Modifiziertes Funktion Funktionen Protein des Target Ubiquitinierung Phytochrom Polyubi.: (Ubiquitylierung) AUX/IAA EIN2 Auxin-Signaltransduktion Transkriptionsfaktor in der Ethylen-Signaltransduktion Abbau über 26S Monoubi.: Histone, Sumoylierung LAF1 Phytochrom A- Signal- Transduktion Ran-GAP Nukleärer Transport -Antagonistisch zu Ubiquitin (stabilisierend) - subnukleäre -Kernlokalsiation Rubylierung Cul1 Aktivierung des SCF TIR - Komplexes (E3), Auxin- Signaltransduktion SUMO: Small ubiquitin-like modifier
Lehrbücher: Splicing: Polyadenylierung: Promoteranalyse: Molecular Biology of the Cell. 4rd ed. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Martin; Roberts, K. and Walter, P. (2002) New York and London: Garland Publishing. + CD Genes VII, Lewin (2000) Oxford University Press and Cell Press. Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem and Jones (2000) American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland Lorkovic,Z.J., Wieczorek-Kirk,D.A., Lambermon,M.,H. and Filipowicz,W. (2000) Pre-mRNA splicing in higher plants. Trends Plant Sci., 5, 160-167. Rothnie,H.,M. (1996) Plant mrna 3'-end formation. Plant Mol. Biol., 32, 43-61. Lebel,E., Heifetz,P., Thorne,L., Uknes,S., Ryals,J. and Ward,E. (1998) Functional analysis of regulatory sequences controlling PR-1 gene expression in Arabidopsis. Plant J., 16, 223-233. Arabidopsis Transkriptionsfaktoren: Riechmann,J.,L, Heard,J., Martin,G., Reuber,L., Jiang,C., Keddie,J., Adam,L., Pineda,O., Ratcliffe,O.,J., Samaha,R.,R., Creelman,R., Pilgrim,M., Broun,P., Zhang,J.,Z., Ghandehari,D., Sherman,B.K. and Yu,G. (2000) Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science, 290, 2105-2110. Yeast one-hybrid und yeast two-hybrid system: Homeobox Proteine: www.clontech.com www.biozentrum.unibas.ch/~zellbio/gehring.html
Nukleäre Genexpression Struktur Promotor und regulatorische Sequenzen Exons Introns Terminator Transkription RNA Polymerasen Allgemeine Transkriptionsfaktoren 5 Cap Splicing Spliceosome Splice-Signale Splicing Reaktion RNA editing Bildung des 3 -Endes
Promoter und regulatorische Sequenzen der RNAPol II TATA Box: Die TATA Box wird vom allgemeinen Transkriptionsfaktor TFIID erkannt. Die Transkription beginnt ca. 25 Nukleotide downstream der TATA Box...YYCA*YYY (Initiator Region InR). Wenn keine TATA-Box, (InR..nt24...AGAC (DPE, downstream prom. element) Regulatorische Sequenzen: Steuern die Transkriptions-Initiations-Rate. Durch DNA-looping können regulatorische Proteine (Transkriptionsfaktoren) mit Promoter- bzw. RNA Pol assoziierten Proteinen interagieren.
Gen: Nukleinsäure-Sequenz, die für die Synthese eines funktionellen Polypeptids oder einer funktionellen RNA notwendig ist. Zusätzlich zur kodierenden Region umfaßt ein Gen Elemente wie Promoter, regulatorische Sequenzen, Introns und Terminator. Promoter: DNA-Sequenz, welche die Position der Transkriptions- Initiation der RNA Polymerasen bestimmt. Am Promoter binden die allgemeinen Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase. Regulatorische Sequenzen: DNA-Elemente, welche die Aktivität eines Promoters steuern. Diese DNA-Sequenzen können bis zu 50.000 bp vom Promoter entfernt liegen.
Basaler Transkriptionsapparat Transkription Allgemeine Transkriptionsfaktoren: TFIID: TATA-binding protein (30 kda,tbp) erkennt TATA Box + ca. 11 TBP-assoziierte Faktoren (TAFs) TFIID ca. 800 kda TFIIDs mit unterschiedlichen TAFs erkennen unterschiedliche Promotoren. TFIIF: RAP74 ATP-abhängige DNA Helicase entwindet DNA RAP38 bindet an RNA Pol II TFIIF- RNA Pol Komplex TFIIH: ATPase, Helicase und Kinase phosphoryliert CTD-Tail (52x[YSPTSPS]) Phosphorylierung des CTD-Tails befreit die RNA Pol II von Transkriptionsfaktoren und die Elongation der RNA startet. Capping enzyme, splicing Faktoren und Komponenten binden an phosphorylierten CTD-Tail (Kopplung Transkription/ Modifizierung)
5 Cap 5 Cap Phosphohydrolase Guanyltransferase Guanosin-N-methyltransferase S-Adenosylmethionin S-Adenosylhomocystein Cap-Synthese durch RNA Pol II assoziierte Enzyme Cap-binding Protein RNP mit pre-mrna Funktionen: Markierung der pre-mrna Schutz for RNAi Initiation der Proteinsynthese RNA-Prozessierung
Splicing splicing Spliceosomen: small nuclear RNAs (snrnas) + >50 Proteine snrnas existieren als Ribonucleoprotein-Komplexe (snrnp,snurps) Splicing-Maschine Interaktionen: RNA/RNA, Protein/RNA, Protein/Protein Größe: 50-60S (vergleichbar mit ribosomaler Ue.)
Exons, Intron, Spleißen Exon: DNA-Segment eines unterbrochenen Gens, welches in der reifen mrna repräsentiert ist. Intron: DNA-Segment, welches transkribiert wird, und durch Zusammen- Spleißen der Exons aus dem Transkript entfernt wird. Spleißen: Vorgang des Entfernens der Introns und des Fusionierens der Exons in einer RNA. R-loop technique: Bildung eines mrna/dna-komplexes, EM-Aufnahme (Schema)
Kartierung von Exons Splicing S1 entfernt Loop und überhängende Enden Exonuclease VII schneidet überhängende Enden, Loops bleiben intakt dsdna- markiert (Sonde) Informationen über: Anzahl der Introns, Intron Größe Berk and Sharp Technik
Splicing splicing 4 Typen Introns: Die meisten Introns können in 4 Kategorien eingeteilt werden. Unterscheidungsmerkmale: strukturelle Eigenschaften, Spleißmechanismus G Gruppe II-Typ: Mitochondrien in Pilzen, pflanzlichen Mitochondrien und Plastiden, GU-AG Regel, mit Nuclear pre-mrna Typ verwandt, splicing in vitro (Pilze)
Splice-Signale (RNA) splicing GU-AG Regel: Das Intron wird durch GU- und AG-Dinukleotide begrenzt. Intron-Enden werden direktional definiert. 5 -splice site (Donor, left splice site) 3 -splice site (Akzeptor, right splice site) Branch-point (splicing Reaktion)
Splice-Signale Splicing^- Die GU-AG Regel gilt für Vertebraten, Hefe und Pflanzen. Unterschiede: z.b. polypyrimidin-tract (10xY) in Vertebraten und UA-reiche Sequenzen in Pflanzen Programme zur Intronvorhersage NetPlantGene http://www.cbs.dtu.dk/services/netgene2/ Genscan http://ccr-081.mit.edu/genscan.html
Splicing Reaktion Splicing wird durch Spliceosome katalysiert: u.a. U1,U2,U5 und U4/U6 snrnps (grüne Kreise) Schritt 1: Branch point A Nukleotid aus Intron greift 5 splice site an und das 5 Ende des Introns wird kovalent mit Branchpoint A verbunden (5-2 Bindung!) U2,U6 Schritt 2: Das 3 -OH Ende des ersten Exons wird mit dem Anfang des zweiten Exons verknüpft. Dabei wird die 3 splice site des Introns freigesetzt - snrnp-u5 interagiert mit 3 splice site.
Splicing-Reaktion Splicing 2x Transesterifizierung pre-mrna erste Transesterifizierung (S N 2) (2,5 -Phosphodiester Bindung!) zweite Transesterifizierung RNA-katalysierte Reaktion! lariat intron (Lasso) + mrna T. Cech (Nobelpreis)
Splicing-Reaktion Splicing Struktur der verzweigten RNA, die während des Splicings gebildet wird.
Splicing Alternatives splicing: Eine pre-mrna wird unterschiedlich gespleist. Dadurch werden Exons unterschiedlich kombiniert. (Immunglobuline) Pflanzen: HPR-Gen (Hydroxypyruvat Reduktase) HPR2 enthält peroxysomales Targeting Signal, HPR1 nicht.
Splicing Trans-splicing: Typische Spleißreaktionen bei Pflanzen sind intramolekular (cis-splicing). Es gibt jedoch auch Reaktionen an denen zwei oder mehr RNA Moleküle beteiligt sind (trans-splicing): in Plastiden. Tabak Gen für Chloroplastenprotein rps12 Chlamydomonas psaa
RNA editing Splicing Posttranskriptionelle Veränderung der proteinkodierenden Sequenz mancher mrnas idr in Organellen Vorkommen: mitochondriale Gene in Trypanosonen und Pflanzen, Chloroplastengene! 2 Arten von RNA Editing: a) Insertion oder Deletion b) Nukleotid Konversion C U (idr, zum Teil U nach C)
Splicing RNA editing Vorkommen des RNA Editings Information zum RNA Editing wird durch guide RNAs geliefert, welche komplementär zu Bereichen der zu editierenden RNA ist. Beteiligung von trans-faktoren (Pentatricopeptid Repeat Protein PPR)
RNA editing Splicing Veränderung der Proteinprodukte durch Editing
Splicing Domain shuffeling Rosetta Stein-Module interspezifischer Vergleich der Domänenzusammensetzungen gibt Hinweise auf Funktionsmodule
Exon shuffeling Splicing