Zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.: MK114

4.2 CAUTION VaccZyme Diphtheria Toxoid IgG Enzyme Immunoassay Kit For in-vitro diagnostic use Product code: MK114 Product manufactured by: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK www.bindingsite.co.uk Telephone: +44 (0)121 456 9500 Fax: +44 (0)121 456 9749 E-mail: info@bindingsite.co.uk VaccZyme is a trademark of The Binding Site Group Ltd 1 INTENDED USE This assay is intended for the in-vitro measurement of specific IgG antibodies against diphtheria toxoid in serum, to determine the protective status of the individual. Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 40 samples to be tested in duplicate or 88 in single, with a six point calibration curve and two controls. The six point calibration curve can be reduced to five points if measurement below 0.037IU/mL is not required. 2 BACKGROUND Anti-diphtheria toxoid antibodies are raised in response to vaccination with diphtheria toxoid protein. A patient s response to the immunisation may be assessed, subsequently, by the serological determination of the anti-diphtheria toxoid antibody level using this quantitative enzyme immunoassay technique. It should be noted that a reference method is the Vero Cell Assay (VCA) 1-2. This assay gives a measurement of the amount of neutralising antibody of all immunoglobulin classes, not only IgG. Historically comparison of commercial ELISA kits and the VCA has shown poor correlation. This ELISA kit was developed in order to improve agreement with the VCA assay 3. 3 PRINCIPLE OF THE ASSAY Microwells are pre-coated with diphtheria toxoid antigen. The calibrators, controls and diluted patient samples are added to the wells and antibodies recognising the diphtheria toxoid antigen bind during the first incubation. After washing the wells to remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit anti-human IgG (γ chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the captured human antibody and the excess unbound conjugate is removed by a further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the intensity of which is proportional to the concentration of antibody in the sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces a yellow end point colour, which is read at 450nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 WARNING All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures. This product contains sodium azide and ProClin 300 and must be handled with caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as listed below. These are hazardous and should be handled with care. INHIBITOR Kathon Sodium Azide ProClin 300 Bromonitrodioxane Methylisothiazone CONCENTRATION 0.02% 0.099% 0.045% 0.002% 0.002% ProClin is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. The stop solution contains 3M phosphoric acid, which is an irritant. Avoid contact with skin or eyes. Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and environmental regulations. This product should only be used by appropriately trained personnel. Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect the performance of this sensitive assay. If as a consequence the obtained optical density readings are low this may compromise the sensitivity of the assay. Pay attention to specific Notes and warnings throughout these Instructions for Use. Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all reagents are from the SAME batch. All strips must be taken from the same foil pouch. Substitution of any component may lead to incorrect results. To avoid reagent contamination, especially of the conjugate and calibrators, only use new or clean plastic / glassware. NEVER return unused reagents to the bottles. Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or contamination will lead to inconsistent results. TMB substrate must not be exposed to light or water. Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens containing particulate matter should not be used. Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use. The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is recommended. When using automated assay systems, sample dilutors and other automated equipment, follow the manufacturer s instructions carefully. Particular attention should be given to the setup of the equipment and installation and connection to external services. All settings for automatic washers and readers must be followed carefully and equipment must be maintained and serviced according to the manufacturer s instructions. 4.3 STORAGE AND STABILITY The kit should be stored at 2-8 C and should not be frozen. Inappropriate storage temperatures will affect the results. Wash buffer diluted into a clean container can be stored at room temperature for a maximum of 4 weeks. The expiry date of the kit is shown on the outer label. 5 SAMPLE COLLECTION AND STORAGE Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally and the serum separated. The serum may be stored at 2-8 C for up to 48 hours prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20 C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive results. 6 MATERIALS 6.1 MATERIALS SUPPLIED 6.1.1 Instruction Leaflet: Giving full assay details. 6.1.2 QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch. 6.1.3 Diphtheria Toxoid Coated Wells: 12 breakapart 8 well strips coated with diphtheria toxoid derived from Corynebacterium diphtheriae. The plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two desiccant pouches. 6.1.4 Diphtheria Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample dilution. Coloured orange, ready to use. 6.1.5 Wash Buffer: 1 bottle containing 50mL of a 20-fold concentrated buffer for washing the wells. 6.1.6 Diphtheria Toxoid IgG Calibrators: 6 bottles each containing 1.2mL of diluted human serum, with the following concentrations of anti-diphtheria toxoid antibody: 3, 1, 0.333, 0.111, 0.037and 0.012IU/mL. Ready to use. 6.1.7 Diphtheria Toxoid IgG High Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum containing antibodies to diphtheria toxoid. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. 6.1.8 Diphtheria Toxoid IgG Low Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum containing antibodies to diphtheria toxoid. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. 6.1.9 Diphtheria Toxoid IgG Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase labelled antibody to human IgG. Coloured red, ready to use. 6.1.10 TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL TMB substrate. Ready to use. 6.1.11 Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to use. 6.2 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied 6.2.1 Automatic Microplate Plate Washer: This is recommended, however, plate washing can be performed manually. 6.2.2 Plate Reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced on air. 6.2.3 Distilled or Deionised Water: This should be of the highest quality available. 6.2.4 Calibrated Micropipettes: For dispensing 1000, 100 & 10µL. 6.2.5 Multichannel Pipette: Recommended for dispensing 100µL volumes of conjugate, substrate and stop solution. 6.2.6 Glass/Plastic tubes: For sample dilution. 7 ASSAY METHOD 7.1 PRE-ASSAY STEPS 1. Bring the kit to room temperature The kit is designed for room temperature operation (20-24 C). Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately 60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have reached room temperature. Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week. 2. Kit components Gently mix each kit component before use. 3. Wash buffer dilution Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1 in 20 dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as appropriate. Note: Diluted wash buffer can be stored at room temperature for up to 4 weeks, therefore only dilute the appropriate amount. Insert Code: E114, Version: 15 th June 2011, Page 1 of 10

4. Sample dilution Dilute 10µL of each sample with 1000µL of sample diluent and (1:100) and mix well. Note: Diluted sample must be used within 8 hours. 5. Strip and frame handling Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1, filling columns from left to right across the plate. When handling the plate, squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out. Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture. Take care not to puncture or tear the foil bag, see below. WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor assay precision and potentially false results. 7.2 ASSAY METHOD Maintain the same dispensing sequence throughout the assay. 1. Sample addition Dispense 100µL of each calibrator, control and diluted (1:100) sample into the appropriate wells of the plate provided. Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last sample. Incubate at room temperature for 30 minutes. 2. Washing The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high backgrounds. After incubation remove the plate and wash wells 3 times with 250-350µL wash buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate and tap the wells dry on absorbent paper. Plates can be washed manually as follows: a. Flick out the contents of the plate into a sink. b. Tap the wells dry on absorbent paper. c. Fill each well with 250-350µL of wash buffer using a multichannel pipette. d. Gently shake the plate on a flat surface. e. Repeat a-d twice. f. Repeat a. and b. 3. Conjugate addition Dispense 100µL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination, NEVER return excess conjugate to the reagent bottle. Incubate at room temperature for 30 minutes. 4. Washing Repeat step 2. 5. Substrate (TMB) addition Dispense 100µL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle. Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes. 6. Stopping Dispense 100 µl of stop solution into each well. This causes a change in colour from blue to yellow. 7. Optical density measurement Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader, within 30 minutes of stopping the reaction. Note: See point 1 in Section 8 below. 8 RESULTS AND QUALITY CONTROL 1. Reader settings This is a particularly sensitive assay. In order to accurately measure low samples, it is advisable not to subtract blank OD readings from the results. In addition, optical densities should be read at 450nm without using a reference filter. 2. Quality control In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met: Calibrators and controls must be included in each run. The value obtained for each control should be in the range specified on the QC Certificate. The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC Certificate. If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should be repeated. 3. Calculate mean optical densities (For assays run in duplicate only) For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate readings. The percentage coefficient of variation (%C.V.) for each duplicate OD should be less than 15%. 4. Plot calibration curve The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows by plotting the anti-diphtheria toxoid antibody concentration on the log scale against the OD on the linear scale for each calibrator:- Automatic - Use appropriately validated software, and the curve fit that best fits the data. Manual - Using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points (not a straight line or point to point). 5. Treatment of anomalous points If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence of this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the assay should be repeated. 6. Calculation of the control values Read the level of the anti-diphtheria toxoid antibody in the controls directly from the calibration curve. The value should fall within the range given on the QC Certificate. 7. Calculation of antibody levels in diluted samples Read the level of the anti-diphtheria toxoid antibody in the diluted samples directly from the calibration curve. Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account for a 1:100 sample dilution. No further correction is required. 8. Assay calibration The assay is calibrated against the NIBSC diphtheria antitoxin reference preparation 00/496, which is supplied by the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC: www.nibsc.ac.uk). Results are reported in IU/mL. 9. Limitations Pre- and post-vaccination samples should be run simultaneously. This kit may be used to aid diagnosis of immunodeficiency. Results must be confirmed by clinical findings and other serological tests. The results obtained from this assay are not diagnostic proof of lack of protection / protection against diphtheria or the presence or absence of immunodeficiency. 9 PROTECTIVE LEVELS The level of protective antibody in the normal population has been cited in the literature as between 0.01 and 0.1IU/mL 4-7. The WHO 8,9 guidelines state that a serum level of 0.1IU/mL of diphtheria antitoxin is desirable for individual protection though a minimum protective level may be achieved at 0.01IU/mL and antibody levels of 1.0IU/mL or more are associated with long-term protective immunity. If this test is used to determine the need to immunise an individual, we recommend the use of an equivocal zone of 0.1 0.149IU/ml when interpreting results. Samples falling within this equivocal zone should be repeated to confirm that protective levels of anti diphtheria toxin are present. If the level of protection cannot be confirmed, the sample should be referred to a reference laboratory for further testing or a second sample requested. 10 TYPICAL VALUES Anti-diphtheria toxoid IgG antibody levels were measured in serum from 80 normal adult blood donors (of unknown vaccination and immune status). The results displayed below, are provided for illustration only, and should not be used to establish a protective range. No. of samples 80 60 40 20 0 0.012-0.099 0.1-0.49 0.5-1.0 Anti-diphtheria toxoid IU/mL 11 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 11.1 PRECISION The intra- and inter-assay precision was measured using samples within the range of the calibration curve. The concentration and % C.V. for each sample are given below: The intra-assay precision was determined on twenty replicates of three samples. INTRA-ASSAY PRECISION n=20 Concentration (IU/mL) % C.V. Sample 1 0.03 4.2 Sample 2 0.14 6.0 Sample 3 1.42 3.3 The inter-assay precision was measured using three samples tested in duplicate six times on three consecutive days. The %CV for each sample is given below. INTER-ASSAY PRECISION n=6 Concentration (IU/mL) % C.V. Sample 4 0.06 6.1 Sample 5 0.16 11.5 Sample 6 1.19 10.9 11.2 CORRELATION The relative specificity, sensitivity and agreement have been determined against a Vero Cell Assay (VCA), a neutralising antibody detection assay using 254 test samples. EIA VCA + - IgG Anti-Diphtheria EIA + 134 9-10 101 Relative sensitivity 93.06% Relative specificity 91.82% Relative agreement 92.52% Insert Code: E114, Version: 15 th June 2011, Page 2 of 10

11.3 INTERFERING SUBSTANCES A range of interfering substances has been spiked into an anti-diphtheria high and low sample, which have then been subsequently assayed. The method used to check the substances was based on the Interference Check A plus and RF Interference Check - Kokusai Shiyaku, Japan. Substance Bilirubin F (Free) Bilirubin C (Conjugate) Haemolysed Haemoglobin Chyle Rheumatoid factor No interference was observed in the samples tested. Concentration 19.1mg/dL 19.6mg/dL 484mg/dL 2130Units 113.8IU/mL 11.4 ASSAY SENSITIVITY Assay sensitivity of 0.012IU/mL was confirmed by assaying two samples in multiple replicates with values of 1.25 and 1.5 times the lowest calibrator (0.012IU/mL). Statistical analysis by the Student s t-test, confirmed that these samples were significantly different from each other (P<0.00003) 11.5 MEASURING RANGE The measuring range of the assay is 0.012-3.0IU/mL based on using all six calibrators. 11.6 LINEARITY Linearity was tested on three samples with values of 2.874, 2.283 and 1.699IU/mL, the R 2 values were all greater than 0.992. 11.7 PROZONE No prozone effects were observed when anti-diphtheria samples containing up to 27IU/mL were tested. 12 REFERENCES 1. Miyamura K et al (1974). Micro cell culture method for determination of diphtheria toxin and antitoxin using VERO cells, II. Comparison with the rabbit skin method and practical application for sero-epidemiological studies. Journal of Biological Standardisation 2: 203-209 2. Maple PA et al (1995). Diphtheria immunity in UK blood donors. The Lancet, 345: 963-965 3. Budd R et al (2005). An enzyme immunoassay for anti-diphtheria antibodies giving improved correlation with the Vero Cell Assay. Oral presentation to Dipnet meeting, Copenhagen June 2005. 4. Pilars CE and Spiess H. (1981). Diphtherie- und Tetanusantikorper bei Kindern und jungen Erwachsenen. Dtsch med Waschr, 106: 1341-1345. 5. Booy R et al. (1992). Immunogenicity of combined diphtheria, tetanus and pertussis vaccine given at 2,3 and 4 months versus 3, 5 and 9 months of age. The Lancet, 339(8792):507-510. 6. Melville-Smith M. Diphtheria and tetanus antitoxins. ELISA In the clinical microbiology laboratory, Editors Wreghitt TG and Morgan-Capner P, Published by the UK Public Health Laboratory Service. 7. Edmunds WJ et al (2000). The sero-epidemiology of diphtheria in Western Europe. Epidemiol. Infect, 125: 113-125 8. WHO meeting report. (1990). The Control of Diphtheria in Europe. WHO ref: EUR/ICP/EPI 024. 9. WHO weekly epidemiological record, 20 January 2006 edition, Diptheria Vaccine. No. 3, 2006, 81: 24-32. VaccZyme Diphtherie Toxoid IgG Enzym-Immunoassay-Kit Zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.: MK114 In England hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK www.bindingsite.co.uk Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A, 68723 Schwetzingen, Deutschland Deutschland: Telefon: 0 6202 92 62 0 Fax: 06202 92 62 222 e-mail: office@bindingsite.de VaccZyme ist ein Warenzeichen von The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK 1 VERWENDUNGSZWECK Dieser Kit dient zur in-vitro Bestimmung von spezifischen IgG-Antikörpern gegen das Diphterie-Toxoid in Humanserum. Mit diesem Test kann der individuelle Impfschutz bestimmt werden. Der Kit enthält ausreichend Material um maximal 40 Proben in Doppelbestimmung oder 88 Proben in Einzelbestimmung, sowie eine Kalibrationskurve (6 Punkte) und 2 Kontrollen, zu messen. Die 6-Punkt-Kalibrationskurve kann auch auf 5 Kalibrationspunkte reduziert werden, falls die Messung von Konzentrationen unterhalb von 0,037 IU/mL nicht notwendig ist. 2 EINFÜHRUNG Anti Diphtherie-Toxoid-Antikörper werden als Antwort auf eine Impfung mit dem Diphterie-Toxoid-Protein gebildet. Die Immunantwort eines Patienten kann anschließend durch die serologische Bestimmung der Anti-Diphterie-Toxoid-Antikörperkonzentration mit diesem quantitativen Enzym-Immunoassay ermittelt werden. Es ist bekannt, dass der Vero Cell Assay (VCA) als eine Referenzmethode angesehen wird 1-2. Mit diesem Test werden die neutralisierenden Antikörper aller Immunglobulinklassen erfasst, d. h. nicht nur IgG. Schon in der Vergangenheit wurde gezeigt, dass die Korrelation zwischen kommerziellen ELISA Kits und dem Vero Cell Assay schlecht ist. Dieser ELISA wurde entwickelt, um eine verbesserte Übereinstimmung mit dem VCA zu erzielen 3. 3 TESTPRINZIP Die Wells (Vertiefungen) der Mikrotiterplatten sind mit dem Diphterie-Toxoid-Antigen beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und zu testende Proben werden in den Wells inkubiert, so dass die Anti Diphterie-Toxoid-Antikörper während der ersten Inkubation an das immobilisierte Antigen binden können. Nach dem Waschen der Wells - zum Entfernen des ungebundenen Proteins - gibt man das gereinigte, mit Peroxidase markierte Kaninchen Anti-Human-IgG-Konjugat (γ-ketten spezifisch) hinzu. Nach einer weiteren Inkubation und einem weiteren Waschvorgang - um das ungebundene Konjugat zu entfernen - wird das gebundene Konjugat mit Hilfe von 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Antikörperkonzentration der Probe ist. Phosphorsäure wird in jedes Well pipettiert, um die Reaktion zu stoppen, das daraus resultierende gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen. 4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN 4.1 WARNUNGEN Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), das Hepatitis-C-Virus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen (inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Dieses Produkt enthält Natriumazid und ProClin 300 und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als Konservierungsmittel. Diese Substanzen sind als Gefahrstoffe anzusehen und müssen mit Vorsicht gehandhabt werden. INHIBITOR Kathon Natriumazid ProClin 300 Bromonitrodioxan Methylisothiazon KONZENTRATION 0,02% 0,099% 0,045% ProClin ist ein Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Insert Code: E114, Version: 15 th June 2011, Page 3 of 10

Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure, die Reizungen auslösen kann. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmungen zu beachten. 4.2 VORSICHTSMASSNAHMEN Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Es wird empfohlen, die Arbeitsanleitung genau einzuhalten. Jegliche Abweichung kann die Qualität dieses empfindlichen Tests beeinflussen. Sollte dadurch die gemessenen Werte der optischen Dichten niedrig sein, kann dies die Sensitivität beeinträchtigen. Beachten Sie die spezifischen Hinweise und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden. Der Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte Ergebnisse zur Folge haben. Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien, speziell des Konjugats und des Kalibrators, ausschließlich neue oder gereinigte Plastik- oder Glasgefäße verwenden. NIEMALS unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen. Die Verwendung mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden. Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit-Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu verwenden. Bei der Verwendung von automatisierten Testsystemen, Probenverdünnern und anderem automatisierten Zubehör, sind die Anweisungen des Herstellers sorgfältig zu befolgen. Besondere Sorgfalt gilt der Aufstellung und Installation der Geräte und der Verbindung zu externen Systemen. Alle Einstellungen, die die automatisierten Wasch- und Lesegeräte betreffen, müssen sorgsam befolgt werden. Die Geräte müssen den Herstellerangaben entsprechend instand gehalten und gewartet werden. 4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT Den Kit bei 2-8 C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst die Ergebnisse. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei Raumtemperatur bis maximal 4 Wochen haltbar. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. 5 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. Die Seren können bei 2-8 C bis zu 48 Stunden vor dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen, die Seren unverdünnt bei mindestens -20 C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falschpositiven Ergebnissen führen. 6 MATERIALIEN 6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN 6.1.1 Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung. 6.1.2 QC-Zertifikate: mit chargenspezifischen Angaben zu den Kontroll- Sollwerten und der idealen Kalibrationskurve. 6.1.3 Diphtheria Toxoid Coated Wells (Diphterie-Toxoid beschichtete Mikrotiterstreifen): 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 vereinzelbaren Wells, die mit von Corynebacterium diphteriae abgeleitetem Diphterie-Toxoid beschichtet sind. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der zwei Beutel Trockenmittel enthält, verpackt. 6.1.4 Diphtheria Sample Diluent (Diphtherie-Probendiluens): 2 Flaschen mit je 50mL gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: orange. 6.1.5 Wash Buffer (Waschpuffer): 1 Flasche mit 50mL eines 20-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Wells. 6.1.6 Diphtheria Toxoid IgG Calibrators (Diphterie-Toxoid-IgG-Kalibratoren): 6 Flaschen mit je 1,2mL gebrauchsfertig verdünntem Humanserum, mit folgenden Konzentrationen an Anti-Diphterie-Toxoid-Antikörper: 3; 1; 0,333; 0,111; 0,037 und 0,012IU/mL. 6.1.7 Diphtheria Toxoid IgG High Control (Diphterie-Toxoid-IgG-Kontrolle, High Level): 1 Flasche mit 1,2mL verdünntem Humanserum, das Antikörper gegen Diphterie-Toxoid enthält. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig. 6.1.8 Diphtheria Toxoid IgG Low Control (Diphterie-Toxoid-IgG-Kontrolle, Low Level): 1 Flasche mit 1,2mL verdünntem Humanserum, das Antikörper gegen Diphterie-Toxoid enthält. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig. 6.1.9 Diphtheria Toxoid IgG Conjugate (Diphterie-Toxoid-IgG-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: rot. Gebrauchsfertig. 6.1.10 TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig. 6.1.11 Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure. Gebrauchsfertig. 6.2 Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien 6.2.1 Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die Platten können auch manuell gewaschen werden. 6.2.2 Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei 450nm. 6.2.3 Destilliertes oder deionisiertes Wasser der höchsten verfügbaren Qualität. 6.2.4 Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von 1000, 100 & 10µL. 6.2.5 Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von Volumina von 100µL. 6.2.6 Glas- oder Plastikgefäße: Zur Probenverdünnung. 7 TESTDURCHFÜHRUNG 7.1 Testvorbereitung 1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei 20-24 C (Raumtemperatur). Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Wells nicht vor Erreichen der Raumtemperatur aus dem Folienbeutel nehmen. Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 2. Kit-Komponenten Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Waschpuffer verdünnen Dazu 50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20 Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden. Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen.. 4. Verdünnung der Proben 10µL jeder Probe mit 1000µL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut mischen. Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen werden. 5. Umgang mit Streifen und Rahmen Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird. ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder andere Partikel kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse. 7.2 TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 1. Pipettieren der Kalibratoren, Kontrolle und Proben 100µL von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und jeder verdünnten (1:100) Probe in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal mit 250-350µL Waschpuffer pro Well waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.b. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z. B. Papiertücher) leicht ausklopfen. c. 250-350µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration mit einer Mehrkanalpipette in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln. e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats 100µL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, NIEMALS überschüssiges Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt 2. 5. Pipettieren von Substrat (TMB) Nach dem Waschen 100µL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in die TMB-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 6. Reaktionsende 100 µl Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um. 7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten-Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen. Hinweis: Siehe Punkt 1 in Abschnitt 8. 8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE 1. Einstellung des Readers Dieser Test ist besonders empfindlich. Um Proben mit niedrigen Konzentrationen akkurat zu messen, wird empfohlen, von den Proben-OD-Werten keinen Leerwert (Blank) abzuziehen. Die OD-Messung sollte bei 450nm ohne Referenzfilter erfolgen. Insert Code: E114, Version: 15 th June 2011, Page 4 of 10

2. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. Kalibratoren und Kontrolle müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Die Ergebnisse der Kontrollen müssen in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten Kalibrationskurve ähnlich sein. Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. 3. Berechnung der mittleren optischen Dichte (nur bei Doppelbestimmung): Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optische Dichte (OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen. 4. Erstellen der Kalibrationskurve Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden. Dazu wird die Anti Diphterie-Toxoid-IgG-Antikörperkonzentration auf der logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden Kalibrator aufgetragen. Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus verwenden, der am besten zu den Daten passt. Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt-Verbindung). 5. Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen. 6. Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Kontrollen Die Anti Diphterie-Toxoid-IgG-Antikörperkonzentrationen der Kontrollen können direkt aus der Kalibrationskurve abgelesen werden. Die Kontrollwerte müssen in den im QC-Zertifikat angegebenen Bereich fallen. 7. Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Proben Die Anti Diphterie-Toxoid-IgG-Antikörperkonzentrationen der Proben können direkt aus der Kalibrationskurve abgelesen werden. Hinweis: Die Standard-Probenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig. 8. Kalibration des Tests Der Test ist gegen die NIBSC Diphtherie-Antitoxin-Referenzpräparation 00/496 kalibriert. Die Ergebnisse werden in IU/mL angegeben. 9. Grenzen des Tests Proben zur Testung von Pre- und Post-Impfung sollten immer gemeinsam getestet werden. Dieser Testkit dient zur Unterstützung der Diagnose von Immundefekten. Ein positives Ergebnis muss durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen bestätigt werden. Die Testergebnisse können nicht als diagnostischen Beweis für das Vorliegen bzw. Nichtvorliegen eines Impfschutzes gegen Diphtherie oder eines Immundefektes verwendet werden. 9 IMPFSCHUTZ In der Literatur wird die Konzentration an schützenden Antikörpern für die normale Bevölkerung zwischen 0,01 und 0,1IU/mL angegeben. 4-7 In den WHO 8,9 -Richtlinien wird eine Konzentration von 0,1IU/mL Diphtherie-Antitoxoid-Antikörper als individueller Impfschutz angegeben, obwohl ein minimaler Impfschutz bereits bei 0,01IU/mL erreicht wird. Antikörperkonzentrationen von 1,0IU/mL und mehr werden mit einem Langzeitimpfschutz assoziiert. Wird der Test für die Beurteilung ob eine Nachimpfung notwendig ist oder nicht verwendet, wird bei der Ergebnisinterpretation die Verwendung eines Graubereichs von 0,1-0,149IU/mL empfohlen. Proben, deren Ergebnis in diesem Graubereich liegen, sollten um nachzuweisen, dass ein zum Schutz ausreichende Konzentration des Anti Diphtherie-Toxoid-Antikörpers vorhanden ist, erneut gemessen werden. Kann dieser Nachweis nicht erbracht werden, sollte die Probe an ein Referenzlabor weitergeleitet werden oder eine zweite Probe angefordert werden. 10 TYPISCHE WERTE Anti Diphtherie-Toxoid-IgG-Antikörper-Konzentrationen wurden in Seren von 80 normalen Blutspendern, wobei keine Informationen über Impfung und Immunstatus vorlagen, ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Grafik aufgeführt; sie dienen nur zur Orientierung und können nicht zur Berechnung des Impfschutzes verwendet werden. Probenanzahl 80 60 40 20 0 11 LEISTUNGSDATEN 0.012-0.099 0.1-0.49 0.5-1.0 Anti-Diphtherie Toxoid IU/mL Die Intra-Assay Präzision wurde durch 20-fache Messung von 3 Proben bestimmt. INTRA-ASSAY PRÄZISION n=20 Konzentration (IU/mL) % VK Probe 1 0,03 4,2 Probe 2 0,14 6,0 Probe 3 1,42 3,3 Zur Ermittlung der Inter-Assay Präzision wurden 3 Proben in Doppelbestimmung je 6 mal an 3 aufeinanderfolgenden Tagen gemessen. Der %VK wird für jede Probe nachfolgend aufgelistet. INTER-ASSAY PRÄZISION n=6 Konzentration (IU/mL) % VK Probe 4 0,06 6,1 Probe 5 0,16 11,5 Probe 6 1,19 10,9 11.2 KORRELATION Die relative Spezifität, Sensitivität und Übereinstimmung wurden im Vergleich zum Vero Cell Assay (VCA), ein Test zum Nachweis von neutralisierenden Antikörpern, mit 254 Proben ermittelt. EIA VCA + - IgG Anti-Diphtherie EIA + 134 9-10 101 Relative Sensitivität 93,06% Relative Spezifität 91,82% Relative Übereinstimmung 92,52% 11.3 INTERFERIERENDE SUBSTANZEN Seren mit hoher und niedriger Anti Diphtherie-Toxoid-Konzentration wurden mit verschiedenen, potentiell störenden Substanzen versetzt und anschließend mit diesem Kit getestet. Die verwendete Methode basiert auf dem Interference Check A plus und RF Interfernce Check von Kokusai Shiyaku, Japan. Substanz Bilirubin F (frei) Bilirubin C (konjugiert) Hämolysiertes Hämoglobin Chylus Rheumafaktor Konzentration 19,1 mg/dl 19,6 mg/dl 484 mg/dl 2130 Units 113,8 IU/mL Es wurden keine Störungen bei den getesteten Proben gefunden. 11.4 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT Die Sensitivität des Tests von 0,012IU/mL wurde durch die Mehrfachmessung von 2 Proben, mit Konzentrationen des 1,25- und 1,5-fachen der Konzentration des niedrigsten Kalibrators (0,012IU/mL), bestätigt. Die statistische Analyse mit dem Student s t-test zeigte klar, dass diese Proben sich signifikant unterschieden (P<0.00003). 11.5 MESSBEREICH Der Messbereich dieses Tests liegt bei einer 6-Punkt-Kalibrationskurve zwischen 0,012-3,0IU/mL. 11.6 LINEARITÄT Die Linearität wurde anhand von drei Proben mit den Konzentrationen von 2,874, 2,283 and 1,699 IU/mL bestimmt. Alle R 2 -Werte waren größer als 0,992. 11.7 PROZONENEFFEKT Bei Proben mit einer Anti Diphtherie-Toxoid-Antikörperkonzentration von bis zu 27IU/mL wurde kein Prozoneneffekt festgestellt. 12 REFERENZEN 1. Miyamura K et al (1974). Micro cell culture method for determination of diphtheria toxin and antitoxin using VERO cells, II. Comparison with the rabbit skin method and practical application for sero-epidemiological studies. Journal of Biological Standardisation 2: 203-209 2. Maple PA et al (1995). Diphtheria immunity in UK blood donors. The Lancet, 345: 963-965 3. Budd R et al (2005). An enzyme immunoassay for anti-diphtheria antibodies giving improved correlation with the Vero Cell Assay. Oral presentation to Dipnet meeting, Copenhagen June 2005. 4. Pilars CE and Spiess H. (1981). Diphtherie- und Tetanusantikorper bei Kindern und jungen Erwachsenen. Dtsch med Waschr, 106: 1341-1345. 5. Booy R et al. (1992). Immunogenicity of combined diphtheria, tetanus and pertussis vaccine given at 2,3 and 4 months versus 3, 5 and 9 months of age. The Lancet, 339(8792):507-510. 6. Melville-Smith M. Diphtheria and tetanus antitoxins. ELISA In the clinical microbiology laboratory, Editors Wreghitt TG and Morgan-Capner P, Published by the UK Public Health Laboratory Service. 7. Edmunds WJ et al (2000). The sero-epidemiology of diphtheria in Western Europe. Epidemiol. Infect, 125: 113-125 8. WHO meeting report. (1990) The Control of Diphtheria in Europe. WHO ref: EUR/ICP/EPI 024. 9. WHO weekly epidemiological record, 20 January 2006 edition, Diptheria Vaccine. No. 3, 2006, 81: 24-32 11.1 PRÄZISION Die Intra- und Inter-Assay Präzision wurde mit Proben, deren Antikörperkonzentrationen innerhalb der Kalibrationskurve liegen, bestimmt. Die mittlere Konzentration und der Variationskoeffizient (%VK) sind nachfolgend angegeben: Insert Code: E114, Version: 15 th June 2011, Page 5 of 10

Coffret ELISA VaccZyme de dosage des anticorps IgG anti-toxine diphterique Pour un usage en diagnostic in vitro Référence : MK114 Produits fabriqués par: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK www.bindingsite.co.uk Distribués en France par la société : The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 St-Egrève Cedex. Téléphone : 04.38.02.19.19 Fax : 04.38.02.19.20 E-mail : info@bindingsite.fr VaccZyme est une marque de The Binding Site Group Ltd. UK. 1 UTILISATION Ce coffret permet de quantifier in-vitro les anticorps IgG dirigés contre la toxine diphtérique présents dans le sérum afin de déterminer le statut de protection des individus. Au maximum, il est possible de tester 40 échantillons en double ou 88 en simple avec une courbe de calibration à six points et deux contrôles. La courbe de calibration à six points peut être réduite à cinq points si des mesures en dessous 0,037UI/ml ne sont pas requises. 2 PRESENTATION GENERALE Les anticorps anti-toxine diphtérique sont produits en réponse à la vaccination par la protéine toxine diphtérique. La réponse immunitaire d un patient peut être évaluée par la détermination sérologique du taux d anticorps anti-toxine diphtérique en utilisant cette technique quantitative. Il faut noter que la méthode de référence, est le «Vero Cell Assay» (VCA) 1-2. Ce test permet de déterminer la quantité d anticorps neutralisants de toutes les classes d immunoglobulines et non pas uniquement les IgG. Historiquement, la corrélation entre les coffrets ELISA commerciaux et le test VCA était mauvaise. Ce coffret ELISA a été développé dans le but d améliorer la corrélation avec le test VCA 3. 3 PRINCIPE DU TEST Les micropuits sont recouverts avec de le toxine diphtérique. Les calibrateurs, les contrôles et les échantillons dilués sont déposés dans les puits permettant ainsi la liaison des anticorps dirigés contre la toxine diphtérique durant la première incubation. Après avoir rincé les puits pour éliminer toutes les protéines non accrochées, un conjugué purifié de lapin anti-igg humaines (chaîne γ spécifique) couplées à la peroxydase est ajouté. Le conjugué se lie à l anticorps fixé et l excès de conjugué non lié est éliminé lors d une autre étape de lavage. Le conjugué lié est visualisé avec du 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. L intensité est proportionnelle à la concentration en anticorps de l échantillon. De l acide phosphorique est ajoutée à chaque puits pour arrêter la réaction. Le produit final est coloré en jaune et la densité optique est lue à 450nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 ATTENTION Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l antigène de surface de l hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) soit acceptés pour un usage en diagnostic in-vitro par l union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l absence d agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret. Ce produit contient de l azide de sodium et doit être manipulé avec précaution; des gants appropriés et d autres vêtements de protection doivent être portés lors de toute manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau (spécialement sur les zones abîmées) ou des muqueuses. S il y a contact, laver abondamment avec de l eau et demander un avis médical. Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre de l azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les réactifs, rincer avec un large volume d eau pour prévenir tout dégât. Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs d enzymes listés ci-dessous. Ils sont dangereux et doivent être manipulés avec precaution INHIBITEURS Kathon Azide de sodium ProClin 300 Bromonitrodioxane Methylisothiazone CONCENTRATION 0,02% 0,099% 0,045% ProClin est une marque déposée par Rohm et Haas Corp. Philadelphie, PA Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact avec la peau. La solution stop contient de l acide phosphorique 3M qui est irritant. Eviter tout contact avec la peau et les yeux. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées de façon appropriée en observant les réglementations locales et environnementales. 4.2 PRECAUTIONS Ce réactif doit être utilisé par un personnel entraîné de façon appropriée. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation peut affecter les performances et les résultats obtenus. Faire attention aux Notes spécifiques dans les instructions d utilisation. Les réactifs des coffrets ayant des numéros de lots différents ne sont pas interchangeables. Toutes les barrettes utilisées doivent être issues du même sachet aluminium. Si de grandes séries de tests doivent être réalisées, vérifier que tous les réactifs aient le MÊME numéro de lot. Afin d éviter la contamination des réactifs, particulièrement le conjugué et les calibrants, utiliser uniquement du matériel neuf ou propre, en plastique ou en verre. NE JAMAIS remettre les réactifs non utilisés dans les flacons d origine. Ne jamais laisser les flacons non bouchés. Une évaporation ou une contamination peut induire des résultats incorrects. Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou à l eau. Les sérums hémolysés, lipidiques ou contaminés par des bactéries ou des particules de matière ne doivent pas être utilisés. Une mauvaise dilution des échantillons ne peut pas être vérifiée car les contrôles sont fournis prêts à l emploi. L utilisation de pipettes calibrées et d échantillons appropriés de contrôle de qualité interne est recommandée. Lorsque vous utilisez des systèmes d analyses automatisés, diluteurs d échantillons et autres équipements automatisés, suivez les instructions du fabricant avec soin. Une attention particulière devra être accordée à l'installation de l'équipement et à l'installation et la connexion à des services externes. Tous les paramètres pour les laveurs et lecteurs automatisés doivent être suivis attentivement et les équipements doivent être maintenus et entretenus selon les instructions du fabricant. 4.3 STOCKAGE ET STABILITE Le coffret doit être stocké à 2-8 C et ne doit pas être congelé. Des conditions de stockage non appropriées affecteraient les résultats. Le tampon de lavage dilué dans un récipient propre peut être stocké à température ambiante pendant 4 semaines. La date de péremption du coffret est indiquée sur l étiquette extérieure. 5 ECHANTILLONS Les échantillons de sang doivent être collectés par ponction veineuse. Laisser coaguler naturellement et séparer le sérum. Le sérum peut être stocké 48 heures à 2-8 C avant le test ou pour un stockage prolongé non dilué à -20 C ou à une température inférieure. Les congélations et décongélations répétées doivent être évitées. Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur ce qui peut induire des résultats faux-positifs. 6 REACTIFS 6.1 MATERIEL FOURNI 6.1.1 Fiche technique : donnant tous les détails du test. 6.1.2 Certificat de contrôle de qualité : indiquant les performances attendues du lot. 6.1.3 Diphtheria Toxoid Coated Wells (Puits recouverts de toxine diphtérique) : 12 x 8 puits sécables recouverts de toxine diphtérique provenant de Corynebacterium diphtheriae. Chaque plaque est emballée dans un sachet aluminium réutilisable contenant deux dessiccateurs. 6.1.4 Diphtheria Sample Diluent (Diluant échantillon diphtérique) : 2 flacons de 50mL de tampon pour la dilution des échantillons. Coloré en orange. Il est prêt à l emploi. 6.1.5 Wash Buffer (tampon de lavage) : 1 flacon de 50ml de tampon de lavage concentré 20 fois pour le lavage des puits. 6.1.6 Diphtheria Toxoid IgG Calibrator (Calibrateur IgG toxine diphtérique) : 6 flacons contenant 1,2mL de sérum humain dilué. Les concentrations en anticorps anti-toxine diphtérique sont les suivantes : 3, 1, 0,333, 0,111, 0,037 et 0,012UI/mL. Ils sont prêts à l emploi. 6.1.7 Diphtheria Toxoid IgG High Control (Contrôle haut IgG toxine diphtérique) : 1 flacon contenant 1,2mL de sérum humain contenant des anticorps antitoxine diphtérique. La valeur attendue est donnée dans le certificat de contrôle de qualité. Il est prêt à l emploi. 6.1.8 Diphtheria Toxoid IgG Low Control (Contrôle bas IgG toxine diphtérique) : 1 flacon contenant 1,2mL de sérum humain contenant des anticorps antitoxine diphtérique. La valeur attendue est donnée dans le certificat de contrôle de qualité. Il est prêt à l emploi. 6.1.9 Diphtheria Toxoid IgG Conjugate (Conjugué IgG toxine diphtérique) : 1 flacon contenant 12mL d anticorps purifié anti-igg humaines couplées à la peroxydase. Il est coloré en rouge et prêt à l emploi. 6.1.10 TMB Substrate (Substrat TMB) : 1 flacon contenant 14mL de substrat TMB. Il est prêt à l emploi. 6.1.11 Stop Solution (Solution d arrêt) : 1 flacon contenant 14mL d acide phosphorique 3M. Elle est prête à l emploi. 6.2 MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI 6.2.1 Laveur automatique de microplaques : il est recommandé mais le lavage peut se faire manuellement. 6.2.2 Lecteur de plaques : capable de mesurer des densités optiques de 450nm en référence à l air. 6.2.3 Eau distillée ou désionisée : elle doit être de bonne qualité. 6.2.4 Micropipette calibrées : pour des dépots de 1000, 100 et 10µL. 6.2.5 Pipette multicanaux : recommandée pour des dépôts de 100µL de conjugué, de substrat et de solution d arrêt. 6.2.6 Tubes en plastique ou en verre : pour la dilution des échantillons. 7 METHODE 7.1 ETAPES PREALABLES 1. Ramener le coffret à température ambiante Le coffret est opérationnel à une température comprise entre 20 et 24 C. Avant utilisation, laisser le coffret à température ambiante pendant environ 60 minutes. Les puits ne doivent pas être sortis de leur emballage avant qu ils n aient atteint la température ambiante. Note : Les coffrets peuvent être gardés à température ambiante pendant 1 semaine. Insert Code: E114, Version: 15 th June 2011, Page 6 of 10