Aus der Frauenklinik des Universitätsklinikums Erlangen

Aus der Frauenklinik des Universitätsklinikums Erlangen Direktor: Prof. Dr. M. W. Beckmann In-vitro-Untersuchungen zum Einfluss von humanem Seminalplasma auf die Kontraktilität des extrakorporal-perfundierten, nicht-schwangeren Schweineuterus Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Jens Henning Wilhelmshaven

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Prof. Dr. rer. nat. Ralf Dittrich Prof. Dr. med. Matthias W. Beckmann Tag der mündlichen Prüfung: 06. Juli 2011

Inhaltsverzeichnis Seite 1. Zusammenfassung................................................... 1 Summary.......................................................... 3 2. Einleitung......................................................... 5 3. Material und Methodik................................................ 8 3.1. Grundlagen..................................................... 8 3.1.1. Anatomie und Physiologie des nichtschwangeren menschlichen Uterus.................. 8 3.1.2. Anatomie und Physiologie des nichtschwangeren Schweineuterus..................... 14 3.1.3. Seminalplasma........................................ 18 3.2. Material...................................................... 19 3.2.1. Schweineuterus....................................... 19 3.2.2. Seminalplasma........................................ 19 3.2.3. Krebs-Ringer-Lösung................................... 20 3.2.4. Organbad............................................ 21 3.2.5. Warmwasserbad....................................... 22 3.2.6. Kanülierungsmaterial / Nahtmaterial....................... 22 3.2.7. Intrauterine Druckmessung.............................. 22 3.2.8. Arterielle Druckmessung................................ 23 3.2.9. Temperaturmessung.................................... 23 3.2.10. Datenaufzeichnung..................................... 23 3.2.11. Fotomaterial.......................................... 24 3.2.12. Software............................................. 24 3.3. Methodik..................................................... 24 3.3.1. Vorbereitung des Versuchs.............................. 24 3.3.2. Versuchsaufbau / Perfusionssystem........................ 26 3.3.3. Versuchsdurchführung.................................. 30 3.3.4. Bearbeitung der Messwerte / Statistik...................... 31

4. Ergebnisse........................................................ 33 4.1. Area Under The Curve.......................................... 36 4.2. Frequenz der Kontraktionen...................................... 40 4.3. Mittelwert der Kontraktionen..................................... 43 4.4. Maximalwert der Kontraktionen................................... 46 5. Diskussion........................................................ 49 5.1. Auswertung der Ergebnisse...................................... 49 5.2. Diskussion der Ergebnisse....................................... 55 6. Literaturverzeichnis................................................. 60 7. Abkürzungsverzeichnis.............................................. 68 8. Danksagung....................................................... 70 9. Lebenslauf........................................................ 71

1. Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Uterine Kontraktionsstörungen gelten als bedeutsame Ursache ausbleibender Konzeption in der menschlichen (künstlichen) Reproduktion. Seminalplasma, der flüssige Bestandteil des Ejakulats, spielt in diesem Zusammenhang eine wohl wesentliche Rolle. Ziel dieser Studie war es nun den Effekt von intrauterin appliziertem Seminalplasma auf die myometriale Kontraktilität des extrakorporalperfundierten Schweineuterus zu untersuchen. Methoden Ein Schweineuterus wurde längs des gemeinsamen Cavums und der Cervix gespalten und somit die beiden Uterushörner getrennt. Aufgrund genetischer Identität und gleichen Hormon-/ Rezeptorstatus war so einen direkter Vergleich im Sinne einer Fall-Kontrollgruppen-Testung mit 1:1 Matching möglich. 60 Minuten nach Einbringen der Hörner in das Organbad wurde pro Uterushorn je 1 ml Krebs- Ringer-Lösung bzw. Seminalplasma synchron intraluminal appliziert. Dieser Vorgang wurde nach jeweils 45 Minuten zweimal wiederholt, nach weiteren 45 Minuten der Versuch beendet. Oxygenierte Nährlösung versorgte beide Hörner mit Sauerstoff, Elektrolyten und Glukose. Die intraluminalen Druckänderungen wurden mittels eines Druckkatheters detektiert und digitalisiert. Ergebnisse und Beobachtungen Insgesamt fanden 34 Uterushörner für diese Versuchsreihe Verwendung. Es konnte bewiesen werden, dass Seminalplasma am ovarnahen Messpunkt IUP1 im Sinne aller untersuchten Qualitäten (AUC = intraluminales Druck-Zeit-Produkt "Gesamtdruck", Frequenz, Mittel- und Maximalwert) zu einer signifikant (p<0,05) 1

größeren Steigerung der myometrialen Aktivität führt als Krebs-Ringer-Lösung. Am cervixnahen Messpunkt IUP2 gilt dies hinsichtlich AUC und Frequenz. Praktische Schlussfolgerungen Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eindeutig, dass humanes Seminalplasma die Motilität der Gebärmutter steigert. Prostaglandine als Bestandteil humaner Samenflüssigkeit scheinen als direkter Effektor uteriner Motilitätserhöhung wahrscheinlich. Aufgrund individueller Schwankungen der Prostaglandin-Spiegel in humanem Seminalplasma, lässt sich das Zusammenspiel prostaglandinvermittelter Reaktionen im Uterus scheinbar nicht über absolute Konzentrationen deuten, sondern ist vielmehr auf ein bestimmtes PGF-PGE-Verhältnis zurückzuführen. Ferner ist denkbar, dass jeder Uterus für seine regelrechte Funktion und somit suffizienten Spermientransport auch ein individuelles Prostaglandin-Verhältnis im Seminalplasma bedarf. Somit ließe sich der Umstand erklären, dass der Kinderwunsch mancher Paare unerfüllt bleibt, obwohl beide potentielle Elternteile mit anderen Geschlechtspartnern durchaus zur erfolgreichen Reproduktion fähig sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die intraluminalen Druckänderungen, welche ein post-koitaler Uterus (Kontakt mit Seminalplasma) erfährt, direkt untersucht werden. Der kontraktionssteigernde Effekt legt den Schluss nahe, Seminalplasma hinsichtlich seiner Einsatzmöglichkeiten und eines potentiellen Benefits in der künstlichen Reproduktion (z.b. als Adjuvans bei intrauteriner Insemination) intensiver zu untersuchen. 2

Summary Background and aims Uterine contraction disorders are considered as an important cause of failed fertilization concerning human (artificial) reproduction. In this context, seminal plasma as the liquid part of the ejaculate, probably plays a decisive role. The aim of this study was to examine the effect of intrauterine administered seminal plasma on the myometrial contractility of the extracorporeally-perfused porcine uterus. Methods A porcine uterus was split along the joint cavum and cervix and thus separated in two uterine horns. Due to genetic identity and same hormone-/receptor status a direct comparison in terms of case-control-testing (1:1 matching) was feasible. 60 minutes after inserting the horns in the organ bath 1 ml of Krebs-Ringer solution respectively seminal plasma was administered synchronously into the lumen of each uterus horn. After each 45 minutes this procedure was repeated twice, after another 45 minutes the survey was aborted. Oxygenized nutrient solution supplied both horns with oxygen, electrolytes and glucose. The intraluminal pressure changes were detected by a pressure catheter and digitized therefore. Results and observations A total amount of 34 uterine horns were used for this experimental series. Regarding measuring point IUP1 (in proximity to the ovary) it was shown that seminal plasma induced a significant (p <0.05) greater increase in myometrial activity than Krebs-Ringer solution with reference to all reviewed items (AUC = 3

intraluminal pressure-time product "total pressure, frequency, average and maximum value). Regarding measuring point IUP2 (in proximity to the cervix) seminal plasma induced a significant (p <0.05) greater increase referring to AUC and frequency. Conclusion The results definitely demonstrate that human seminal plasma increases uterine motility. As component of human seminal fluid prostaglandins seem likely to be a direct effector of uterine contractility enhancement. Because of individual variations respecting prostaglandin levels in human seminal plasma, the interaction of prostaglandin-mediated response in the uterus cannot be interpreted by absolute concentrations, but is rather due to a specific PGF-PGE ratio. Furthermore, it is supposable that each uterus requires also an individual prostaglandin ratio in seminal plasma for regular functioning and therefore sufficient transport of sperm. Consequently this fact could explain failed fertilization, even though both potential parents are quite capable of successful reproduction upon alternating partners. In the course of this dissertation, the intraluminal pressure variations of a postcoital uterus (contact with seminal plasma) could be examined directly. The contractionenhancing effect asks for further research concerning its possible use/ application and benefits in artificial reproduction, e.g. as an adjuvant in intrauterine insemination. 4

2. Einleitung In Abhängigkeit von Studie und Definition variiert die Prävalenz der Infertilität beim Menschen und beträgt dabei bis zu 15% (32). Laut Gnoth et al. liegt Infertilität dann vor, wenn eine Konzeption nach 48 Monaten trotz regelmäßigen Koitus ausbleibt. Dies ist bei ca. 5 % der Paare mit Kinderwunsch der Fall (10). Laut WHO (1987) ist die Ursache für ungewollte Kinderlosigkeit zu 39% bei der Frau, zu 20% beim Mann und zu 26% bei beiden Partnern zu suchen. Es müssen folglich sowohl Mann als auch Frau bei der Erforschung ungewollter Kinderlosigkeit Berücksichtigung finden. Dennoch geben diese Zahlen Anlass insbesondere den Hintergrund weiblicher Infertilität zu analysieren. Als Ursache kommen hier anatomische Störungen des Uterus (z.b. Myome, Polypen) und der Tuba uterina (z.b. Stenose oder Verschluss), sowie hormonelle (v.a. ovarielle) Insuffizienz, aber auch psychosomatische Faktoren in Betracht (52). Desweiteren gewinnen Störungen der weiblichen Genitalmuskulatur - im speziellen der Uterusmotilität - an Bedeutung. Um einen regelrechten Spermientransport durch die Gebärmutter zu gewährleisten, unterliegt der Uterus gemäß seinem Zeitpunkt im Menstruationszyklus wechselnden Kontraktionsmustern. In der präovulatorischen Phase können beispielsweise die höchsten Frequenzen und Amplituden verzeichnet werden. Nach der Ovulation sinken sowohl Frequenz als auch Amplitude der Kontraktionen. Die Peristaltik ist hierbei cervico-tubar gerichtet. Neben Thermo- und Chemotaxis scheint so vor allem ein intakter uteriner Transportmechanismus die erfolgreiche Konzeption maßgeblich zu beeinflussen (1, 19, 56). Auch am Menschen konnte bereits gezeigt werden, dass ein funktionstüchtiger uteriner Spermientransport die Befruchtungsrate signifikant erhöht, sowohl nach konventionellem Beischlaf als auch nach intrauteriner Insemination (15). Ein nachweislich auf den dominanten Follikel gerichteter 5

unilateraler Transport von spermien-nachempfundener Partikel verdeutlicht die Rolle suffizienter Uterusperistaltik (17). Vor diesem Hintergrund erscheinen uterine Kontraktionsstörungen folglich als bedeutsame Ursache ausbleibender Befruchtungen und geben Anlass zu weitergehender Forschung. Das Seminalplasma, eine Flüssigkeit gebildet von den akzessorischen Geschlechtsdrüsen des Mannes, spielt in diesem Zusammenhang eine wohl wesentliche Rolle. Studien zeigen eine Erhöhung der Wurfrate bei Sauen, welche vor künstlicher Befruchtung mit vasektomierten Ebern gepaart wurden bzw. welchen vor der Paarung Ejakulat appliziert wurde, dessen Spermienfraktion zuvor mittels Schockfrostung abgetötet wurde (21, 31). Weitze et al. und Martin Rillo et al. erzielten eine Verbesserung der Besamungsergebnisse, indem sie den Samenzellen Seminalplasma beimengten bzw. im Rahmen artifizieller Insemination zusätzlich injizierten (25, 59). Entsprechend wird Seminalplasma in der Tierzucht bereits zur Optimierung der Befruchtungsergebnisse verwendet. Es stellt sich also die Frage, ob Seminalplasma auch in der menschlichen (künstlichen) Reproduktion die Befruchtungsergebnisse positiv beeinflussen kann. Seminalplasma, die flüssige Phase und somit Bestandteil des Ejakulats, gelangt nach Koitus physiologischerweise in die Vagina bzw. vor die Portio vaginalis uteri und alsbald in die Cervix und den Corpus uteri. Die immunmodulatorische Wirkung des Seminalplasmas wurde bereits intensiv erforscht (11, 57). Untersuchungen hinsichtlich des Effekts von Seminalplasma und dessen Bestandteilen auf die Kontraktilität des humanen Uterus lassen vermuten, dass Krämpfe und folglich Schmerzen im Unterleib der Frau nach intrauteriner Insemination durch Seminalplasma hervorgerufen werden (46). Kontrollierte, experimentelle in-vitro-untersuchungen am erhaltenen, physiologisch und anatomisch vollständig intakten Organen versprachen genaueren Aufschluss über durch Seminalplasma induzierte Kontraktionsmuster zu geben, blieben jedoch bislang aus. 6

So war es Gegenstand dieser Arbeit, die Reaktion der Uterusmuskulatur auf sequenziell applizierte Seminalplasmaboli in das Lumen der Gebärmutter zu untersuchen. Die durchgeführten Versuchsreihen sollten so Aufschluss über das intraluminale Druck-Zeit-Produkt, die Frequenz und den Mittel- und Maximalwert der zu erwartenden Kontraktionen geben. Um die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen und somit die Beurteilung des Nutzens von Seminalplasma im Zusammenhang mit artifizieller Reproduktion aus humanmedizinscher Sicht zu ermöglichen, wurde menschliches Seminalplasma verwendet und die Menge an Seminalplasma in Anlehnung an die Beobachtungen von Sahmay et al. (Schmerzen nach intrauteriner Insemination von Seminalplasma) auf jeweils einen Milliliter pro Injektion beschränkt (46). Die Bereitstellung der für eine solche Studie benötigte Anzahl von humanen und gesunden Uteri ist jedoch vor allem unter ethischen Gesichtspunkten unmöglich. Menschliche Uteri, welche in ausreichender Menge zur Verfügung stünden, sind aufgrund ihrer Pathologie wie z.b. Myomen, nicht verwertbar. So liegt es nahe, das an der Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg bereits mehrfach angewandte und somit ausgereifte Modell des extrakorporal-perfundierten Schweineuterus heranzuziehen (7, 22). Gründe hierfür waren zudem die Ähnlichkeit der Gebärmutter in Anatomie und Physiologie beider Spezies, sowie die Möglichkeit der direkten Beobachtung des Uterus unter physiologischen Bedingungen im Organbad von bis zu 8 Std. (28, 29). 7

3. Material und Methodik 3.1. Grundlagen 3.1.1. Anatomie und Physiologie des nichtschwangeren menschlichen Uterus Anatomie des menschlichen Uterus Der Uterus der geschlechtsreifen Frau ist etwa 7 9 cm lang und ca. 80-120 g schwer. Dieses birnenförmige Hohlorgan besitzt die Fähigkeit sein Gewicht in der Schwangerschaft um das Zehnfache zu steigern und befindet sich - durch einen bindegewebig-elastischen Halteapparat fixiert mittig im Unterbauch, wo es eine Anteversio bzw. Anteflexio einnimmt. Im Ligamentum latum verläuft die Arteria uterina, welche den größten Anteil der Blutversorgung darstellt. Sie anastomosiert über einen Ramus ovaricus mit der Arteria ovarica und gibt einen Ramus tubarius und einen Ramus vaginalis ab, die die entsprechenden Gebiete des inneren Genitales versorgen. Zahlreiche Kollateralen stellen die Blutversorgung sicher. Der Plexus uterovaginalis, gespeist mit sympathischen Fasern aus dem lumbalen Grenzstrang und parasympathischen Fasern aus dem sakralen Plexus pudendus, sorgt für die vegetative Innervation des Uterus (45). Die oberen zwei Drittel des Organs bezeichnet man als Körper (Corpus uteri), das untere Drittel als Gebärmutterhals (Cervix uteri). Der oberste Teil des Korpus, welcher das Gewölbe zwischen bzw. oberhalb der beidseitigen Tubenmündungen bildet, nennt sich Fundus uteri. Die innere, dreieckförmige Höhle heißt Cavum uteri. Die untere Spitze der Zervix wird als Portio vaginalis cervicis (Portio) bezeichnet und ragt in das hintere Scheidengewölbe hinein (47) (Abb.1). 8

Abbildung 1: Anatomie des menschlichen Uterus (a= Ovarium; b= Corpus uteri; c= Fundus uteri; d= Arteria uterina; e= Tuba uterina; f= Arteria ovarica; g= Cervix uteri; h= Portio vaginalis cervicis) Die uterine Wand besteht aus drei Schichten: Endometrium (Tunica mucosa), Myometrium (Tunica muscularis) und Perimetrium (Tunica serosa). Das Endometrium (1-8 mm dick), von Zylinderepithel bedeckt, bildet den intrauterinen Flüssigkeitsfilm. Hier implantiert sich auch die befruchtete Eizelle. Das Myometrium (1,5-2,5cm dick), eine aus inneren zirkulären und äußeren längsverlaufenden Fasern glatter Muskulatur und Gefäßen bestehende Muskelschicht, befähigt das Organ durch seine Struktur und enge Verzahnung mit dem Endometrium zur Abstoßung bzw. Ausscheidung des Menstruationsblutes und zu einer suffizienten Blutstillung nach einer Geburt. Das Perimetrium ist der äußere peritoneale Überzug der Gebärmutter (40). 9

Physiologie und endokrinologischer Regelkreis des menschlichen Uterus Unter Menarche versteht man das erste Auftreten der Regelblutung in der Pubertät der heranwachsenden Frau. Ein regelmäßiger Ovulationszyklus - und somit die Geschlechtsreife - tritt meist nach anderthalb bis zwei Jahren ein. Dieser Zyklus wiederholt sich fortan normalerweise in regelmäßigen Abständen von etwa 28 Tagen. Der erste Tag der Menstruation wird als erster Zyklustag bezeichnet. Die erste Zyklusphase (Follikelphase, unterteilt in Desquamations- und Proliferationsphase) wird gekennzeichnet durch die Follikelreifung am Ovar. Die damit eintretende follikuläre Östrogenproduktion und die daraus resultierende Proliferation des Endometriums sind hierfür charakteristisch. Am 14. Zyklustag findet im normalen regulären Zyklus der Eisprung statt. Es schließt sich die Gelbkörperphase (Lutealphase, unterteilt in Sekretions- und Ischämiephase) an, welche Ihrerseits 14 Tage andauert. Bleibt die Nidation einer befruchteten Oozyte aus, schließt sich die Menstruationsphase an, im Rahmen derer die Endometriumschleimhaut abgestoßen wird. Der Zyklus beginnt anschließend von neuem (35). Ursächlich für diesen übergeordneten Regulationsmechanismus sind Kerne im Hypothalamus. Das hier sezernierte Gonadotropin-Releasing-Hormone (GnRH) stimuliert im Hypophysenvorderlappen die Freisetzung von luteinisierendes Hormon (LH) und follikelstimulierendes Hormon (FSH). GnRH, LH und FSH werden hierbei nicht kontinuierlich, sondern pulsatil ausgeschüttet (Abb.2). 10

Abbildung 2: Regelkreis des Menstruationszyklus Eine ausreichend hohe Serumkonzentration von LH und FSH aktiviert die Follikelreifung im Ovar. Aus den Follikelepithelzellen des Primärfollikels entwickeln sich unter dem Einfluss der Gonadotropine (LH, FSH) die Granulosazellen, welche die aus der Theca interna stammenden und durch LH-Stimulus synthetisierte Androgene zu Östrogen (vornehmlich Östradiol) aromatisieren. Die Granulosazellen produzieren außerdem das Hormon Inhibin, das direkt in der Hypophyse die FSH-Produktion hemmt, ohne dabei die LH-Sekretion zu beeinflussen. Östradiol inhibiert über einen negativen Rückkopplungsmechanismus die Ausschüttung von GnRH aus dem Hypothalamus. Im Gegensatz dazu wird im Rahmen eines positiven Feed-Back die präovulatorische LH-Freisetzung massiv angeregt. Der nun folgende LH-Peak gilt als Auslöser des Eisprungs und bewirkt die anschließende Ausbildung des Gelbkörpers (Corpus luteum) aus dem rupturierten Follikel (Abb.3). 11

FSH und LH in IU/l 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728 Zyklustag FSH LH 17ß- Östradiol Progesteron 160 140 120 100 80 60 40 20 0 17ß- Östradiol in pg/ml und Progesteron in ng/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Zyklustag Abbildung 3: Menstruationszyklus der Frau (mit Schleimhautproliferation) Hinsichtlich des Uterus bewirkt das Östrogen eine Proliferation des Endometriums (bestehend aus der glykogenreichen Schleimhaut Zona functionalis und der Muskelschicht Zona basalis ), eine Forcierung der uterinen Perfusion und eine Sensibilisierung des Myometriums für Oxytocin. Dieses Hormon wird im Hypophysenhinterlappen gebildet und gilt als eines der potentesten Uterotonika. 12

Der Corpus luteum produziert Progesteron, das nun zu einer Herabregulation der Östrogenrezeptoren am Uterus führt, die Sekretion des Endometriums intensiviert und die Körpertemperatur um etwa 0,3 bis 0,5 C anhebt. Zudem inhibiert Progesteron über eine negative Rückkopplung die Ausschüttung von FSH und LH aus der Hypophyse. Bleibt eine Konzeption aus, bildet sich der Gelbkörper am Ende der Lutealphase zurück. Die Progesteron- und Östrogenkonzentration sinken entsprechend, wohingegen die FSH- und LH- Pulsatilität wieder zunimmt. Hierbei bewirkt insbesondere das Absinken des Progesteronspiegels ein Verschließen der sich während der Sekretionsphase ausgebildeten Spiralarterien. Die resultierende Ischämie schädigt die Zona functionalis, welche unter einem durchschnittlichen Blutverlust von 50 ml im Rahmen der Menstruation abgestoßen wird. Währenddessen steigen die Gonadotropine erneut an, infolge derer auch die Östrogenkonzentration im Serum zunimmt. Eine wiedereinsetzende Proliferation des Endometriums lässt die Menstruationsblutung versiegen, der Menstruationszyklus schließt sich (8, 49, 60). 13

3.1.2. Anatomie und Physiologie des nichtschwangeren Schweineuterus Anatomie des Schweineuterus Der Uterus der Sau variiert hinsichtlich Größe und Gewicht stark in Abhängigkeit vom Alter des Tieres (15-40cm und 40-500g). Das Organ stellt einen Uterus bicornis dar, welcher aus einem kurzen Corpus uteri besteht und in zwei lange, schraubenförmig gewundene Hörner (Cornua uteri) ausläuft (48). Es schließen sich die ca. 30 cm langen Eileiter (Tuba uterina) an, welche an den Ovarien enden. Diese imponieren aufgrund ihrer unregelmäßig höckerigen Oberfläche verursacht durch die zahlreichen Follikel himbeerartig. Cervix uteri und Vagina sind schwer voneinander abzugrenzen. Wie der menschliche Uterus besitzt die Sau einen starken, das Organ im Bauchraum fixierenden Halteapparat aus Bindegewebe. Auch hier ist die Arteria uterina das wichtigste Gefäß der arteriellen Blutversorgung. Es verläuft neben seinen Kollateralen, Venen und Nerven im genannten Bindegewebsapparat (Abb.4). Das uterine Epithel ähnelt dem des Menschen und setzt sich wie jenes aus 3 Schichten zusammen: Endometrium (Tunica mucosa), Myometrium (Tunica muscularis) und Perimetrium (Tunica serosa). Das 3-8 mm dicke Endometrium besitzt zahlreiche Drüsen und speichert während der Lutealphase das präovulatorische Sekret. Der beim menschlichen Uterus zirkuläre Muskelaufbau mit seinen äußeren Längsfasern findet sich ebenso beim porcinen Myometrium es ist mit 0,3-1,0 cm allerdings dünner. Das Perimetrium der Sau besitzt ferner das sogenannte Stratum musculare, welches beidseits in den bindegewebigen Halteapparat einstrahlt und sich in die Muskulatur der Cervix uteri fortsetzt (54). 14

Abbildung 4: Anatomie des Schweineuterus (a= Cornu uteri; b= Arteria uterina; c= Ovarium; d= Corpus uteri; e= Cervix uteri; f= Tuba uterina; g= Bindegewebe) Physiologie und endokrinologischer Regelkreis des Schweineuterus Die Geschlechtsreife tritt beim Schwein im Alter von ca. 7-9 Monaten ein. Wie folgend beschrieben, wiederholen sich die Ovulationen, wenn nicht durch Gravidität (Trächtigkeitsdauer ca. 115 Tage) unterbrochen, von nun an etwa alle 20 Tage. Das Schwein ist somit - wie der Mensch - polyöstrisch. Im Gegensatz zum Hund oder Rotwild erfahren beide Spezies somit mehrere Zyklen pro Jahr (2, 50). Im Gegensatz zum Menschen, ist der erste Tag des Zyklus beim Schwein nicht durch die einsetzende Menstruation, sondern durch den Tag der Ovulation gekennzeichnet. Hierbei gibt das porcine Ovar ca. 15-20 Follikel frei. Direkt im Anschluss reifen neue Follikel heran. Wiederum analog zum Menschen regen FSH und LH die Ovarfollikelproliferation und -funktion bzw. die Produktion von Androgenen in der Theca interna an. Die anschließend gebildeten Östrogene sind ursächlich für den nun folgenden LH-Peak, welcher als Auslöser der Ovulationen gilt. 15

Darüberhinaus steuert Prolaktin die Bildung von Progesteron in den Corpora lutea. Prostaglandin E2 reguliert durch Rückkopplung die Freisetzung der Gonadotropine aus dem Hypophysenvorderlappen. Der Zyklus des Schweins kann in vier Teile eingeteilt werden: der Metöstrus ( Nachbrunst, 3-4 Tage ab der Ovulation), der Diöstrus ( Zwischenbrunst, etwa 10 Tage), der Proöstrus ( Vorbrunst, 2-3 Tage) und der Östrus ( Brunst etwa 3-4 Tage). Der Metöstrus ist der erste Part der Corpum-Luteum-Phase. Wie auch im Diöstrus ist somit das in den Gelbkörpern gebildete Progesteron hauptursächlich für die Modifikation des Endometriums. Im Uterus beginnt die Sekretionsphase, im Rahmen derer ideale Bedingungen zur Nidation geschaffen werden. Die Hypophyse fördert durch Freisetzung von FSH weiterhin das Follikelwachstum (39). Bleibt eine Befruchtung aus, bildet im nun folgenden Diöstrus das Endometrium Prostaglandin F2α, welches letztlich zu einem Untergang der Gelbkörper führt. Die uterinen Drüsen involutieren im Verlauf. Eine Menstruationsblutung, wie sie beim Menschen stattfindet, existiert bei Schweinen so nicht, allenfalls kann eine leichte vaginale Blutung auftreten. Die inzwischen heranwachsenden Follikel bewirken zum Ende des Diöstrus einen Anstieg der Östrogenkonzentration im Blut. Es folgt der Proöstrus. Neben dem eigentlichen Östrus gehört dieser zur Follikelphase. Der steigende Östrogenspiegel intensiviert die präovulatorische LH-Freisetzung und hemmt die FSH-Sekretion. Dazu synergistisch wirkt das Hormon Inhibin. Die Östrogenwirkung führt zum einen zur Proliferation des Endometriums, zum andern erhöht es die Motilität der glatten Uterusmuskulatur. Der Zyklus endet mit dem Östrus. Die Konzentration an LH steigt steil an und veranlasst die finale Reifung der Follikel. Je nach Tier resultieren nun am Ende des Östrus bzw. am Anfang des Metöstrus die Ovulationen. Der Sexualzyklus ist somit komplett (29, 33, 39) (Abb.5). 16

14 70 FSH und LH in IU/l 12 10 8 6 4 2 60 50 40 30 20 10 17ß- Östradiol und Progesteron in pg/ml 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zyklustag FSH LH 17ß- Östradiol Progesteron 0 Abbildung 5: Menstruationszyklus der Sau Tatsächlich gibt es zwischen Mensch und Schwein Unterschiede bezüglich Anatomie und Physiologie. Die Anatomie, sowohl makro- als auch mikroskopisch, ist dennoch durchaus vergleichbar (51). Auch in Hinblick auf die endokrinologischen Regelkreise lassen sich große Gemeinsamkeiten zwischen den beiden Spezies feststellen. Die im Verlauf dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sind somit übertrag- bzw. anwendbar. 17

3.1.3. Seminalplasma Unter Ejakularche versteht man das erste Auftreten einer Ejakulation etwa ab Mitte der Pubertät des heranwachsenden Mannes. Fortpflanzungsfähigkeit besteht zu diesem Zeitpunkt noch nicht, da sich die Ausscheidung allein auf Seminalplasma beschränkt. Nach der späteren Spermarche besteht das Ejakulat fortan zusätzlich aus zellulären (Spermien und Epithelzellen der Hodenkanälchen) Bestandteilen (14). Das Seminalplasma stellt beim adulten Mann jedoch weiterhin mit ca. 95-99% die ungleich größere Fraktion dar (27). Gebildet wird diese Flüssigkeit von den akzessorischen Geschlechtsdrüsen, genauer stammen 5% aus den Glandulae bulbourethrales (Cowper-Drüsen) und urethrales (Littre-Drüsen), 15-30% aus der Prostata (Vorsteherdrüse) und bis zu 1% aus der Ampulla ductus deferentis (Samenleiterampulle) und Epididymis (Nebenhoden). Der fehlende und damit größte Anteil wird von den Vesicula seminalis (Samenbläschen) gebildet (24, 41, 42). Aufstellung der Zusammensetzung humanen Seminalplasmas (3,9,26,36,55): Merkmal Wert Einheit Substanz Wert Einheit ph 7,70 Zitrat 5,28 mg/ml Volumen 3,40 ml Laktat 620 mg/ml Osmolarität 354 mosm Harnstoff 450 mg/ml Substanz Wert Einheit Gesamt-Protein 50,4 mg/ml FSH 0,20 miu/ml LH 1,50 miu/ml Natrium 3,00 mg/ml Prolaktin 4,96 ng/ml Chlorid 1,42 mg/ml Testosteron 0,63 mg/ml Kalzium 0,28 mg/ml Östradiol 162,4 pg/ml Magnesium 0,11 mg/ml Prostaglandine 375,5 µg/ml Zink 0,17 mg/ml Prostaglandin-E 353,0 µg/ml Fruktose 2,72 mg/ml Prostaglandin-F 22,5 µg/ml Glukose 1,02 mg/ml 18

3.2. Material 3.2.1. Schweineuterus Für die Versuche wurden 17 Schweineuteri verwendet, die von der Erlanger Schlachthof GmbH zur Verfügung gestellt wurden. Je nach Alter der Sauen (ca. 8 bis 12 Monate), variierte das Gewicht der Organe zwischen mind. 150g max. 300g und betrug durchschnittlich 200g (LS200 Analysenwaage, Fa. Ohaus Scale Corporation, Florham Parc (USA)). Vorort am Schlachthof erfolgte die Auswahl der Uteri zum einen nach Gewicht, zum andern nach Gesamteindruck (Form und Unversehrtheit), insbesondere den Zustand der Parametrien und der in diesen verlaufenden Gefäßstrukturen, vornehmlich der Arterien. Das Alter der Sauen lag zum Zeitpunkt der Schlachtung zwischen 0,5 bis 1,5 Jahre. Die Tiere wurden unmittelbar vor Abholung und Transport zum Versuchslabor geschlachtet, somit konnte die kalte Ischämiezeit der Uteri auf ca. 15-20 min. begrenzt werden. 3.2.2. Seminalplasma Als Seminalplasma oder Samenplasma bezeichnet man den Anteil männlichen Ejakulats, welcher in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen und zu geringen Teilen auch im Hoden und Nebenhoden gebildet wird. Die Bereitstellung jenes Plasmas erfolgte sowohl durch das IVF- und Endokrinologische Labor der Universitätsfrauenklinik Erlangen, die Andrologische Abteilung der Universitätshautklinik Erlangen, als auch durch freiwillige Spender. Um die Ergebnisse später verallgemeinern zu können bzw. den Einfluss unterschiedlicher Zusammensetzungen der individuellen Proben möglichst gering zu halten, wurden ausschließlich Seminalplasmapools verwendet, d.h. das im Versuch gebrauchte Seminalplasma setzte sich aus Proben von mindestens 5, meist jedoch mehr als 10 Spendern zusammen. Die Pools wurden portionsweise in Eppendorf-Cups Modell 3810 (Fa. Eppendorf AG, Hamburg) abgefüllt und einzeln 19

zu jedem Versuch aufgetaut, indem sie in einem in dem Organbad befindlichen und mit ca. 25 ml Wasser gefüllten 50ml-Becherglas (Fa. Schott AG, Mainz) in Röhrchen No.-Ref. 55.476 (5ml; 75x 12mm) (Fa. Sarstedt AG & Co., Nünbrecht) auf dieselbe (physiologische) Temperatur des Organbads und demzufolge des Uterus gebracht wurden. Ebenfalls im beschriebenen Becherglas befand sich in einem zweiten baugleichen Röhrchen die später im Versuch ebenso intrauterin applizierte Krebsringerlösung (Zusammensetzung siehe unten). Erst unmittelbar vor Injektion der Substanzen wurden diese zu je 1 ml mit Kanülen Typ Microlance III 20G (0,9x 40mm) (Fa. Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) und Typ Supra Single Use Needle (1,5x 100mm) (Fa. Misawa Medical Industry Co., Ltd., Tokio (Japan)) separat in 2ml-Spritzen Discardit II (Fa. Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) aufgezogen und sogleich synchron in je ein Uterushorn appliziert (siehe Versuchsdurchführung unten). Krebs-Ringer-Lösung und Seminalplasma zusammengefasst werden im Verlauf dieser Arbeit als Testsubstanzen bezeichnet. 3.2.3. Krebs-Ringer-Lösung Die Krebs-Ringer-Lösung wurde als Testsubstanz zum Zwecke eines Placebos (s.o.) und als Nährlösung sowohl als Umgebungsmedium im Organbad als auch zur Perfusion der Uteri verwendet. Je nach Verwendungsart, werden die jeweiligen Lösungen in dieser Arbeit - die im Organbad befindliche Lösung als Umgebungsmedium/-lösung, die zur Perfusion verwendete Lösung als Perfusionslösung - bezeichnet. Vorherige Arbeiten am Modell zeigten, dass eine modifizierte Krebs-Ringer- Lösung besser verwertbare Messungen ergab: Einem Liter destilliertem Wasser wurden entsprechend folgende Substanzen zugesetzt (Angaben in g): 20

Magnesiumchlorid* 1 MgCl 2 0,05 Kaliumchlorid* 1 KCl 0,34 Natriumchlorid* 2 NaCl 7,0 di-natriumhydrogenphosphat* 1 Na 2 HPO 4 0,10 Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat* 1 NaH 2 PO 4 H 2 O 0,18 D(+)-Glucose-Monohydrat* 2 C 6 H 12 O 6 H 2 O 1,98 Natriumhydrogencarbonat* 1 NaHCO 3 1,26 Calciumchlorid-Dihydrat* 2 CaCl 2 2H 2 O 0,15 * 1 Fa. Merck KGaA, Darmstadt * 2 Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Oxygenierung der Nähr-/ Perfusionslösung Um das physiologische Kontrahieren der uterinen Muskelzellen zu gewährleisten, müssen diese ebenfalls mit Sauerstoff versorgt werden. Entsprechend erfolgte die Begasung der Perfusionslösung mit Medizinischem Carbogen-Gas (Fa. Linde Gas Therapeutics GmbH & Co. KG, Unterschleißheim), bestehend aus 5 Vol.-% CO 2 und 95 Vol.-% O 2 unter einem konstanten Druck von 0,05 bar. Mittels eines Flaschendruckminderers wurde das Gas über ein Silikonschlauch kontrolliert in die Perfusionslösung eingebracht. Die so entstandenen Gasbläschen sorgten somit auch für eine kontinuierliche Durchmischung der unter 2.1.4. genannten Bestandteile der Nährlösung. Zudem wurde so einem Ausfallen dieser Stoffe beständig entgegengewirkt. 3.2.4. Organbad Benutzt wurde ein rechteckiges Organbad (Plexiglasbecken, Maßanfertigung von der Firma Lettenbauer, Erlangen?). Zur Erwärmung der darin befindlichen Umgebungslösung diente ein dem Rand des Beckens parallel verlaufendes 21

Heizrohr, welches durch ein Wärmeaustauschsystem über jeweils einen zuführenden und einen abführenden Silikonschlauch mit einem Warmwasserbad verbunden war. 3.2.5. Warmwasserbad Dieses Warmwasserbad, ebenfalls ein rechteckiges Plexiglasbecken, wurde mit einem Einhängethermostat TYP ED (DIN: 12876) (Fa. Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach) erwärmt und so eine konstante Temperierung der im Organbad befindlichen Nährlösung auf 37 C (+/- 0,5 C) ermöglicht. Das Warmwasserbad wurde zudem zur Erwärmung der für die Perfusion verwendeten Nährlösung (abgefüllt in 1-Liter Messflaschen (Fa. Duran Group GmbH, Mainz)) verwendet. Die Temperaturen konnten somit einerseits konstant gehalten und eine eventuelle Verfälschung der Messergebisse durch eine von dem Umgebungsmedium abweichende Temperatur der Perfusionslösung ausgeschlossen werden. 3.2.6. Kanülierungsmaterial / Nahtmaterial Zur Kanülierung der Arteriae uterinae fanden Venenverweilkanülen Introcan Safety 24G (0,7x19mm) (Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Verwendung. Diese wurden mit Fäden Vicryl Polyglactin 910 (Fa. Ethicon GmbH, Norderstedt), entsprechend des Gefäßstatus in der Stärke 3-0, 4-0 bzw. 5-0, fixiert. Dieses Nahtmaterial wurde ebenfalls zur Ligatur der Tuben und zur Fixierung des intrauterinen Katheters am Corpus uteri benutzt. 3.2.7. Intrauterine Druckmessung Der intrauterine Druck (IUP) im Lumen des Uterus wird durch einen Präzisionsdruckkatheter Urobar-DL8-S mit zwei Drucksensoren registriert (Fa. 22

Raumedic AG, Münchberg), welcher zuvor 20 cm weit in das Uterushorn eingeführt und fixiert wurde. Der Abstand der Sensoren beträgt dabei 8 cm und ermöglicht somit eine ovarnahe (IUP1) und eine cervixnahe (IUP2) Messung. Die Applikation der Testsubstanzen (Seminalplasma/ KRL) kann ebenfalls mit diesem Katheter realisiert werden. Hierzu dient das eingearbeitete Lumen mit entsprechender Öffnung an der Katheterspitze nahe dem Drucksensor IUP1. 3.2.8. Arterielle Druckmessung Zur Bestimmung des arteriellen bzw. des Perfusionsdruckes wurde ein Druckaufnehmer Typ REF DPT-6100 (Fa. CODAN pvb Medical GmbH, Lensahn) in Form eines Durchflusssensors verwendet, der direkt in das Perfusionssystem integriert wurde. Die Perfusion im Sinne eines physiologischen Druckes zwischen 60-80 mmhg konnte so sichergestellt werden. 3.2.9. Temperaturmessung Die Messung der Temperatur im Organbad fand kontinuierlich mittels eines medizinischen Temperaturfühlers System 4000 D-RA4A (Fa. Exacon Scientific A/S, Roskilde (Dänemark)) statt. Die registrierten Werte lagen während des gesamten Versuches bei 37 C (+/- 0,5 C). 3.2.10. Datenaufzeichnung Sowohl die intrauterin und arteriell gemessenen Drücke als auch die Temperatur wurden mit je einem Datalogger Typ MPR1 (Fa. Raumedic AG, Münchberg) aufgezeichnet, überwacht und unter Verwendung eines entsprechenden Datenkabels auf einem PC gespeichert und anschließend ausgewertet. 23

3.2.11. Fotomaterial Sony Cyber-shot DSC-P8 Digitalkamera 3.2.12. Software Microsoft Excel 2003 (Fa. Microsoft Corporation, Redmond (USA)) Origin Pro, Version 7.5 SR0 (Fa. OriginLab Corporation, Northampton (USA)) SPSS, Version 14.0 (Fa. SPSS Inc., Chicago (USA)) 3.3. Methodik 3.3.1. Vorbereitung des Versuchs Vor Versuchsbeginn wird der Uterus wie folgt vorbereitet: 1. Präparation und Kanülierung der Arteriae uterinae, 2. Ligieren der Tubae uterinae und Aa./ Vv. ovaricae, 3. Trennung der beiden Uterushörner (Cornua uteri), 4. Einführen und Fixieren der Druckkatheter. Präparation und Kanülierung der Arteriae uterinae: Um als Versuchsuterus verwertet werden zu können, musste die A. uterina mindestens eine Länge von 1 cm vor Aufzweigung in ihre (End-)Äste aufweisen. Das Gefäß wird aus dem umgebenden Bindegewebe frei präpariert und mit einem Venenverweilkatheter kanüliert. Das anschließende Umbinden der Arterie mit einem Nahtfaden konnte ein Verrutschen des Katheters verhindern. Durch langsame Injektion weniger Milliliter einer isotonen NaCl-Infusionslösung (154, Fa. Berlin-Chemie, Berlin) wird die intravasale Lage und Durchlässigkeit der Kanüle bzw. der Gefäße kontrolliert (Abb.6). 24

Abbildung 6: Kanülierte A. uterina (a= Cornu uteri; b= Tuba uterina; c= Ovarium; d= A. uterine; e= Venenverweilkanüle) Ligieren der Tubae uterinae und Aa./ Vv. Ovaricae: Da nicht festgestellt werden konnte, ob und inwiefern die am Uterus belassenen Ovarien Einfluss auf das Kontraktionsverhalten des Uterus nehmen, werden die Tubae uterinae sowie die parallel verlaufenden Aa. und Vv. ovaricae möglichst ovarnah ebenfalls mit Nahtfäden ligiert. Trennung der beiden Uterushörner (Cornua uteri): Um die unerwünschte nervale/ elektrische und hormonelle Kopplung zu unterbinden, wird der Uterus längs des gemeinsamen Cavums und der Cervix mittels eines geraden Schnittes gespalten und somit die beiden Uterushörner getrennt. Eine ungewollte Vermischung der intrauterin applizierten Substanzen wurde somit ebenfalls verhindert. Die so entstandenen Uterushälften machen vor allem durch ihre genetische Identität und gleichen Hormon-/ Rezeptorstatus einen direkten Vergleich des Einfluss der applizierten Substanzen (Seminalplasma, KRL) möglich. Auch die Annahme, dass beide Hörner - da schließlich ursprünglich dasselbe Organ in vivo zu jeder Zeit 25

sämtlichen anderen endo- und exogenen Einflüssen gleichermaßen ausgesetzt waren, begünstigen die Aussagekraft des Versuchs. Die Validität der Versuche übersteigt dabei sogar derjenigen, welche beim Vergleich eineiiger Zwillinge erzielt wird, da im Gegensatz zu genetisch identischen Organhälften eineiige Zwillinge kein derart identisches Genom aufweisen (20). Einführen und Fixieren der Druckkatheter: Jeweils ein Druckkatheter wird in das Lumen des Uterushorns eingeführt und sogleich mit Nahtmaterial fixiert. Der Drucksensor IUP1, an der Katheterspitze lokalisiert, kommt dabei ovarnah bei 20 cm, der Drucksensor IUP2 ovarferner/ cervixnäher bei 12 cm zu liegen. Vor Versuchsbeginn werden die Uterushälften in das mit ca. 1,5 Liter Nährlösung gefüllte Organbad gelegt und mittels der Venenverweilkanüle an das folgend beschriebene Perfusionssystem angeschlossen. 3.3.2. Versuchsaufbau / Perfusionssystem Der Uterus wird mittels Rollenpumpen Pumpdrive 5201 (Fa. Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach) mit der Nährlösung perfundiert. Dabei wird jede (getrennte) Uterushälfte durch eine jeweils eigene Pumpe versorgt, um eine einheitliche Perfusion beider Hälften zu erzielen. Die Perfusionslösung, durch das Wasserbad auf 37 C (+/- 0,5 C) erwärmt, gelangt, angetrieben durch die oben genannten Pumpen, über einen Silikonschlauch zu einem Durchflusssensor, welcher den Flüssigkeitsdruck erfasst und per Datenkabel an einen Datalogger übermittelt. Durch diese Überwachung wird eine Perfusion entsprechend eines physiologischen intraarteriellen Druckes zwischen 60-80 mmhg ermöglicht und sichergestellt. Ein nachgeschalteter Schlauch mündet schließlich in die kanülierte Arteria uterina. Die Perfusionsrate betrug je nach intraarteriellen Druckverhältnissen ca. 12ml/min. 26

In Kombination mit der oben beschriebenen Oxygenierung, kann die angewandte Methode bzw. das Perfusionsmodell die Erhaltung eines physiologischfunktionalen Zustandes des Uterus bis zu 7 Stunden gewährleisten (7). Die intrauterin gelegenen Druckkatheter - jeweils mit einem Injektionslumen versehen - registrieren die im Versuch beobachteten Kontraktionen. Sowohl diese Messwerte als auch die Temperatur, mit der im Organbad befindlichen Temperatursonde gemessen, werden ebenfalls mit dem Datalogger digitalisiert und gespeichert. Zum besseren Verständnis des Versuchsaufbaus siehe Abb.7 und 8. 27

Abbildung 7: Versuchsaufbau (Schema) (a= Rollenpumpe; b= Einhängethermostat; c= Wärmebecken; d= intrauteriner Präzisionsdruckkatheter; e= Datalogger; f= Silikonschlauch; g= Wärmeaustauschsystem (Heizrohr); h= Temperaturfühler; j= Becherglas mit Testsubstanzen; k= Cornu uteri; m=perfusionslösung; n= Organbad; p= Durchflussdrucksensor) 28

Abbildung 8: Versuchsaufbau (a= Rollenpumpe; b= Einhängethermostat; c= Wärmebecken mit Perfusionslösungen; d= intrauteriner Präzisionsdruckkatheter; e= Durchflussdrucksensor; f= Silikonschlauch; g= Wärmeaustauschsystem (Heizrohr); h= Temperaturfühler; j= Silikonschlauch mit Venenverweilkanüle; k= Cornu uteri) Zeitlich ist der Versuch in vier Abschnitte einzuteilen, im Folgenden als t0 bis t3 bezeichnet. Definiert werden diese Zeiträume über 5 Zeitpunkte, t0 bis t4 genannt. Diese Zeitpunkte sind im Einzelnen: t0 (0. Min.) = Beginn des Versuchs; t1 (61. Min.) = intrauterine Injektion 1. Bolus KRL/SP; t2 (106. Min.) = intrauterine Injektion 2. Bolus KRL/SP; t3 (151. Min.) = intrauterine Injektion 3. Bolus KRL/SP; t4 (196. Min.) = Ende des Versuchs. 29

Entsprechend ergeben sich die Zeiträume: dem Abschnitt t0 ( t (0-1) ) = 0.-60.min. folgen 3 isochrone Messintervalle t1 ( t (1-2) ) = 61.-105.min., t2 ( t (2-3) ) = 106.-150.min., t3 ( t (3-4) ) = 151.-195.min. (Abb.9) Für die spätere Auswertung relevant waren nicht die zum Zeitpunkt der Injektion gemessenen Werte, sondern die dazwischenliegenden Intervalle t. 3.3.3. Versuchsdurchführung Der Versuch beginnt mit dem Start der Perfusion. Dem oben beschriebenen Ablauf folgend (Abb.9), verbleiben die beiden Uterushälften bis zum Einbringen des ersten Bolus Testsubstanz ohne äußere Manipulation im Organbad. So werden die Kontraktionen erfasst, welche im Folgenden als Grundaktivität bezeichnet werden. Diese Aktivität entspricht dem Messintervall t0. Erstmals nach 60 Minuten wird synchron in eines der Uterushörner 1,0 ml Krebs- Ringer-Lösung, in das andere Horn des vormals verbundenen Organs 1,0 ml Seminalplasma über die Injektionslumina der Druckkatheter appliziert. Hierbei wird besonders auf eine irritationsarme Injektion geachtet, sprich, die isothermen Testsubstanzen werden sowohl langsam als auch gleichmäßig intrauterin appliziert. Dieser Vorgang wird nach jeweils 45 Minuten zweimal wiederholt, nach weiteren 45 Minuten der Versuch sodann beendet. Abbildung 9: Zeitachse zur Darstellung des Versuchsablaufes 30

Entsprechend dieses Vorgehens erhält man zwei Messreihen: jene Uteri, welchen Seminalplasma und solche, welchen Krebs-Ringer-Lösung intrauterin appliziert wird. Es ergeben sich die im Folgenden verwendeten Bezeichnungen: Fallgruppe (erhält Seminalplasma): Cornua uterorum SP = CU SP ; Kontrollgruppe (erhält Krebs-Ringer-Lösung): Cornua uterorum KRL = CU KRL. 3.3.4. Bearbeitung der Messwerte / Statistik Bearbeitung der Messwerte Die Datalogger speicherten jegliche Änderungen des intrauterinen Druckes an Messpunkt IUP1 (cervixfern) und IUP2 (cervixnah), des intraarteriellen Druckes und der Temperatur. Am Ende eines jeden Versuchs werden die Messwerte auf einen PC übertragen und dort in eine Microsoft Excel Tabelle konvertiert. Man erhält in Abhängigkeit von der Zeit für IUP1, IUP2 und intraarteriellen Druck Werte in mmhg. Die Temperatur stellt sich in Grad Celsius dar: Zeit IUP 1 IUP 2 Art.-Druck Temp. (hh:mm:ss) (mmhg) (mmhg) (mmhg) ( C) 11:22:06 1,4 3,7 71,6 37,1 11:22:07 1,8 3,7 71,6 37,1 11:22:08 1,9 3,7 71,6 37,1 11:22:09 1,9 3,7 71,3 37,0 11:22:10 1,9 3,7 71,3 37,0 11:22:11 1,9 3,7 71,0 37,0 11:22:12 2,0 3,7 72,4 37,0 11:22:13 2,4 3,7 72,4 37,0 Abbildung 10: Ausschnitt aus einer Microsoft Excel Messwert-Tabelle 31

Intraarterieller Druck und Temperatur dienen lediglich zur Kontrolle der Versuchsbedingungen (Intraarterieller Druck = 60-80 mmhg; Temperatur 37 +/- 0,5 C), die Druckwerte am IUP1 und IUP2 werden mit der Software Origin Pro weiterbearbeitet. Dieses Programm dient der Kurvendarstellung bzw. auswertung und ermöglicht die Bestimmung folgender Qualitäten für jedes Messintervall ( t): - AUC ( Area Under The Curve ): "Gesamtdruck" (Druck-Zeit-Produkt als Integral in mmhg*h), welcher durch die Kontraktionen im beobachteten Zeitraum aufgebaut wird - Freq PEAK : Frequenz der Kontraktionen. Jede Amplitude > 0,05 mmhg gilt als Kontraktion - MW PEAK : Mittelwert aller gemessenen Druckamplituden > 0,05 mmhg (durchschnittliche Kontraktionsstärke) - MAX PEAK : Wert der höchsten Druckamplitude (stärkste Kontraktion) Abbildung 11: Exemplarischer Druckkurvenverlauf (X-Achse: (Uhr-)Zeit / Y-Achse: Druck in mmhg) 32

Statistik Sämtliche in dieser Arbeit vorgenommenen statistischen Tests wurden mit dem Wilcoxon Rangsummentest für verbundene Stichproben durchgeführt. Grundlage hierfür ist, dass bei diesem Test von keiner speziellen Verteilungsannahme (wie Symmetrie, homogene Varianzen, Normalverteilung) ausgegangen wird, er ist entsprechend robust gegenüber Ausreißern. Der Gebrauch einer gepaarten Signifikanztestung bezogen auf die zeitlich aufeinanderfolgenden Messintervalle innerhalb einer Messreihe/ eines Hornes ( t0 KRL zu t1 KRL, t1 KRL zu t2 KRL, etc.) liegt auf der Hand. Die oben genannte Separation der Versuchsuteri legitimiert ebenfalls die Anwendung jenes Wilcoxon Rangsummentests bezogen auf die einzelnen Intervalle untereinander ( t0 KRL zu t0 SP, t1 KRL zu t1 SP, etc.), da auch hier de facto dasselbe Organ untersucht wird. Alle Berechnungen diesbezüglich werden mit dem Statistical Programme for the Social Sciences (SPSS Version 14.0, Fa. SPSS Inc., Chicago (USA)) durchgeführt. p-werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. 4. Ergebnisse In der Zusammenschau aller Ergebnisse lässt sich feststellen, dass hinsichtlich aller untersuchten Qualitäten (AUC, Peak FREQ, Peak MW, Peak MAX ) sämtliche Startwerte der später mit Krebs-Ringer-Lösung untersuchten Uteri ( t0 KRL ) im Vergleich zu den entsprechenden Startwerten der im Laufe des Versuchs mit Seminalplasma behandelten Uteri ( t0 SP ) zwar unterschiedlich erscheinen, jedoch nicht signifikant verschieden sind. Es kann also von ähnlich gleicher Organfunktion und Grundaktivität ausgegangen werden. Somit ist ein direkter und relativer Vergleich der beiden Uterushörner wie in diesem Abschnitt folgend möglich. Ebenfalls lässt sich für alle Ergebnisse festhalten, dass nach zweiter Gabe der Substanzen (Krebs-Ringer-Lösung/ Seminalplasma) im Vergleich zum jeweiligen 33

Vorwert ( t2 KRL/SP zu t3 KRL/SP ) - also innerhalb einer Testreihe (CU KRL ; CU SP ) - keine signifikanten Veränderungen der Werte mehr erreicht wurden. Bei der Vorstellung der Ergebnisse werden zunächst die Veränderungen innerhalb einer Messreihe ( t0 KRL zu t1 KRL, t1 KRL zu t2 KRL, t2 KRL zu t3 KRL und t0 SP zu t1 SP, t1 SP zu t2 SP, t2 SP zu t3 SP ) beschrieben. Mit dem Hintergrund, dass jedem Uterushorn ein entsprechendes weitestgehend identisches Uterushorn der anderen Messreihe zugeordnet werden kann, werden sodann ebenfalls die einzelnen Messintervalle der beiden Messreihen (CU KRL / CU SP ) - ähnlich einer Fall-Kontrollgruppen-Testung mit 1:1 Matching ( t0 KRL zu t0 SP, t1 KRL zu t1 SP, etc.) - verglichen. CU SP stellt hierbei die Fallgruppe, CU KRL die Kontrollgruppe dar. Ein Vergleich beider Messpunkte zueinander hinsichtlich Ihrer synchron aufgezeichneten Werte (i.s.v. IUP1- t1 KRL zu IUP2- t1 KRL ) ergab ausschließlich signifikante Unterschiede im Messintervall t2. Betroffene Qualitäten sind AUC KRL, Frequenz KRL und Frequenz SP. Dabei wurden grundsätzlich geringfügig höhere Werte am IUP1 verzeichnet (Tabelle 1). 34

Krebs-Ringer-Lösung Seminalplasma AUC t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3 IUP1 690,99 1029,37 1645,28 1627,17 963,73 1848,11 2548,20 3266,29 IUP2 707,54 808,31 1365,80 1558,85 1092,09 1736,98 2709,51 2647,91 Differenz (IUP1-IUP2) -16,56 221,06 279,49 68,32-128,36 111,14-161,31 618,38 Faktor (IUP1/IUP2) 0,98 1,27 1,20 1,04 0,88 1,06 0,94 1,23 p 0,91 0,10 0,02 0,06 0,83 0,25 0,59 0,10 FREQ PEAK t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3 IUP1 8,12 15,10 18,78 18,86 11,23 21,18 24,39 25,12 IUP2 8,64 12,64 14,82 16,15 11,53 15,41 20,50 22,36 Differenz (IUP1-IUP2) -0,52 2,46 3,96 2,71-0,30 5,78 3,89 2,76 Faktor (IUP1/IUP2) 0,94 1,19 1,27 1,17 0,97 1,37 1,19 1,12 p 0,88 0,07 0,01 0,16 0,69 0,06 0,04 0,19 MAX PEAK t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3 IUP1 1,68 1,99 3,24 3,89 2,31 3,21 4,24 5,95 IUP2 2,12 1,88 2,85 2,96 2,57 3,22 4,73 4,32 Differenz (IUP1-IUP2) -0,44 0,11 0,39 0,93-0,26 0,00-0,49 1,63 Faktor (IUP1/IUP2) 0,79 1,06 1,14 1,32 0,90 1,00 0,90 1,38 p 0,72 0,46 0,33 0,10 0,87 0,49 0,65 0,21 MW PEAK t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3 IUP1 0,76 0,89 1,41 1,39 0,92 1,24 1,80 2,34 IUP2 1,00 0,86 1,31 1,36 1,02 1,31 1,94 1,90 Differenz (IUP1-IUP2) -0,24 0,04 0,11 0,03-0,09-0,07-0,15 0,44 Faktor (IUP1/IUP2) 0,76 1,04 1,08 1,02 0,91 0,95 0,92 1,23 p 0,80 0,65 0,46 0,15 0,65 0,91 0,98 0,15 Tabelle 1: Ergebnisse des direkten Vergleiches beider Messpunkte bezogen auf Messintervall (Mittelwerte) AUC= Area Under The Curve, FREQ PEAK =Frequenz der Kontraktionen, MAX PEAK : Höchste Druckamplitude, MW PEAK : Mittelwert der Druckamplituden Messintervalle: t0 ( t(0-1)) = 0.-60.min.; t1 ( t(1-2)) = 61.-105.min.; t2 ( t(2-3)) = 106.-150.min.; t3 ( t(3-4)) = 151.-195.min. 35