene und zytogenetischer Alterationen. Im Gegensatz beispielsweise zu kindlichen Leukaemien kennt man beim Osteosarkom deshalb keine charakteristischen Änderungen in einem bestimmten Gen, aus dem sich ein kausaler Zusammenhang zur Tumorentstehung ableiten ließe, bzw. welches sich als potentiell therapeutisches Target anbieten könnte. Dank jahrzehntelanger Arbeit mit strahleninduzierten Osteosarkome der Maus am Institut für Pathologie war es möglich, eine größere Anzahl solcher Tumoren in Hybridmäusen zu induzieren. Diese Mäuse wurden gezielt gezüchtet, um durch eine möglichst große Zahl informativer Marker (DNA-Mikrosatelliten und gen-spezifische SNPs, Abb.2) eine genomweite Suche nach solchen Lozi durchführen zu können, die in den Tumoren häufig von allelischer Imbalance betroffen sind. In einer parallel laufenden Studie wurden an mehr als 40 humanen Knochentumoren gezielt diejenigen genomischen Bereiche auf Alleleverluste hin untersucht, deren Counterparts bei der Maus bereits als potentielle Tumor-Suppressor-Lozi aufgefallen waren. Diese humanen Tumore stammten aus verschiedenen Kliniken des Bundesgebietes und wurden unter der Obhut der Kinderärztin Frau Dr. M. Nathrath (TUM, Kinderkrankenhaus Schwabing) auf molekulare Alterationen hin untersucht. Unter verschiedenen bereits bekannten Tumor-Suppressor-Lozi, die in den Tumoren einen Allelverlust aufwiesen, wurde ein bis- 185
her noch nicht beschriebener Bereich auf dem Chromosom 9 der Maus distal des ATM Genes identifiziert. Hier zeigten Marker innerhalb eines Intervalls von etwa 4Mbp allelische Imbalance in bis zu 78% der untersuchten Fälle. Solch ein Verlust der Heterozygotie (LOH) ist ein Hinweis darauf, dass der Locus ein für normale Wachstumskontrolle des Gewebes essentielles Tumor- Suppressor-Gen trägt. Ein wesentliches Element der gesamten Studie war die Kooperation mit Dr. Kenji Imai (IEG), der im internationalen Maus Chromosome Committee verantwortlich für das Chromosom 9 ist und für dieses weltweit die detailliertesten Untersuchungen über konservierte Bereiche zwischen Maus und Menschen angestellt hat. Damit konnte eine genaue Zuordnung des LOH- Bereiches vom Maus Chromosom 9 zum humanen Chromosom 6q14 vorgenommen werden (Abb. 3). Auch dieser Bereich wies in 23 von 30 informativen Fällen allelische Imbalance auf ein starker Hinweis darauf, dass auf diesem zwischen Maus und Mensch konserviertem Genomabschnitt ein für die Osteosarkom-Entwicklung essentielles Gen lokalisiert ist. Im Verlauf dieser Studie hatte es sich erwiesen, dass parallele Studien an humanen Tumoren und an solchen der Maus nicht nur komplementär hinsichtlich Qualität und Quantität des zur Verfügung stehenden Untersuchungsmateriales sind. Vielmehr erlauben Vergleiche zwischen den jetzt vollständig sequenzierten Genome beider Spezies eine genauere Kartierung von krankheitsassoziierten Genen: sogenannte Syntenie-Bruchpunkte im Genom zweier Spezies engen automatisch den Bereich ein, auf dem sich homologe Gene befinden können. Durch eine weitere Kooperation mit Dr. T. Strom (IHG) konnten wir damit tatsächlich zeigen, dass letztendlich nur ein einziges bekanntes Gen auf dem zwischen Mausund Mensch konservierten Genabschnitt liegt. Es handelt sich dabei um das bisher nur als Entwicklungskontroll-Gen bekannte Tbx18. Weitergehende Untersuchungen zu möglichen Mutationen oder Dysregulationen dieses Genes in Knochentumoren sollen zeigen, bei welchen molekularen Prozessen des neoplastischen Wachstums dieses Gen eine Rolle spielen könnte. Zusammenarbeit Der Leiter des Instituts ist o. Univ. Professor für Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie der Technischen Universität München. Außerdem lehren drei Mitarbeiter des Instituts an der Technischen Universität und eine Mitarbeiterin an der Universität Innsbruck. Mitarbeiter des Instituts lehren an der Universität London MSc Kurs Radiationbiologie und sind Gründungsmitglieder die Europäische on-line Pathologie Atlas der Maus PATHBASE. Es bestehen Kooperationen mit der Technischen Universität München sowie mit nationalen Forschungseinrichtungen innerhalb des HGF und mit internationalen Partners innerhalb der 5er Rahmenprogramme der EU. Drittmittelnprojekte sind durch die DFG, Bayerischen Forschungsstiftung, Wilhelm-Sander-Stiftung, Deutsche Krebshilfe und der Europäishe Union gefordert. Ausgewählte Veröffentlichungen Calzada-Wack, J., Kappler, R., Schnitzbauer, U., Richter, T., Nathrath, M., Rosemann, M., Wagner, S.N., Hein, R., Hahn, H.: Unbalanced overexpression of the mutant allele in murine Patched mutants. Carcinogenesis 23, 727 733, 2002 Fritz, A., Walch, A., Piotrowska, K., Rosemann, M., Schäffer, E., Weber, K., Timper, A., Wildner, B., Graw, J., Höfler, H., Atkinson, M. J.: Recessive transmission of a multiple endocrine neoplasia syndrome in the rat. Cancer Research 62, 3048 3051, 2002. Nathrath, M., Kuosaite, V., Rosemann, M., Kremer, M., Poremba, Chr., Wakana, S., Yanagy, M., Nathrath, W, Höfler, H., Imai, K., Atkinson, M.J.: Two novel candidate tumour suppressor gene loci on chromosome 6q and 15q in human osteosarcoma identified through the parallel study of allelic imbalance in mouse and human. Oncogene 21, 5975 5980 (2002) Specht, K., Kremer, M., Müller, U., Dirnhofer, S., Rosemann, M., Höfler, H., Quintanilla-Martinez, L., Fend, F.: Identification of Cyclin D1 mrna Overexpression in B-Cell Neoplasias by Real-Time Reverse Transcription- PCR of Microdessected Paraffin Sections. Clinical Cancer Research 8, 2902 2911, 2002 186