Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss von 25 - Hydroxyvitamin D 3 in Kombination mit einer anionenreichen Fütterung auf den Calciumstoffwechsel der Milchkuh im peripartalen Zeitraum INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin Doctor mediciae veterinariae - ( Dr. med. vet.) vorgelegt von Inga Oberheide Hannover Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Gerhard Breves Physiologisches Institut 1. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves 2. Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Rehage Tag der mündlichen Prüfung: 31.03.2011 Dieses Projekt wurde mit Mitteln von DSM Nutritional Products gefördert.
Für meine Eltern
Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt: Oberheide, I., M. Wilkens, E. Azem, B. Schröder, G. Breves (2010): Influence of supplementation of 25-hydroxyvitamin D 3 combined with an acidifying diet on the calcium metabolism in periparturient dairy cows Vortrag: 64. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 09.-11.03.2010 in Göttingen Oberheide, I., M. Wilkens, E. Azem, B. Schröder, G. Breves (2010): Does the combination of 25-OHD 3 and a diet negative in cation anion difference (DCAD) influence calcium (Ca) homeostasis in the transition cow? Poster: 14 th International Conference on Production Diseases in farm animals 20.-24.06.2010 in Gent
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis... V Abbildungsverzeichnis... IX Tabellenverzeichnis... XV 1 Einleitung... 1 1.1 Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase... 1 1.2 Hypocalcämie... 4 1.2.1 Klinik und Ätiologie... 4 1.2.1 Klinische und wirtschaftliche Relevanz... 7 1.3 Strategien zur Hypocalcämieprävention... 9 1.3.1 Orale Applikation von Calcium zur Geburt... 9 1.3.2 Restriktion von Calcium in der Ration ante partum... 10 1.3.3 Fütterung einer anionenreichen Diät (DCAD-Konzept)... 10 1.3.4 Applikation von Vitamin D und seinen Metaboliten... 12 1.4 Zielsetzung der Arbeit... 13 2 Material und Methoden... 15 2.1 Tiere... 15 2.1.1 Der Betrieb... 15 2.1.2 Gruppeneinteilung, Fütterung und Behandlung der Versuchstiere... 16 2.1.3 Kontrolle der Futteraufnahme... 21 2.1.4 Bestimmung des Körpergewichts und des Body-Condition-Scores... 21 2.1.5 Gesundheitszustand der Versuchstiere... 22 2.1.6 Geburtsverlauf... 23 2.2 Probenentnahme... 24 2.2.1 Urinproben... 24 I
Inhaltsverzeichnis 2.2.2 Blutproben... 24 2.2.3 Milchproben... 26 2.3 Analytische Methoden... 26 2.3.1 Analyse der Urinproben... 26 2.3.2 Analyse der Blutproben... 27 2.3.2.1 ph-wert und ionisiertes Calcium im Vollblut... 27 2.3.2.2 Calcium, Phosphat und Magnesium im Plasma... 27 2.3.2.3 25-Hydroxyvitamin D 3 und 1,25-Dihydroxyvitamin D 3... 27 2.3.2.4 Parathormon... 28 2.3.2.5 Knochenmarker... 29 2.3.2.5.1 Knochenresorptionsmarker CrossLaps... 29 2.3.2.5.2 Knochenformationsmarker Osteocalcin... 31 2.3.3 Analyse der Milchproben... 33 2.3.3.1 Komplexometrische Calciumbestimmung in der Milch... 33 2.4 Statistische Auswertung... 34 3 Ergebnisse... 37 3.1 Futteraufnahme... 37 3.2 Parameter des Säuren-Basen-Haushalts... 38 3.2.1 ph-wert, NSBA und BSQ im Urin... 38 3.2.2 ph-wert im Vollblut... 41 3.3 Vitamin D Metabolite im Plasma... 41 3.3.1 25-OHD 3... 41 3.3.2 1,25-(OH) 2 D 3... 43 3.4 Parathormon im Plasma... 45 3.5 Mineralstoffe... 47 3.5.1 Calcium... 47 3.5.1.1 Gesamtcalcium im Plasma... 47 3.5.1.2 Ionisiertes Calcium im Vollblut... 49 3.5.1.3 Calcium im Urin... 51 3.5.1.4 Calcium in der Milch... 52 3.5.2 Phosphat... 53 3.5.2.1 Phosphat im Plasma... 53 3.5.2.2 Phosphat im Urin... 55 3.5.3 Magnesium... 57 3.5.3.1 Magnesium im Plasma... 57 II
Inhaltsverzeichnis 3.5.3.2 Magnesium im Urin... 58 3.5.4 Kalium und Natrium im Urin... 60 3.6 Parameter des Knochenstoffwechsels... 62 3.6.1 Knochenmobilisationsmarker CrossLaps... 62 3.6.2 Knochenformationsmarker Osteocalcin... 67 4 Diskussion... 69 4.1 Fütterung und Behandlung... 69 4.1.1 Futteraufnahme und Mineralstoffversorgung... 69 4.1.2 Einfluss der Fütterung auf den Säuren-Basen-Haushalt... 70 4.1.3 Einfluss der Fütterung auf die renale Exkretion von Mineralstoffen... 72 4.1.4 Auswirkungen der Behandlung mit HyD auf die Plasmakonzentrationen von 25-OHD 3... 74 4.2 Einfluss der HyD-Behandlung und der anionenreichen Fütterung auf 1,25-(OH) 2 D 3 und Parathormon... 78 4.3 Einfluss der HyD-Behandlung und der anionenreichen Fütterung auf die Calcium- und Phosphatkonzentrationen im Blut und im Plasma... 79 4.3.1 Ante partum... 79 4.3.2 Peripartal... 81 4.3.2.1 Einfluss der anionenreichen Diät auf die peripartale Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase... 82 4.3.2.2 Einfluss der Kombination einer anionenreichen Fütterung und der HyD- Supplementierung auf die Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase 84 4.3.2.3 Einfluss der Kombination des Kontrollfutters und der HyD- Supplementierung auf die Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase 86 4.3.3 Post partum... 88 4.4 Einfluss der HyD-Behandlung und der anionenreichen Fütterung auf die Magnesiumkonzentrationen im Plasma... 89 4.5 Schlussfolgerung und Ausblick... 90 5 Zusammenfassung... 93 6 Summary... 95 III
Inhaltsverzeichnis 7 Literaturverzeichnis... 97 8 Danksagung... 117 IV
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ADF acid detergent fiber (engl.), Zahlwert der Gerüstsubstanzen (Zellulose und Lignin) der Futterprobenanalyse ADL acid detergent lignin (engl.) ANOVA Analysis of Variance (engl.); Varianzanalyse a.p. ante partum (lat.); vor der Geburt Aqua dest. Aqua destillata (lat.); destilliertes Wasser BCS Body Condition Score BHV 1 Bovines Herpes Virus 1 Ca 2+ Ca t CaCO 3 Cl - Crea d DCAD EDTA engl. Eq et al. Fa. FM g ionisiertes Calcium Gesamtcalcium Calciumcarbonat Chlorid Kreatinin diet (engl.); Fütterung Dietary Cation Anion Difference (engl.); Kationen-Anionen- Differenz Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat Englisch Äquivalentmasse, Maßeinheit et altera (lat.); und andere Firma Frischmasse Vielfaches der Erd- oder Normalbeschleunigung (g n =9,80665 m s -2 ) HyD Rovimix -Hy-D 1,25% i interaction (engl.); Interaktion ICP-OES inductvely coupled plasma optical emission spectrometry (engl.) V
Abkürzungsverzeichnis I.E. i.m. i.v. K + lat. LKS meq MJ MJ ME MJ NEL Mw n Na + NDF NFC NH 4 + n.s. nxp OPG 1α-OHD 3 25-OHD 3 1,25-(OH) 2 D 3 p ph P i PMCA PTH Internationale Einheiten intramuskulär intravenös ionisierte Form von Kalium lateinisch Landwirtschaftliche Kommunikations- und Servicegesellschaft GmbH Milliequivalent, Maßeinheit für die Angabe der DCAD Mega Joule MJ umsetzbare Energie MJ Netto-Energie-Laktation Mittelwert Anzahl der Tiere ionisierte Form von Natrium neutral detergent fiber non-fibre-carbohydrats Ammonium nicht signifikant nutzbares Rohprotein osteoblast-derived soluble decoy receptor (engl.); Osteopoteregin 1-alpha-Hydroxyvitamin D 3, 1- alpha-hydroxycholecalciferol 25-Hydroxyvitamin D 3, 25-Hydroxycholecalciferol, Calcidiol 1,25-Dihydroxyvitamin D 3, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, Calcitriol Irrtumswahrscheinlichkeit negativ dekadische Logarithmus der Wasserstoffionen- Konzentration in mol*l -1 anorganisches Phosphat Plasma Membrane Calcium ATPase (engl.) Parathormon VI
Abkürzungsverzeichnis p.p. post partum (lat.); nach der Geburt r 2 RANK RANKL rpm SEM SO 4 2- SP t Tab. TMR TRPV5 TRPV6 TS UDP Bestimmtheitsmaß receptor activator of NF-kB (engl.) ligand of receptor activator of NF-κB (engl.) rounds per minute (engl.); Umdrehungen pro Minute starndard error of the mean (engl.); Standardfehler ionisierte Form von Schwefel Proteinlöslichkeit Behandlung Tabelle Total-Mixed-Ration transient-receptor-potential-channel, vanilloid-subfamily-member 5 (engl.) transient-receptor-potential-channel, vanilloid-subfamily-member 6 (engl.) Trockensubstanz undegradable protein (engl.) V. vena (lat.); Vene VDR vitamin D receptor (engl.); Vitamin-D-Rezeptor XA Rohasche XF Rohfaser XL Rohfett XP Rohprotein XS Stärke XX nitrogen free extractives (engl.) XZ water soluble carbohydrate (engl.) Chemische Elemente werden nach dem Periodensystem der Elemente abgekürzt. VII
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Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 2.1: Prozentuale Verteilung der Geburten in leichte und schwere Geburtshilfe; Anzahl der Tiere in Klammern... 24 Abb. 2.2: Zeitliche Darstellung der Blutprobenentnahme... 25 Abb. 2.3: Reaktionsprinzip des Sandwich-ELISA... 28 Abb. 2.4: Reaktionsprinzip des kompetitiven ELISA... 32 Abb. 3.1: Darstellung der Futteraufnahme getrennt nach Fütterungsgruppen und Anlagen (A1 und A2). Ergebnisse des ungepaarten t-tests (Mw ± SEM), ***: p<0,001... 37 Abb. 3.2: Darstellung der Urin-pH-Werte a.p. und p.p.; Ergebnisse der einfaktoriellen Varianzanalyse nach Kruskal-Wallis mit Dunn`s Multiple Comparison Test (Mw ± SEM), **: p<0,01; Anzahl der Tiere in Klammern... 39 Abb. 3.3: Darstellung der Netto-Säuren-Basen-Ausscheidung a.p. und p.p.; Ergebnisse der einfaktoriellen Varianzanalyse nach Kruskal-Wallis mit Dunn`s Multiple Comparison Test (Mw ± SEM); *: p<0,05; **: p<0,01; Anzahl der Tiere in Klammern... 40 Abb. 3.4: Darstellung des Basen-Säuren-Quotienten im Urin a.p. und p.p.; Ergebnisse der einfaktoriellen Varianzanalyse nach Kruskal-Wallis mit Dunn`s Multiple Comparison Test (Mw ± SEM)); *: p<0,05; **: p<0,01; Anzahl der Tiere in Klammern... 40 Abb. 3.5: Darstellung des Blut-pH über die gesamte Versuchsdauer (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 41 Abb. 3.6: Darstellung der 25-OHD 3 -Plasmakonzentration während des Behandlungszeitraums (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern).. 42 IX
Abbildungsverzeichnis Abb. 3.7: Darstellung der 25-OHD 3 -Plasmakonzentration über die gesamte Versuchsdauer (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 43 Abb. 3.8: Darstellung der 1,25-(OH) 2 D 3 -Plasmakonzentration über die gesamte Versuchsdauer (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung... 44 Abb. 3.9: Darstellung der 1,25-(OH) 2 D 3 -Plasmakonzentration im geburtsnahen Zeitraum (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung... 44 Abb. 3.10: Darstellung der Parathormonplasmakonzentration (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: d: Fütterung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 45 Abb. 3.11: Darstellung der Veränderungen der PTH-Plasmakonzentration zum Basalwert (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: d: Fütterung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 47 Abb. 3.12: Darstellung der Ca t -Plasmakonzentration über die gesamte Versuchsdauer (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; d: Fütterung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 48 Abb. 3.13: Darstellung der Ca t -Plasmakonzentration für den geburtsnahen Zeitraum (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: d: Fütterung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 48 Abb. 3.14: Darstellung der Ca 2+ -Konzentration im Blut über die gesamte Versuchsdauer (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; d: Fütterung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 50 X
Abbildungsverzeichnis Abb. 3.15: Darstellung der Ca 2+ -Konzentration im Blut im geburtsnahen Zeitraum (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; d: Fütterung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 51 Abb. 3.16: Calciumkonzentrationen im Urin a.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: *: p<0,05, ***: p<0,001; Anzahl der Tiere in Klammern... 52 Abb. 3.17: Calciumkonzentrationen im Urin p.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse; Anzahl der Tiere in Klammern... 52 Abb. 3.18: Darstellung der Ca t -Konzentration in der Milch in % (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; i: Interaktion von Fütterung und Behandlung... 53 Abb. 3.19: Darstellung der P i -Konzentration im Blut über die gesamte Versuchsdauer (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; i: Interaktion Behandlung und der Fütterung... 54 Abb. 3.20: Darstellung der P i -Konzentration im Blut im geburtsnahen Zeitraum (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung... 55 Abb. 3.21: Phosphatkonzentrationen im Urin a.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse; Anzahl der Tiere in Klammern... 56 Abb. 3.22: links: Darstellung der Phosphatkonzentrationen im Urin p.p. je Einzeltier für die Kontrolle+HyD- und die DCAD-Gruppe; rechts: Phospatkonzentrationen im Urin p.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: **: p<0,01; Anzahl der Tiere in Klammern... 56 Abb. 3.23: Darstellung Magnesiumkonzentration im Plasma über die gesamte Versuchsdauer (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; d: Fütterung; i: Interaktion Behandlung und der Fütterung... 57 XI
Abbildungsverzeichnis Abb. 3.24: Abb. 3.25: Abb. 3.26: Abb. 3.27: Abb. 3.28: Abb. 3.29: Abb. 3.30: Abb. 3.31: Abb. 3.32: Abb. 3.33: Darstellung Magnesiumkonzentration im Plasma im geburtsnahen Zeitraum (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; d: Fütterung; i: Interaktion Behandlung und der Fütterung... 58 Magnesiumkonzentrationen im Urin a.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: ***: p<0,001; Anzahl der Tiere in Klammern... 59 Magnesiumkonzentrationen im Urin p.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse; Anzahl der Tiere in Klammern... 59 Kaliumkonzentrationen im Urin a.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: *: p<0,05, (n) = Anzahl der Tiere... 60 Natriumkonzentrationen im Urin a.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: **: p<0,01, (n) = Anzahl der Tiere... 61 Kaliumkonzentrationen im Urin p.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse; (n) = Anzahl der Tiere... 61 Natriumkonzentrationen im Urin p.p.; Mw ± SEM; Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse, (n) = Anzahl der Tiere... 62 Darstellung des Knochenmobilisationsmarkers CrossLaps im Plasma (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse... 63 Darstellung der Veränderungen des Knochenmobilisationsmarkers CrossLaps im Vergleich zum Basalwert vor Beginn der Behandlung (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung... 64 Darstellung der Veränderungen des Knochenmobilisationsmarkers CrossLaps im Vergleich zum Basalwert vor Beginn der Behandlung für jedes verwendete Einzeltier; Grau gepunktet dargestellt: Laktationsnummer 2 und 3; Schwarz dargestellt: Laktationsnummern > 3... 65 XII
Abbildungsverzeichnis Abb. 3.34: Darstellung des Knochenmobilisationsmarkers CrossLaps im Plasma für Tiere der zweiten und dritten Laktation (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung; d: Fütterung... 66 Abb. 3.35: Darstellung der Veränderungen des Knochenmobilisationsmarkers CrossLaps im Vergleich zum Basalwert vor Beginn der Behandlung für Tiere der zweiten und dritten Laktation (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse: t: Behandlung, d: Fütterung... 66 Abb. 3.36: Darstellung des Knochenresorptionsmarkers Osteocalcin im Plasma (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse... 67 Abb. 3.37: Darstellung der Veränderungen des Knochenresorptionsmarkers Osteocalcin im Vergleich zum Basalwert vor Beginn der Behandlung (Mw ± SEM; Anzahl der Tiere in Klammern); Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalyse... 68 Abb. 4.1: Darstellung der linearen Regression zwischen Ca 2+ und Ca t an Tag -4 und zur Geburt (Anzahl der Tiere in Klammern)... 81 Abb. 4.2: links: Darstellung der linearen Regression zwischen der Ca 2+ - und PTH- Konzentrationen der Fütterungsgruppen zwölf Stunden p.p. (Anzahl der Tiere in Klammern); rechts: ΔCrossLaps in Abhängigkeit von PTH an Tag 1 p.p. im Vergleich der Fütterungsgruppen unter Berücksichtigung von Tieren der zweiten und dritten Laktation (Anzahl der Tiere in Klammern)... 83 Abb. 4.3: Ca 2+ in Abhängigkeit von ΔCrossLaps zwölf Stunden p.p. unter Berücksichtigung von Tieren der zweiten und dritten Laktation (Anzahl der Tiere in Klammern)... 85 XIII
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Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tab. 2.1: Rationszusammensetzung: Ergebnisse der Weender Analyse und der Mineralstoffanalyse (Mittelwerte) des Futters a.p. für beide Anlagen sowie des Futters p.p. (Anlage 1). Dietary-Cation-Anion-Balance berechnet als DCAB [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 2-4 )... 18 Tab. 2.2: Ergebnisse der Mineralstoffanalyse beider Mineralfutter. Dietary-Cation- Anion-Balance berechnet als DCAB [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 2-4 )... 18 Tab. 2.3: Ergebnisse der anhand der Mineralstoffanalyse der Grundfutterration und der beiden Mineralfutter kalkulierten Mineralstoffkonzentrationen der kompletten Futterration a.p. in Anlage 1. Dietary-Cation-Anion-Balance berechnet als DCAB [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 2-4 )... 19 Tab. 2.4: Ergebnisse der anhand der Mineralstoffanalyse der Grundfutterration und der beiden Mineralfutter kalkulierten Mineralstoffkonzentrationen der kompletten Futterration a.p. in Anlage 2. Dietary-Cation-Anion-Balance berechnet als DCAB [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 2-4 )... 20 Tab. 2.5: Gruppeneinteilung... 21 Tab. 2.6: Darstellung der Körpergewicht der Versuchstiere a.p. und p.p. (Mw ± SEM); n = Anzahl der Tiere... 22 Tab. 2.7: Häufigkeit verschiedener Erkrankungen vom 270. Trächtigkeitstag bis einschließlich der dritten Woche p.p.; n = Häufigkeit der verschiedenen Erkrankungen je Versuchsgruppe... 23 Tab. 2.8: Gründe für die Nichtberücksichtigung von Tieren bei der statistischen Auswertung sowie die Anzahl der nichtberücksichtigten Tiere... 35 XV
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Einleitung 1 Einleitung 1.1 Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase Dem Element Calcium kommen im Organismus verschiedene wichtige Funktionen zu. Es ist unter anderem an der Knochenmineralisation, der Muskelkontraktion, der Blutgerinnung, der Sekretionstätigkeit verschiedener Drüsen und der Signalübertragung an Synapsen beteiligt. Des Weiteren spielt es eine große Rolle als second messenger, beispielsweise innerhalb von Signalkaskaden verschiedener Hormone und Wachstumsfaktoren (EL-SAMAD et al. 2002; RAMASAMY 2006). Aufgrund dieser physiologischen Bedeutungen ist es notwendig, über eine enge Regulation (HORST et al. 2005) die Plasmacalciumkonzentration, besonders des ionisierten Calciums (Ca 2+ ), konstant zu halten. Für diese Regulation sind im Wesentlichen die drei Hormone Calcitonin, Parathormon (PTH) und 1,25-Dihydroxyvitamin D 3 (1,25-(OH) 2 D 3 ) verantwortlich, die wiederum drei Zielorgane haben, den Darm, den Knochen und die Niere. Calcitonin ist ein Peptidhormon, das in den C-Zellen der Schilddrüse gebildet wird. Der wesentliche Stimulus für seine Synthese und Ausschüttung besteht in einem Anstieg der Konzentration des Ca 2+, verursacht z.b. durch die Aufnahme einer calciumreichen Nahrung (LITTLEDIKE & GOFF 1987), der über einen in den C-Zellen exprimierten Calcium-sensing-recptor erfasst wird (ENGELHARDT & BREVES 2005). Die Wirkung, die über Calcitoninrezeptoren vermittelt wird, zeigt sich als Hemmung der durch Osteoklasten eingeleiteten Knochenresorption (WEISBRODE & CAPEN 1974; RAMASAMY 2006) und als Verminderung der renalen, tubulären Rückresorption von Calcium, Magnesium und Phosphat (HAAS et al. 1971; LITTLEDIKE & GOFF 1987). Allerdings gibt es auch Studien (CARNEY 1995), die eine calcium- und magnesiumkonservierende Wirkung des Calcitonis infolge einer forcierten renalen Rückresorption nach einer Calciuminfusion bei Ratten zeigen konnten. Parathormon wird in der Nebenschilddrüse synthetisiert. Die Regelgröße für die PTH-Sekretion ist dabei, wie beim Calcitonin, die Konzentration des ionisierten Calciums (LITTLEDIKE & GOFF 1987; EL-SAMAD et al. 2002), die über den 1
Einleitung Calcium-sensing-receptor erfasst wird (RAMASAMY 2006). Liegen hohe Mengen an Ca 2+ im Plasma vor, so wird die PTH-Produktion und -Ausschüttung bis auf ein Minimum reduziert (LITTLEDIKE & GOFF 1987). Kommt es hingegen zu einem Abfall der Ca 2+ -Konzentration, so wird zum einen die PTH-Produktion gesteigert (LITTLEDIKE & GOFF 1987), zum anderen kommt es innerhalb weniger Sekunden zu einer Freisetzung des in Sekretgranula in der Nebenschilddrüse gespeicherten PTHs (BROWN & MACLEOD 2001). Ähnlich wie Calcitonin wirkt PTH über die entsprechenden PTH-Rezeptoren v.a. auf die Niere und den Knochen (LITTLEDIKE & GOFF 1987). Am Knochen führt es zu einer verstärkten Calciummobilisation aus dem Skelett (LITTLEDIKE & GOFF 1987; RAMASAMY 2006). In der Niere bewirkt es beim monogastrischen Tier zum einen eine gesteigerte Rückresorption von Calcium und Magnesium, zum anderen eine forcierte Phosphatausscheidung mit dem Urin (LITTLEDIKE & GOFF 1987; EL- SAMAD et al. 2002). Des Weiteren hat PTH allerdings auch eine indirekte Wirkung auf den Darm, in dem es in der Niere den letzten Hydroxylierungsschritt der 1,25-(OH) 2 D 3 -Produktion stimuliert (ENGSTROM et al. 1987; EL-SAMAD et al. 2002; RAMASAMY 2006), und darüber die intestinale Calciumabsorption erhöht. Das Steroidhormon 1,25-Dihydroxyvitamin D 3 (1,25-(OH) 2 D 3 ) stellt die stoffwechselaktivste Form des Vitamin D dar (HORST & REINHARDT 1983; LITTLEDIKE & GOFF 1987; RAMASAMY 2006). Es wird über zwei Hydroxylierungsschritte aus Vitamin D gebildet, welches entweder mithilfe von UV- Strahlung in der Haut gebildet (Vitamin D 3 ) oder über die Nahrung aufgenommen wird (Vitamin D 2 und D 3 ) (LITTLEDIKE & GOFF 1987; DUSSO et al. 2005; RAMASAMY 2006). In der Leber erfolgt die erste Hydroxylierung an Position 25, katalysiert durch die 25-Hydroxylase (HORST & REINHARDT 1983; DUSSO et al. 2005; RAMASAMY 2006). Da dieser Schritt keiner besonders engen Regulierung unterliegt, wird das hierbei entstehende 25-Hydroxyvitamin D 3 (25-OHD 3 ) auch als Indikator für die Vitamin D-Versorgung angesehen (LITTLEDIKE & GOFF 1987). Gebunden an das vitamin D binding protein gelangt das 25-OHD 3 zur Niere. Hier erfolgt der zweite Hydroxylierungsschritt, katalysiert durch die 1α-Hydroxylase. Dabei entsteht die biologisch wirksamste Form des Vitamin D, das 1,25-(OH) 2 D 3 2
Einleitung (LITTLEDIKE & GOFF 1987). Die Aktivität der 1α-Hydroxylase ist streng reguliert (FRASER & KODICEK 1970). Hohe PTH- sowie niedrige Plasmacalcium- und Plasmaphosphatkonzentrationen sind die stärksten Stimuli für die 1,25-(OH) 2 D 3 - Produktion (LITTLEDIKE & GOFF 1987). Dahingegen hemmt 1,25-(OH) 2 D 3 seine eigene Produktion durch Inhibition der 1α-Hydroxylase (negativer Feedbackmechanismus) (ENGSTROM et al. 1987; BROWN et al. 1999; RAMASAMY 2006). Gleichzeitig stimuliert es die Synthese der 24-Hydroxylase und damit die Hydroxylierung an Position 24. Diese Reaktion stellt den ersten Schritt des Inaktivierungsprozesses des Hormons dar. Nach seiner Bildung gelangt 1,25-(OH) 2 D 3 ins Blut und wird gekoppelt an das vitamin D binding protein transportiert (REINHARDT et al. 1988). Die biologische Wirkung des 1,25-(OH) 2 D 3 wird über den vitamin D receptor (VDR), einen Ligandenaktivierten Transkriptionsfaktor, vermittelt (BROWN et al. 1999; DUSSO et al. 2005; RAMASAMY 2006). Dieser Rezeptor ist in besonders hohen Konzentrationen im Darm, im Knochen und in der Niere (RAMASAMY 2006), den an der Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase beteiligten Zielgeweben des 1,25-(OH) 2 D 3 (GOFF et al. 1991b), zu finden. Im Darm bewirkt 1,25-(OH) 2 D 3 nach Bindung an den VDR eine gesteigerte Expression der apikalen Calciumkanäle TRPV6 (und TRPV5), des cytosolischen Proteins Calbindin-D 9K, welches Calcium in der Zelle von der apikalen zur basolateralen Seite transportiert, sowie der basolateral lokalisierten Calciumpumpe (Plasma Membrane Calcium ATPase (PMCA)), die für das Ausschleusen des Calciums aus der Zelle ins Blut verantwortlich ist (VAN ABEL 2003; DUSSO et al. 2005), und somit eine Stimulation der aktiven Calciumresorption. Des Weiteren bewirkt 1,25-(OH) 2 D 3 im Darm eine verstärkte Phosphatabsorption durch eine stimulierte Expression des NaP i -Cotransporters (YAGCI et al. 1992) und durch eine eventuelle Veränderung in der Plasmamembranzusammensetzung der Enterozyten (KURNIK & HRUSKA 1985). Am Knochen verursacht 1,25-(OH) 2 D 3 eine forcierte Differenzierung und Reifung der Osteoklasten, die für die Knochenresorption verantwortlich sind, um den Calciumund Phosphatplasmaspiegel aufrechtzuerhalten. Die 1,25-(OH) 2 D 3 -VDR-Interaktion resultiert dabei im Knochen in Veränderungen im RANK/RANKL/OPG-System der 3
Einleitung Osteoblasten. Auf der Oberfläche der Osteoblasten befindet sich ein receptoractivator-of-nf-κb ligand (RANKL), der sowohl den osteoblast-derived soluble decoy receptor (OPG) binden kann, als auch den receptor activator NF-κB. Die Bindung des receptor activator NF-κB induziert eine Signalkaskade, die die Differenzierung und Reifung der Osteoklasten zur Folge hat (DUSSO et al. 2005). 1,25-(OH) 2 D 3 steigert nun die Expression von RANKL (BOYLE et al. 2003; KITAZAWA et al. 2003) und inhibiert gleichzeitig die OPG-Produktion (KONDO et al. 2004). Dadurch kommt es zu einer verstärkten Osteoklastenbildung und -aktivierung. Andererseits kann 1,25-(OH) 2 D 3 im Falle von steigenden Calcium- und Phosphatplasmaspiegeln auch die Knochenformation durch eine induzierte Synthese von Proteinen der Knochenmatrix und eine gesteigerte Mineralisierung bewirken (BROWN et al. 1999). Die Wirkung von 1,25-(OH) 2 D 3 auf das Skelett kann also sowohl anaboler als auch kataboler Natur sein. In der Niere bewirkt 1,25-(OH) 2 D 3 direkt eine gesteigerte tubuläre Calciumabsorption assoziiert mit einer verstärkten Expression von Ca 2+ -Transportproteinen (HOENDEROP et al. 2005) und vermutlich indirekt eine vermehrte Phosphatabsorption (BROWN et al. 1999; DUSSO et al. 2005). 1.2 Hypocalcämie 1.2.1 Klinik und Ätiologie Ein Absinken der Gesamtcalciumkonzentration im Blutplasma unter physiologische Normalwerte (2,1-2,5 mmol/l (GOFF 2006a)) bezeichnet man als Hypocalcämie. Diese tritt bei Schweinen, Schafen und Ziegen, besonders aber bei hochleistenden Milchkühen in der Regel 24 Stunden a.p. bis 72 Stunden p.p. auf (ALLEN & DAVIES 1981). Dabei kann die Hypocalcämie der Milchkuh sowohl subklinisch, wie auch klinisch manifest verlaufen. Für die klinische Form finden auch Bezeichnungen wie hypocalcämische Gebärparese, Milchfieber, puerperales Festliegen, Kalbefieber, Gebärkoma oder Paresis puerperalis Anwendung. Mit Einsetzen der Laktation steigt der Calciumbedarf der Kuh erheblich an, da große Mengen Calcium, ca. 20-50 g pro Tag (GOFF 2000), mit der Milch ausgeschieden 4
Einleitung werden (ALLEN & DAVIES 1981; REINHARDT et al. 1988; HORST et al. 2003). Gleichzeitig beträgt der extrazelluläre Calciumpool aber nur 9-11 g, wovon wiederum nur 3 g im Plasma vorliegen (GOFF 2000). Damit übersteigt der Calciumbedarf die verfügbare Calciummenge um ein Vielfaches. Der Organismus muss diesem plötzlich erhöhten Bedarf mit einer forcierten Knochenmobilisation, einer gesteigerten intestinalen Absorption sowie einer reduzierten renalen Calciumausscheidung begegnen (REINHARDT et al. 1988; HORST et al., 1997a; GOFF 2000; HORST et al., 2003). Diese Mechanismen sind allerdings während der Trockenstehphase relativ inaktiv (RAMBERG et al. 1984) und benötigen 24 bis 48 Stunden, um wieder ihre volle Leistungsfähigkeit zu erreichen (REINHARDT et al. 1988; HORST et al. 1994). Des Weiteren konnten GOFF et al. (1991b) nachweisen, dass auch die VDR- Konzentration im peripartalen Zeitraum abnimmt. Dadurch geraten nahezu alle Tiere in eine Hypocalcämie, überwiegend mit subklinschen Verlauf, die meistens schnell überwunden wird (ALLEN & DAVIS 1981; REINHARDT et al. 1988; Goff et al. 1989; DEGARIS & LEAN 2008). Bei lediglich 10% der hypocalcämischen Tiere tritt dabei eine klinische Symptomatik auf (DEGARIS & LEAN 2008). Warum es zu einer solch unterschiedlich Ausprägung des Erscheinungsbildes kommt, konnte bis heute allerdings nicht abschließend geklärt werden. Während einige Tiere mit einer Gesamtcalciumkonzentration von 1,5-1,6 mmol l -1 im Plasma bereits klinische Symptome zeigen, weisen andere Tiere bei ähnlichen Plasmakonzentrationen keinerlei Symptomatik auf. Daher können die in der Literatur angegebenen Referenzwerte für die subklinische (2,0-1,5 mmol l -1 ) und die klinische Hypocalcämie (< 1,5 mmol l -1 ) auch nur als Richtwerte angesehen werden (REINHARDT et al. 2010). Die klinische Symptomatik ist geprägt durch den Ausfall neuromuskulärer Funktionen (GOFF 2006b). Im Verlauf lassen sich dabei drei Stadien unterscheiden. Das erste Stadium, das in der Regel weniger als eine Stunde dauert und meist übersehen wird, ist charakterisiert durch eine geringgradig erhöhte Nervosität/Reizbarkeit und Tetanie (OETZEL 1988). Dahingegen ist das zweite Stadium, das ein bis zwölf Stunden andauern kann, gekennzeichnet durch Liegen in Brustlage bzw. autoauskultatorischer Haltung, Somnolenz und schlaffe Lähmungen (ALLEN & 5
Einleitung DAVIS 1981; OETZEL 1988). Im dritten Stadium, das nur im Falle einer hochgradigen Hypocalcämie auftritt, treten Seitenlage und ein fortschreitend getrübtes Bewusstsein bis hin zu Koma auf (ALLEN & DAVIS 1981; OETZEL 1988; DIRKSEN et al. 2002, S. 1247). Ohne Behandlung überleben Kühe, die das dritte Stadium erreicht haben, nur noch wenige Stunden (OETZEL 1988). Kommt es zu keinem therapeutischen Eingreifen, sterben ca. 75% der erkrankten Milchkühe (OETZEL 1988). Die Behandlung der klinischen Hypocalcämie erfolgt in der Regel mittels intravenöser Applikation von organischen Calciumverbindungen, wie z.b. Calciumborogluconat in 20-35%iger Lösung (DIRKSEN et al. 2002, S. 1250). Die verwendete, effektivste Dosis für diese Infusion beträgt dabei 2 g Calcium pro 100 kg Körpergewicht (GOFF 2008). Ziel der Milchfiebertherapie ist es, der Kuh über die Zeit des plötzlich erhöhten Calciumbedarfs bei gleichzeitig noch nicht vollständig greifenden Kompensationsmechanismen hinwegzuhelfen (GOFF 1999a). Berücksichtigt man zum einen, dass es mit zunehmendem Alter zu einer Verringerung der intestinalen VDR-Dichte (HORST et al. 1994; GOFF 2000), der Osteoklastenanzahl und der abbaubaren Knochenoberfläche (REINHARDT et al. 1988) sowie zu einer reduzierten Antwort der renalen 1α-Hydroxylase auf Calciumstresssituationen kommt (GOFF et al. 1991b), und zum anderen, dass mit zunehmendem Alter mit einer steigenden Milchleistung (HARDENG & EDGE 2001) und einem entsprechend erhöhten Calciumbedarf (HORST et al. 1997b; HORST et al. 2005) zu rechnen ist, so ist verständlich, dass das Erkrankungsrisiko für die Hypocalcämie mit steigendem Alter zunimmt (CURTIS et al. 1984, REINHARDT et al. 1988; HORST et al. 1997b; Goff 2000; HORST et al. 2005). Allerdings gibt es widersprüchliche Aussagen bezüglich einer Korrelation der Milchleistung und des Hypocalcämierisikos (ERB & GRÖHN 1988; GRÖHN et al. 1995). Jedoch erkranken Färsen nur in sehr seltenen Fällen an Milchfieber (OETZEL 1988; REINHARDT et al. 1988). Außerdem erhöht sich laut OETZEL (1988) das Risiko an der klinischen Hypocalcämie zu erkranken für Tiere, die bereits in einer vorangegangenen Laktation erkrankt waren. 6
Einleitung Neben dem Alter können allerdings auch bestimmte Variablen in der ante partum- Fütterung das Hypocalcämierisiko steigern. So gehen Calciumgehalte von über 100 g pro Tier und Tag in der Ration mit einer Erhöhung der Milchfieberinzidenz einher (JORGENSEN 1974). Dasselbe trifft auf Rationen mit hohen Kationengehalten zu (CRAIGE & STOLL 1947). Auf den genauen Wirkmechanismus beider Faktoren wird in den Abschnitten 1.3.2. und 1.3.3. eingegangen. Des Weiteren konnte für Phosphatgehalte von über 80 g pro Tag in der Ration eine Erhöhung der Hypocalcämieinzidenz festgestellt werden (JORGENSEN 1974; JULIEN et al. 1977; REINHARDT & CONRAD 1980; REINHARDT et al. 1988). Durch die erhöhte Phosphataufnahme kommt es zu einer gesteigerten Plasmaphosphatkonzentration, die einen hemmenden Effekt auf die Synthese von 1,25-(OH) 2 D 3 hat (TANAKA & DELUCA 1973). Als Konsequenz daraus wird die intestinale Calciumabsorption gehemmt (HORST et al. 1994). Als weiterer prädisponierender Faktor wird in der Literatur die Hypomagnesämie genannt, die z.b. durch die Aufnahme von einem magnesiumarmen und gleichzeitig kaliumreichen Weideaufwuchs hervorgerufen werden kann (GOFF 2000). Dabei kann die Hypomagnesämie den Calciumstoffwechsel auf zwei Wegen beeinflussen. Zum einen, in dem es die PTH-Sekretion als Antwort auf einen leichten Calciumabfall hemmt und so einen temporären Hypoparathyroidismus verursacht. Zum anderen, indem es die PTH-Sensitivität des Gewebes vermindert (Pseudohypoparathyroidismus) (GOFF 2004). 1.2.1 Klinische und wirtschaftliche Relevanz Sowohl die klinische Form der Hypocalcämie, die mit einer Inzidenz von bis zu 10% zu einer der am häufigsten auftretenden Erkrankungen der Milchkuh gehört (DEGARIS & LEAN 2008), als auch die subklinische Hypocalcämie, die mit einer (altersabhängigen) Prävalenz von 25% in der ersten bis zu 54% in der fünften Laktation auftritt (REINHARDT et al. 2010), gehen mit hohen ökonomischen Verlusten einher (GOFF et al. 1989). Dabei sind nicht nur die direkten Kosten der bei der klinischen Form notwendigen Behandlung zu berücksichtigen, es ist auch davon auszugehen, dass ca. 5-10% der 7
Einleitung erkrankten Tiere nicht auf diese ansprechen bzw. aufgrund von durch die Parese bedingten Verletzungen, wie z.b. Nerven- oder Muskelquetschungen oder infolge von Sekundärleiden sterben oder getötet werden (DIRKSEN et al. 2002, S. 1250). Zu diesen Folgeerkrankungen gehören Mastitiden, Ketosen, Dystokie, Labmagenverlagerungen, Uterusvorfälle, Nachgeburtsverhaltungen und andere Puerperalstörungen, die nicht nur zu weiteren Behandlungskosten, sondern auch zu einer reduzierten Milchleistung und Fruchtbarkeitsstörungen führen können (CURTIS et al. 1983; RISCO et al. 1984; GOFF & HORST 1997; HOUE et al. 2001; DEGARIS & LEAN 2008). Als Folge der eventuell auch nur subklinisch auftretenden und damit unerkannten Hypocalcämie kommt es zu einem verminderten Muskeltonus im Uterus, wodurch die hypocalcämischen Tiere sowohl für Dystokien und Nachgeburtsverhaltungen als auch für Uterusvorfälle prädisponiert sind (CURTIS et al. 1983; RISCO et al 1984; GOFF & HORST 1997; HOUE et al. 2001). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass hypocalcämische Tiere peripartal höhere Cortisolspiegel aufweisen, verglichen mit nicht betroffenen Kühen. Da dieses zu einer Immunsuppression zur Geburt führen kann (HORST & JORGENSEN 1982), steigt auch das Risiko dieser Tiere, an Metritiden zu erkranken (ERB et al. 1985). Von diesen pathophysiologischen Mechanismen ist auch die Eutergesundheit betroffen. Die Immunsuppression und die ebenfalls zu beobachtende Abnahme des Muskeltonus am Zitzensphinkter (GOFF & HORST 1997) prädisponieren hypocalcämische Tiere so auch für Mastitiden (CURTIS et al. 1983; GOFF & HORST 1997). Des Weiteren konnte, zumindest für klinisch erkrankte Tiere, nachgewiesen werden, dass die Futteraufnahme peripartal stärker vermindert ist als bei nicht erkrankten Tieren (MARQUARDT et al. 1977), und somit die Problematik der negativen Energiebilanz verstärkt wird. Außerdem konnten LITTLEDIKE et al. (1968) eine durch die Hypocalcämie verursachte inhibierte Insulinsekretion demonstrieren, was eine reduzierte zelluläre Glukoseaufnahme nach sich zieht. Für das Schaf konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Hypocalcämie einen inhibitorischen Effekt auf die Gluconeogenese hat und die Insulinresistenz der Zielgewebe verstärkt 8
Einleitung (SCHLUMBOHM et al. 1997). Daraus resultiert eine verstärkte Lipomobilisation zur Geburt und folglich ein erhöhtes Ketoserisiko (GOFF & HORST 1997; GOFF 1999b). Abgesehen von den Belastungen der Energiebilanz ist die reduzierte Futteraufnahme mit einer verminderten Pansenfüllung assoziiert. Außerdem konnte eine reduzierte Kontraktilität des Labmagens beobachtet werden. Als Konsequenz daraus ergibt sich für hypocalcämische Tiere ein erhöhtes Risiko für Labmagenverlagerungen (GOFF & HORST 1997). 1.3 Strategien zur Hypocalcämieprävention Aufgrund dieser großen Bedeutung, die der klinischen, aber auch der subklinischen Hypocalcämie in Bezug auf Folgeerkrankungen und wirtschaftliche Schäden zukommt, werden seit langem Konzepte entwickelt, um wirksame Präventionsmaßnahmen zur Stabilisierung der peripartalen Calciumhomöostase zu erzielen. Im Folgenden soll ein Überblick über die üblicherweise verwendeten Prophylaxemaßnahmen gegeben werden. 1.3.1 Orale Applikation von Calcium zur Geburt Eine Möglichkeit zur Prophylaxe stellt die orale Applikation von 3-4 Dosen schnell absorbierbaren Calciums, z.b. in Form von Calciumchlorid oder Calciumpropionat, im Zeitraum von 12-24 Stunden a.p. bis 24 Stunden p.p. dar (OETZEL 1996; GOFF et al. 1996). Dabei finden Dosierungen von 50 bis 125 g pro Applikation Anwendung (GOFF 2006a). Laut Goff (2006a) kommt es durch die deutlich erhöhte Calciumkonzentration im Gastrointestinaltrakt zu einem forcierten parazellulären Calciumtransport per Diffusion (GOFF 2006a), wohingegen der aktive, transzelluläre Calciumtransport weniger beeinflusst wird. Durch diese erhöhte Calciumaufnahme steht der Kuh im Moment des erhöhten Bedarfs insgesamt mehr Calcium zur Verfügung. Allerdings ist diese orale Eingabe zum einen arbeitsaufwendig und zum anderen mit dem Risiko einer Aspirationspneumonie verbunden. Außerdem kann es je nach Produkt auch zu Irritationen der gastrointestinalen Schleimhäute (WENTINK 9
Einleitung & VAN DEN INGH 1992) oder metabolischen Azidosen kommen (GOFF & HORST 1993). 1.3.2 Restriktion von Calcium in der Ration ante partum Eine weitere Möglichkeit ist die Fütterung einer calciumrestriktiven Diät (< 20 g pro Tag) an trockenstehende Tiere in der präpartalen Phase. Dies führt zu einem Abfall des Calciumgehaltes im Blut, wodurch die PTH-Sekretion stimuliert wird. Infolgedessen kommt es zu einer Aktivierung sowohl der Knochenresorption als auch der 1,25-(OH) 2 D 3 -Produktion, wodurch auch die transzelluläre, aktive Calciumabsorption im Gastrointestinaltrakt effizienter wird (KICHURA et al. 1982; HORST 1986; GOFF 2004; GOFF 2006a). Da so dem erhöhten Calciumbedarf zur Geburt mit bereits aktivierten Regulationsmechanismen begegnet wird, können die Kühe die kritische Phase besser kompensieren (HOUE et al. 2001). Bei einer calciumreichen Diät hingegen würden diese Mechanismen herunterreguliert werden (RAMBERG et al. 1984), da der Calciumbedarf der Kuh in dieser Situation fast ausschließlich über die passive Absorption im Darm gedeckt wird (1.2.1.). Die Umsetzung dieses Konzeptes gestaltet sich allerdings oftmals schwierig, da vor allem die Grundfutterkomponenten in der Regel calciumreich sind (THILSING- HANSEN et al. 2002a). Aus diesem Grund wurde in den vergangenen Jahren versucht, durch die Applikation von Calciumbindern wie z.b. Zeolite A, die Menge des verfügbaren Calciums in der Ration zu reduzieren. Damit konnte zwar das Auftreten der klinischen und der subklinischen Hypocalcämie reduziert werden (JØRGENSEN et al. 2001; THILSING-HANSEN et JØRGENSEN 2001; THILSING- HANSEN et al. 2002b), allerdings berichten THILSING-HANSEN et al. (2002b) sowie GRABHERR et al. (2009), dass es zu einer Reduktion der Futteraufnahme durch Zeolithe A kam. 1.3.3 Fütterung einer anionenreichen Diät (DCAD-Konzept) Eine Präventionsmaßnahme, die in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen hat, ist die Reduzierung des DCAD-Wertes (dietary-cation-anion- 10
Einleitung difference) der präpartalen Diät, also ein Ansäuern des Futters während der letzten 10 bis 28 Tage a.p. (ENDER et al. 1971; BEEDE 1992; OETZEL 1993; GOFF 2008; MOORE et al. 2000). Für die Berechnung der DCAD findet laut OETZEL (1993) in der Regel folgende Gleichung Anwendung, die bereits bei ENDER et al. 1971 beschrieben wurde: DCAD (meq kg -1 TS) = (meq Na + kg -1 TS + meq K + kg -1 TS) (meq Cl - kg -1 TS + meq SO 4 2- kg -1 TS) Durch eine Veränderung der Konzentrationen der für den Säuren-Basen-Haushalt relevantesten (starken) Ionen Natrium, Kalium, Chlorid und Schwefel kann das Kationen-Anionen-Verhältnis der Ration so manipuliert werden, dass die Anionen überwiegen und DCAD-Werte von -50 bis -150 meq kg -1 erreicht werden (OETZEL 1993; HORST et al. 1997b). Das übliche Verfahren zur Reduktion des DCAD-Wertes ist die Applikation von Verbindungen aus Kationen (Ca, Mg) und (starken) Anionen (Cl, S) ( Saure (anionische) Salze ), wie z.b. Calciumchlorid/sulfat, Magnesiumchlorid/sulfat oder Ammoniumchlorid/sulfat, zur vorliegenden Ration (ENDER et al. 1971; BEEDE 1992; OETZEL 1993; THILSING-HANSEN et al. 2002a). Nach der Aufnahme dieses anionenreichen Futters kommt es zu einer höheren intestinalen Absorption der starken Anionen im Vergleich zu ihren korrespondierenden Kationen (DEGARIS & LEAN 2008). Dadurch wird eine metabolische Azidose induziert, die vom Organismus in der Regel kompensiert wird. Die genaue Wirkung auf die an der Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase beteiligten Organe konnte bisher noch nicht vollständig geklärt werden konnte. Es wird vermutet, dass die Sensitivität des Gewebes gegenüber PTH erhöht wird, indem die Interaktion zwischen PTH und seinem Rezeptor effektiver erfolgt (HORST et al. 1997b; HOUE et al. 2001; GOFF & HORST 2003). Es käme so bei einer Belastung der Calciumhomöostase schneller zu einer Stimulation von Knochenresorption und renaler 1,25-(OH) 2 D 3 -Produktion, so dass die Rinder in der Lage wären, den erhöhten Calciumbedarf zur Geburt besser zu kompensieren (Block 11
Einleitung 1984; GOFF et al. 1991a; HORST et al. 1997b). Dahingegen würde eine metabolische Alkalose, bedingt durch eine kationenreiche Diät (1.2.1.), die Sensitivität sowohl des Knochen- als auch des Nierengewebes gegenüber PTH, aufgrund einer ph-bedingten Veränderung des PTH-Rezeptors, die die Interaktion zwischen PTH und seinem Rezeptor ineffektiv erfolgen lässt (GOFF 2000), reduzieren (BURNELL 1971; BECK & WEBSTER 1976). Die Hypothese der erhöhten PTH-Sensitivität infolge einer effektiveren Interaktion von PTH und seinem Rezeptor wird von in vitro-studien unterstützt, die in Kulturen aus UMR 106-01 Osteoblasten-ähnlichen Zellen nach einer metabolischen Azidose eine 1,5-2fach erhöhte PTH-Bindung sowie eine 2fach erhöhte PTH/PTHrP- Rezeptor-Expression auf mrna-ebene zeigen konnten (DISTHABANCHONG et al. 2002). Allerdings konnten BELLORIN-FONT et al. (1985) an Hunden nach einer induzierten chronischen metabolischen Azidose keine Unterschiede hinsichtlich der PTH-Rezeptorbindungskapazität sowie der -affinität feststellen. Obwohl der Wirkmechanismus demnach noch nicht abschließend geklärt werden konnte, konnte eine Reduktion der Milchfieberinzidenz durch den Einsatz einer anionenreichen Diät gezeigt werden (SEIFI et al. 2010). Jedoch konnte in zahlreichen Studien auch ein negativer Effekt der anionenreichen Diät auf die Futteraufnahme aufgrund einer reduzierten Schmackhaftigkeit festgestellt werden (BEEDE 1992; OETZEL 1993; HOUE et al. 2001; THILSING-HANSEN et al. 2002a; GOFF 2004). 1.3.4 Applikation von Vitamin D und seinen Metaboliten Eine weitere Prophylaxemaßnahme stellt die intramuskuläre Applikation von 10 Mio. I.E. des Vitamin D 3 2-8 Tage vor dem errechneten Geburtstermin dar (ALLEN & DAVIS 1981; RADOSTITS et al. 2000; THILSING-HANSEN et al. 2002a; ROSSOW 2002). Durch die hochdosierte Vitamin D-Zufuhr soll die intestinale Calciumabsorption gesteigert werden (RADOSTITS et al. 2000; GOFF 2004; GOFF 2006a; GOFF 2008). Zu berücksichtigen ist dabei, dass das aus Vitamin D 3 in der Leber gebildete 25-OHD 3 nur bei niedrigen Plasmacalciumkonzentrationen ausreichend in 1,25-(OH) 2 D 3 umgewandelt wird, da die Aktivität der 1α-Hydroxylase 12
Einleitung einer Regulation durch PTH unterliegt (siehe 1.1). Bis dann anschließend die über den VDR vermittelte genomische Wirkung auf die intestinale Calciumabsorption voll eingetreten ist, vergehen bis zu 24 Stunden (ROSSOW 2002). Zusätzlich muss berücksichtigt werden, dass aufgrund der Problematik der nicht immer termingerechten Abkalbung gegebenenfalls Wiederholungsbehandlungen notwendig werden (BLOCK 1984). Außerdem liegt die gewählte, nachweislich wirksame Dosierung nahe der toxisch wirkenden Dosierung (LITTLEDIKE & HORST 1982). Verringerte Applikationsmengen haben keine (HIBBS 1950) oder sogar negative Effekte auf die Calciumhomöostase, wie z.b. eine Hemmung der PTH-Sekretion sowie der 1,25-(OH) 2 D 3 -Produktion (LITTLEDIKE & HORST 1982; HORST et al. 1997b; GOFF 2008). Aufgrund der genannten Nachteile des Vitamin D wurde in der Vergangenheit versucht, die hydroxylierten Vitamin D-Metabolite, 25-OHD 3 oder 1,25-(OH) 2 D 3, die eine geringere Halbwertszeit und eine geringere Toxizität als Vitamin D aufweisen (HORST et al. 2003), in der Milchfieberprophylaxe zu etablieren. In vielen Studien, wie z.b. in der von HOVE & KRISTIANSEN (1984), konnte dabei ein positiver Effekt auf die Calciumhomöostase festgestellt werden. Allerdings konnten z.b. TAYLOR et al. (2008) beim Einsatz von 25-OHD 3 keinen Effekt auf die Calciumhomöostase der Milchkuh beobachteten, was sie mit einer insuffizienten Umwandlung von 25-OHD 3 zu 1,25-(OH) 2 D 3 begründeten. Bei der Anwendung dieser Metabolite konnte allerdings auch eine Hemmung der 1α-Hydroxylase beobachtet werden (HORST 1986; LITTLEDIKE et al. 1986; HORST et al. 1997b). Des Weiteren besteht dabei ebenfalls die Problematik der termingerechten Applikation (GOFF 2008). Zusätzlich sind sie sehr teuer (HORST et al. 2003). 1.4 Zielsetzung der Arbeit Ziel der vorliegenden Studie war es, zu überprüfen, inwieweit es durch die Kombination zweier bereits etablierter Prophylaxeverfahren, nämlich einer anionenreichen Diät und der oralen Supplementierung mit 25-Hydroxyvitamin D 3, zu einer Beeinflussung der Calciumhomöostase der Milchkuh im peripartalen Zeitraum 13
Einleitung kommt. Da durch die, mittels anionenreicher Diät hervorgerufene, kompensierte metabolische Azidose vermutlich die PTH-Sensitivität des Zielgewebes erhöht wird, wäre es zum einen denkbar, dass die Umwandlung des infolge der Applikation in großen Mengen vorliegenden 25-OHD 3 in das wirksamere 1,25-(OH) 2 D 3 verbessert wird. Zum anderen wäre aber auch eine verbesserte Mobilisierung von Calcium aus dem Knochen vorstellbar. Über beide Wege könnte zum Zeitpunkt des erhöhten Bedarfs mehr Calcium zur Verfügung gestellt werden. Zu diesem Zweck wurden vom zehnten Tag a.p. bis zum zehnten Tag p.p. von den Versuchstieren sowohl Blut- als auch Urinproben gewonnen, die nicht nur auf Calcium, sondern auch auf Phosphat und Magnesium sowie 1,25-(OH) 2 D 3 und PTH untersucht wurden. Zusätzlich wurden die Blutproben auf Parameter des Knochenstoffwechsels analysiert. Unter Berücksichtigung dieser Parameter sollte beurteilt werden, ob durch den kombinierten Einsatz beider Konzepte die Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase im peripartalen Zeitraum verbessert wird und somit das Auftreten einer subklinischen Hypocalcämie verhindert werden kann. 14
Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Tiere 2.1.1 Der Betrieb Die vorliegende Studie wurde von Mitte Juni bis Mitte August 2009 in einer Milchviehanlage der Budissa Agrarprodukte GmbH in Kleinbautzen/Preititz (Sachsen) durchgeführt. Dieser Betrieb beherbergt ca. 2070 Milchkühe und 1380 Jungrinder und Färsen der Rasse Holstein-Friesian. Zusätzlich werden auf dem Betrieb ca. 470 weibliche Kälber gehalten, die zur Remontierung verwendet werden. Dabei beträgt die Remontierungsrate ca. 34%. Die Aufstallung der Tiere erfolgt in dem Milchbetrieb in zwei Boxenlaufstallanlagen mit Spaltenboden, in denen weitere Unterteilungen möglich sind. Die Einteilung der Kühe in verschiedene Aufstallungsgruppen erfolgt anhand der Milchleistung, d.h. Tiere mit ähnlicher Milchleistung werden derselben Gruppe zugeordnet, die leistungsorientiert gefüttert wird. Dabei wird zwischen drei Leistungsgruppen unterschieden. Sechs Wochen vor der Abkalbung werden die Tiere trockengestellt und in die Trockenstehergruppe überführt. Ungefähr drei Wochen vor der Geburt erfolgt die Umstallung der Tiere in die Transitgruppe, in der die Tiere eine anionenreiche Fütterung erfahren. Für die Färsen erfolgt diese Umstallung erst am 10. Tag a.p. Zur Abkalbung werden die Tiere in Abkalbeboxen mit Stroheinstreu separiert. Direkt nach der Abkalbung erhalten die Kühe BoviFit (Fa. Sano), das im lauwarmen Wasser gelöst den Tieren angeboten wird. Dabei handelt es sich um ein Ergänzungsfuttermittel, das aus Süßmolkenpulver, Traubenzucker, Leinexpellerfeinmehl, Natriumchlorid und getrockneter Bierhefe besteht. Circa zwölf Stunden nach der Abkalbung erfolgt die Trennung der Kälber von den Müttern, die zu diesem Zeitpunkt auch das erste Mal nach der Geburt gemolken werden. Dabei werden die Tiere für die ersten 24 Stunden in einer Anbindehaltung aufgestallt, wo die Milchgewinnung im Abstand von zwölf Stunden über Eimermelkanlagen erfolgt. Anschließend werden die Tiere in die Kolostralgruppe 15
Material und Methoden überführt, in der sie bis zur Abgabe der Milch an die Molkerei (5. Tag p.p.) verbleiben. In der Folge werden sie, wie erwähnt, je nach Leistung in verschiedene Gruppen eingeteilt. Die Milchgewinnung erfolgt ab der Kolostralgruppe in einem 48er Melkkarussell zweimal täglich in einem gleichmäßigen zeitlichen Abstand. Im Milchjahr Oktober 2008 bis September 2009 lag die durchschnittliche Milchleistung pro Tier bei 8204 kg Milch mit 4,18% Fett und 3,47% Eiweiß. Ab dem 28. Tag p.p. werden Puerperalkontrollen durchgeführt und bereits ab dem 42. Laktationstag erfolgt wenn möglich die erneute Belegung der Tiere durch betriebeigene Besamungstechniker. Das durchschnittliche Erstkalbealter beträgt 24,6 Monate. Der Besamungsindex liegt für Kühe dieses Betriebes bei 2,3 und für Färsen bei 1,7. Die Zwischenkalbezeit beträgt in dem Betrieb im Durchschnitt 415 Tage. Zweimal jährlich und bei Bedarf erfolgt die Klauenpflege der Tiere durch betriebseigene Klauenpfleger. Desweiteren werden im Betrieb Coli- Mutterschutzimpfungen und BHV 1 -Bestandsimpfungen durchgeführt. Die Milchfieberprävalenz liegt bei ca. 4%, von denen wiederum ca. 2% wirklich festliegend sind. 2.1.2 Gruppeneinteilung, Fütterung und Behandlung der Versuchstiere Für den Versuch wurden 60 trockenstehende Milchkühe der Rasse Holstein-Friesian, die alle mit der bevorstehenden Abkalbung mindestens die zweite Laktation erreichen sollten, ab dem errechneten 270. Trächtigkeitstag in Anbindehaltung aufgestallt. Der 270. Trächtigkeitstag entsprach dabei dem errechneten zehnten Tag a.p., da im Betrieb eine durchschnittliche Trächtigkeitsdauer von 280 Tagen vorliegt. Für den Versuch wurden die Anbindeplätze beider Anlagen des Betriebes verwendet. Mit Versuchsbeginn erfolgte eine zufällige Einteilung der Tiere in zwei Fütterungsgruppen à 30 Tieren, die sich in der Mineralfuttergestaltung unterschieden. Beide Fütterungsgruppen wurden mit einem Abstand voneinander aufgestallt, so dass gewährleistet war, dass die Tiere der jeweiligen Gruppe nur das ihnen zugedachte Mineralfutter aufnehmen konnten. Die Fütterung, die zweimal täglich um 10 Uhr und um 15 Uhr durchgeführt wurde, erfolgte über eine computergesteuerte Hochbandfütterung (Fa. Kluge) mit einer 16
Material und Methoden totalen Mischration (TMR). Lediglich das Mineralfutter wurde per Hand vorgelegt und in die TMR eingemischt. Eine Fütterungsgruppe, im Folgenden als DCAD-Gruppe bezeichnet, wurde mit Versuchsbeginn auf ein anionenreiches Mineralfutter (450 g pro Tier und Tag, aufgeteilt auf zwei Mahlzeiten) umgestellt, das 50% Magnesiumchlorid und eine geringe Menge Calciumcarbonat enthielt. Ziel war es, für diese Gruppe einen DCAD- Wert von -150 meq kg -1 TS in der Ration zu erreichen. Zur Adaptation wurde am ersten Versuchstag nur die Hälfte des Mineralfutters gefüttert. Die Fütterung dieses Mineralfutters erfolgte bis zur Abkalbung. Die andere Fütterungsgruppe, im Folgenden als Kontrollgruppe bezeichnet, erhielt ab Beginn des Versuchs bis zur Geburt ein normales Trockenstehermineralfutter (150 g pro Tier und Tag, aufgeteilt auf zwei Mahlzeiten), um einen Ziel-DCAD-Wert von +150 meq kg -1 TS in der Ration zu erreichen. In Tabelle 2.1 sind die Mittelwerte der im Verlauf des Versuchs in zweitägigen Abstand genommenen Futterproben des Grundfutters a.p., differenziert nach der jeweiligen Anlage aufgeführt. In Tabelle 2.2 sind die Ergebnisse der Mineralstoffanalyse der beiden Mineralfutter dargestellt. Die aus den Analysen des Grundfutters und der beiden Mineralfutter kalkulierten Mineralstoffzusammensetzungen der kompletten Rationen a.p. in Anlage 1 und 2 werden in Tabelle 2.3 und 2.4 gezeigt. Die Zusammensetzung und die Inhaltsstoffe der Rationen wurden von der Landwirtschaftlichen Kommunikations- und Servicegesellschaft (LKS) mbh mithilfe der Weender Anlayse und einer standardisierten Mineralstoffanalyse ermittelt. Die Kalkulation des DCAD erfolgte anhand der folgenden Formel (1.3.3): DCAD (meq kg -1 TS) = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 4 2- ) Nach der Abkalbung erhielten alle Kühe ein einheitliches Futter als TMR, das auf sechs Mahlzeiten pro Tag verteilt wurde (3x tagsüber, 3x nachts). Stichprobenartig wurde eine Futterprobe aus der Kolostrumgruppe (Anlage 1) gewonnen und analysiert. Die dazugehörigen Daten sind ebenfalls in Tabelle 2.1 aufgeführt. 17
Material und Methoden Die Trinkwasserversorgung erfolgte ad libitum über Selbsttränkebecken. Tab. 2.1: Rationszusammensetzung: Ergebnisse der Weender Analyse und der Mineralstoffanalyse (Mittelwerte) des Futters a.p. für beide Anlagen sowie des Futters p.p. (Anlage 1). Dietary-Cation-Anion-Difference berechnet als DCAD [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 4 2- ) Komponenten TMR a.p. TMR a.p. TMR p.p. der Ration Anlage 1 Anlage 2 Anlage 1 TS (g kg -1 FM) 392 383 386 XA (g kg -1 TS) 87 80 84 XP (g kg -1 TS) 142 149 157 XF (g kg -1 TS) 235 221 196 XL (g kg -1 TS) 37 40 33 XX (g kg -1 TS) 500 511 530 XZ (g kg -1 TS) 21 23 42 XS (g kg -1 TS) 96 123 143 MJ ME 10,4 10,7 11,0 MJ NEL 6,2 6,4 6,7 nxp (g kg -1 TS) 146 151 148 UDP (%) 30 29 25 SP (%) 39 38 43,5 NDF (g kg -1 TS) 486 472 414 ADF (g kg -1 TS) 267 254 231 ADL (g kg -1 TS) 38 37 32 NFC (g kg -1 TS) 285 295 340 K (g kg -1 TS) 16 14,8 16,3 Ca (g kg -1 TS) 6 6 10,0 P (g kg -1 TS) 4 4 5,0 Na (g kg -1 TS) 1,3 1,2 2,7 Mg (g kg -1 TS) 2,8 2,6 3,6 Cl (g kg -1 TS) 6 5,1 5,8 S (g kg -1 TS) 2 2,3 2,64 DCAD (meq kg -1 TS) 155 141 209 18
Material und Methoden Tab. 2.2: Ergebnisse der Mineralstoffanalyse beider Mineralfutter. Dietary-Cation- Anion-Difference berechnet als DCAD [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 4 2- ) Komponenten des Mineralfutters anionenreiches Mineralfutter Trockensteher- Mineralfutter K (g kg -1 TS) 3,4 6,2 Ca (g kg -1 TS) 63,1 99,2 P (g kg -1 TS) 3,8 7,2 Na (g kg -1 TS) 22,9 65 Mg (g kg -1 TS) 66,3 9,6 Cl (g kg -1 TS) 241 98,2 S (g kg -1 TS) 2 2,7 DCAD (meq kg -1 TS) -5838 49 Tab. 2.3: Ergebnisse der anhand der Mineralstoffanalyse der Grundfutterration und der beiden Mineralfutter kalkulierten Mineralstoffkonzentrationen der kompletten Futterration a.p. in Anlage 1. Dietary-Cation- Anion-Difference berechnet als DCAD [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 4 2- ) Komponenten der kompletten Ration in Anlage 1 TMR+ anionenreiches Mineralfutter TMR+Trockensteher- Mineralfutter K (g kg -1 TS) 15,6 16,1 Ca (g kg -1 TS) 8,9 7,8 P (g kg -1 TS) 4,0 4,0 Na (g kg -1 TS) 2,2 2,5 Mg (g kg -1 TS) 6,4 2,9 Cl (g kg -1 TS) 18,2 7,6 S (g kg -1 TS) 2,4 2,5 DCAD (meq kg -1 TS) -191 160 19
Material und Methoden Tab. 2.4: Ergebnisse der anhand der Mineralstoffanalyse der Grundfutterration und der beiden Mineralfutter kalkulierten Mineralstoffkonzentrationen der kompletten Futterration a.p. in Anlage 2. Dietary-Cation- Anion-Difference berechnet als DCAD [meq kg -1 TS] = (Na + + K + ) - (Cl - + SO 4 2- ) Komponenten der kompletten Ration in Anlage 2 TMR+ anionenreiches Mineralfutter TMR+Trockensteher- Mineralfutter K (g kg -1 TS) 14,2 14,6 Ca (g kg -1 TS) 8,7 7,7 P (g kg -1 TS) 4,0 4,1 Na (g kg -1 TS) 2,4 2,4 Mg (g kg -1 TS) 6,0 2,7 Cl (g kg -1 TS) 17,1 6,8 S (g kg -1 TS) 2,3 2,4 DCAD (meq kg -1 TS) -160 139 Jeweils 15 Tiere aus beiden Fütterungsgruppen erhielten zusätzlich täglich um 13 Uhr bis zur Abkalbung 240 mg ROVIMIX -Hy-D 1,25% (DSM Nutritional Products Ltd, Basel, Schweiz) oral appliziert (DCAD+HyD-Gruppe und Kontrolle+HyD-Gruppe). Dieses entspricht einer 25-Hydroxyvitamin D 3 -Menge von 3 mg. Für jeden Versuchstag wurden die benötigten Einzeldosen frisch in jeweils ca. 10 ml Rapsöl gelöst und in eine 10 ml Spritze gefüllt. Aus dieser weiteren Unterteilung der Gruppen ergaben sich für den Versuch insgesamt vier Gruppen mit jeweils 15 Tieren, alle mit ähnlichem Laktationsdurchschnitt. Die Einteilung der Gruppen ist zur Übersicht in Tabelle 2.5 dargestellt. 20
Material und Methoden Tab. 2.5: Gruppeneinteilung Versuchsgruppe Mineralfutter/Tier/Tag DCAB 25-OHD 3 DCAD+HyD 450 g Mineralfutter mit MgCl 2 und CaCO 3-150 meq kg -1 TS 3 mg DCAD 450 g Mineralfutter mit MgCl 2 und CaCO 3-150 meq kg -1 TS - Kontrolle+HyD 150 g Mineralfutter für Trockensteher +150 meq kg -1 TS 3 mg Kontrolle 150 g Mineralfutter für Trockensteher +150 meq kg -1 TS - 2.1.3 Kontrolle der Futteraufnahme Während des Versuchs wurde täglich bis zur Geburt vor jeder ersten Fütterung des Tages das Restfutter aus dem Trog entfernt und die Menge je Fütterungsgruppe kalkuliert. Aus der Restfuttermenge und der zusätzlich notierten Futtermenge je Tier und Tag, die dem Fütterungscomputer entnommen wurde, konnte die Futteraufnahme pro Tier und Gruppe bestimmt werden. Zusätzlich wurden während des Versuchs stichprobenartig an Einzeltieren Futtereinwaagen und -rückwaagen durchgeführt, um die Angaben des Fütterungscomputers zu überprüfen. Aus den erhobenen Daten wurde von der LKS die Futteraufnahme in Trockensubstanz pro Tier und Tag je Gruppe kalkuliert. 2.1.4 Bestimmung des Körpergewichts und des Body-Condition-Scores Am zehnten Tag vor dem errechneten Geburtstermin, gleichbedeutend mit dem ersten Versuchstag, sowie am Tag der Abkalbung wurde das Körpergewicht der Versuchstiere mithilfe eines Maßbandes (ANImeter, Fa. Wahl, Dietmannsried), mit welchem durch Messung des Brustumfangs auf das Körpergewicht geschlossen werden konnte, bestimmt. Die Schätzung des Gewichts anhand des vermessenen Brustumfangs ist möglich, da die Funktion zwischen der Körpermasse und dem 21
Material und Methoden Brustumfang ein Bestimmtheitsmaß von r 2 > 0,95 aufweist (KERTZ et al. 1987; HEINRICHS et al. 1992; WILSON et al. 1997). Neben den Gewichten der Versuchstiere wurde zusätzlich zu Versuchsbeginn der BCS der Tiere nach dem von EDMONSON et al. (1989) beschriebenen System, das durch METZNER et al. (1993) übersetzt und modifiziert wurde, bestimmt. Die ermittelten Körpergewichte und BCS sind als Mittelwerte für die Gruppen in Tabelle 2.6 dargestellt. Tab. 2.6: Darstellung der Körpergewicht der Versuchstiere a.p. und p.p. und des BCS a.p. (Mw ± SEM); n = Anzahl der Tiere DCAD+HyD DCAD Kontrolle+HyD Kontrolle Körpergewicht a.p. in kg 728,7 ± 19,5 (n = 15) 709,2 ± 27,1 (n = 15) 700,7 ± 11,4 (n = 15) 744,1 ± 18,4 (n = 15) Körpergewicht p.p. in kg 660,0 ± 17,98 (n = 14) 660,0 ± 24,8 (n = 14) 640,6 ± 13,4 (n = 14) 680,2 ± 13,6 (n = 15) BCS a.p. 3,4 ± 0,1 (n = 15) 3,3 ± 0,1 (n = 15) 3,3 ± 0,1 (n = 15) 3,4 ± 0,1 (n = 15) 2.1.5 Gesundheitszustand der Versuchstiere Über die gesamte Versuchsdauer sowie die ersten drei Wochen p.p. wurden die verschiedenen Erkrankungen der Versuchstiere sowie deren Behandlung erfasst. Die Diagnosestellung erfolgte dabei durch die betriebseigenen Tierärzte. In Tabelle 2.7 ist die Häufigkeit des Auftretens von als behandlungsbedürftig eingeschätzen Hypocalcämien, Nachgeburtsverhaltungen und Mastitiden getrennt nach den vier Versuchsgruppen dargestellt. 22
Material und Methoden Tab. 2.7: Häufigkeit verschiedener Erkrankungen je Versuchsgruppe vom 270. Trächtigkeitstag bis einschließlich der dritten Woche p.p. DCAD+HyD DCAD Kontrolle+HyD Kontrolle Hypocalcämie 2 0 1 0 Nachgeburtsverhaltung 0 2 2 0 Mastitis 7 7 4 5 2.1.6 Geburtsverlauf Während des Versuchs wurde der Verlauf der Abkalbung erfasst. Dabei wurde zwischen leichten und schweren Geburten unterschieden. Als leichte Geburt wurden Abkalbungen erfasst, die spontan oder nur mit leichter Zughilfe seitens des Personals der Milchviehbetriebes erfolgten, d.h. durch maximal manuelle Hilfe, die weniger als 10 Minuten dauerte. Als schwere Geburt wurden manuelle Geburtshilfe, die länger als 10 Minuten dauerte, sowie Kälberentwicklung mittels Geburtshelfer und Kaiserschnitt definiert. Die prozentuale Verteilung von leichten und schweren Geburten ist in der Abbildung 2.1 dargestellt. 23
[%] Material und Methoden Geburtsverlauf 100 80 (11) (12) (11) (12) leichte Geburt schwere Geburt 60 40 20 (3) (2) (2) (3) 0 DCAD + HyD DCAD Kontrolle + HyD Kontrolle Abb. 2.1: Prozentuale Verteilung der Geburten in leichte und schwere Geburtshilfe; Anzahl der Tiere in Klammern 2.2 Probenentnahme 2.2.1 Urinproben Am errechneten fünften Tag a.p. (sechster Behandlungstag) und am sechsten Tag p.p. wurden Urinproben gewonnen. Dabei handelte es sich in der Regel um Spontanharn, in Ausnahmefällen wurden die Proben mithilfe eines Katheters entnommen. Mindestens 50 ml Urin wurden in ein mit Bronopol versetztes Probengefäß gefüllt und im Kühlschrank bis zur Versendung an die LKS aufbewahrt. Ein Aliquot des gewonnenen Urins wurde in 1,5 ml-tube ohne Konservierungsmittel (PLASTIBRAND, Micro Tubes, Fa. BRAND) bei -18 C für die spätere Kreatininbestimmung eingefroren. 2.2.2 Blutproben Ab dem 270. Trächtigkeitstag bis zum zehnten Tag p.p. wurden im Abstand von zwei Tagen Blutproben aus der Schwanzvene (V. coccygia), in der Regel zwischen 5 und 8 Uhr morgens, genommen. Dabei wurde darauf geachtet, dass die allererste Blutprobe (am 270. Trächtigkeitstag) vor der ersten Fütterung und der ersten oralen HyD-Behandlung erfolgte. Um die Abkalbung sollte die Blutentnahme in kürzeren 24
Material und Methoden Intervallen erfolgen, nämlich direkt nach der Geburt, sechs, zwölf und 24 Stunden p.p. Aus Gründen der Praktikabilität wurden diese Proben nicht immer genau zur Geburt, sondern in einem Sechs-Stunden-Rhythmus genommen, nämlich um 5, 11, 17 und 23 Uhr eines jeden Tages. Kalbte z.b. eine Kuh nachts um 3 Uhr, so wurde die Blutprobe zur Geburt erst um 5 Uhr gewonnen. Die 6 h-p.p.-probe wurde dann um 11 Uhr, die 12 h-p.p.-probe um 17 Uhr und die 24 h-p.p.-probe um 5 Uhr des nächsten Tages genommen. Ab dem zweiten Tag p.p. wurden die Tiere dann wieder in den normalen Zweitagerhythmus der Blutentnahme eingereiht, wobei die Probenentnahme nach dem ersten Melken des Tages erfolgte. In Abbildung 2.2 sind die Blutentnahmezeitpunkte veranschaulicht. Geburt -10-6 -2 12h 2 6 10-8 -4 6h 1 4 8 Abb. 2.2: Zeitliche Darstellung der Blutprobenentnahme Da nicht jedes Tier termingerecht abkalbte und die Blutproben a.p. im Zwei-Tage- Rhythmus genommen wurden, wurden diese Blutproben im Anschluss an den Versuch entsprechend zugeordnet, so dass der Zeitpunkt Tag -2 in den folgenden Grafiken und statistischen Analysen Proben vom zweiten Tag und vom ersten Tag a.p. je nach Tier und Abkalbedatum beinhaltet. Dem entsprechend umfasst Tag -4 Proben vom vierten und vom dritten Tag a.p. Gleiches gilt für die anderen Blutentnahme Zeitpunkte a.p. Für die Blutentnahme wurde je eine Einmalkanüle der Größe 1.2 x 40 mm (Sterican, Fa. B.Braun Melsungen AG), eine Lithium-Heparin-Monovette (9 ml LH, Fa. Sarstedt) und eine EDTA-Monovette (9 ml K3E, Fa. Sarstedt) verwendet. Nach einer Zentrifugation für 10 Minuten bei 5500 rpm (MLW, Janetzki T30) wurde das 25
Material und Methoden Plasma der Lithium-Heparin-Monovette auf sieben 1,5 ml-tubes (PLASTIBRAND, Micro Tubes, Fa. BRAND), das Plasma der EDTA-Monovetten auf jeweils drei 1,5 ml-tubes (PLASTIBRAND, Micro Tubes, Fa. BRAND) verteilt und bei -18 C eingefroren. 2.2.3 Milchproben Von den ersten drei Melkzeiten wurden Milchproben vom Gesamtgemelk gewonnen und in drei 1,5 ml-tubes (PLASTIBRAND, Micro Tubes, Fa. BRAND) pro Gemelk bei -18 C eingefroren. 2.3 Analytische Methoden 2.3.1 Analyse der Urinproben Nach der Uringewinnung wurde unverzüglich im Frischharn eine ph-wert- Bestimmung mithilfe einer ph-elektrode und eines ph-meters (Fa. Jürgens; Messelektrode: Inlab, Mettler Toledo, Typ Inlab Routine) durchgeführt. In den mit Bronopol versetzten Urinproben erfolgte bei der LKS anschließend mittels ICP-OES (optischer ICP-Emissionsspektrometrie) die Bestimmung von Calcium, Phosphor, Kalium, Magnesium und Natrium. Des Weiteren wurde dort der Anteil an Säuren, an Ammonium und an Basen im Urin durch Titrationsmethoden bestimmt. Aus diesen Werten wurden die Netto-Säure-Basen-Ausscheidung (= Basen (Na + + K + + Ca 2+ + Mg 2+ + HCO - 3 ) mmol l -1 ) Säuren (Cl - + SO 2-4 + HPO 2-4 + org. Säuren +NH + 4 ) mmol l -1 ) (nach KUTAS, 1964) sowie der Basen-Säuren-Quotient (= Basen mmol l -1 / (Säuren mmol l -1 + NH + 4 mmol l -1 )) bestimmt. Für die Kreatininbestimmung wurden die bei -18 C eingefrorenen Urinproben über Nacht im Kühlschrank aufgetaut, am nächsten Tag bei 5150 g (Biofuge pico, Heraeus INSTRUMENTS, Jürgens) für zehn Minuten abzentrifugiert und anschließend 1:5 mit Aqua dest. verdünnt. Die Untersuchung auf Kreatinin wurde mittels eines standardisierten Analyseverfahrens im Klinischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. 26
Material und Methoden 2.3.2 Analyse der Blutproben 2.3.2.1 ph-wert und ionisiertes Calcium im Vollblut Direkt nach der Blutentnahme wurden lithiumheparinisierte Vollblutproben mit einem Blutgasanalysegerät (Chiron Diagnostics, RapidLab TM 348) auf den Gehalt an ionisiertem Calcium unter Berücksichtigung des Blut-pH-Wertes untersucht. Das Blutgasanalysegerät wurde täglich automatisch mithilfe einer Zwei-Punkt- Kalibrierung unter Verwendung zweier verschiedener Puffer geeicht. 2.3.2.2 Calcium, Phosphat und Magnesium im Plasma Gesamtcalcium, Phosphat und Magnesium wurden nach Versuchsende im lithiumheparinisierten Plasma vom Klinischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mittels standardisierter Analyseverfahren bestimmt (photometrischer Farbtest unter Verwendung von Methylthymolblau, photometrischer Farbtest unter Verwendung von Molybdat, photometrischer Farbtest mit Xylidylblau). Zur Vorbereitung wurden die Proben über Nacht im Kühlschrank aufgetaut und anschließend bei 990 g für zehn Minuten (Biofuge pico, Heraeus INSTRUMENTS, Jürgens) zentrifugiert. 2.3.2.3 25-Hydroxyvitamin D 3 und 1,25-Dihydroxyvitamin D 3 Lithiumheparinisierte Plasmaproben wurden im Analytical Research Center der Firma DSM Nutritional Products in Kaiseraugst (Schweiz) mithilfe einer High- Pressure-Liquid-Chromatography-Massenspektrometrie (LAURIDSEN et al. 2010) auf den Gehalt an 25-Hydroxyvitamin D 3 untersucht. Die Bestimmung der 1,25-Dihydroxyvitamin D 3 -Konzentration in lithiumheparinisierten Plasmaproben erfolgte bei IDEXX Laboratories Inc., Diavet Labor AG in Bäch (Schweiz) mittels eines standardisierten Radioimmunoassays. 27
Material und Methoden 2.3.2.4 Parathormon Von je sieben Tieren der Kontrollfütterungsgruppen sowie von je neun Tieren der DCAD-Fütterungsgruppen wurden EDTA-Plasmaproben ausgewählter Zeitpunkte (Proben vom 270. Trächtigkeitstag, von Tag -2, zwölf Stunden p.p., 24 Stunden p.p. und 48 Stunden p.p.) mittels eines speziell zum Nachweis von bovinen PTH entwickelten und kommerziell erhältlichen ELISA (Bovine Interact PTH ELISA Kit, Immunotopics, Inc.) auf die Parathormonkonzentration untersucht. Die diesem so genannten Sandwich-ELISA zugrundeliegenden Reaktionen sind in Abbildung 2.3 dargestellt. Abb. 2.3: Reaktionsprinzip des Sandwich-ELISA Die Plasmaproben wurden über Nacht im Kühlschrank aufgetaut und anschließend für zehn Minuten bei 990 g (Biofuge pico, Heraeus INSTRUMENTS, Jürgens) zentrifugiert. Nachdem die für den Versuch benötigten Reagenzien und eine Mikrotiterplatte, deren Oberfläche mit Streptavidin versehen war, nach Herstellerangaben vorbereitet und auf Raumtemperatur gebracht worden waren, wurden jeweils im Doppelansatz 50 μl der Standards, der Kontrollen und der Proben in die Wells überführt. Anschließend wurden 50 μl der Antikörperlösung, die zu gleichen Anteilen aus einem mit Biotin markierten Antikörper gegen bovines PTH und einem mit Meerrettichperoxidase konjugierten Antikörper gegen bovines PTH bestand, hinzugefügt. Im Anschluss daran erfolgte unter Lichtausschluss eine dreistündige Inkubation bei 300 rpm auf einem Horizontalschüttler (Thermomixer comfort 1,5, Fa. Eppendorf). Während dieser Inkubationsphase band der mit Biotin 28
Material und Methoden konjugierte Antikörper zum einen an die mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte, und zum anderen an das in der Plasmaprobe enthaltene bovine PTH. Des Weiteren band auch der mit der Meerrettichperoxidase konjugierte Antikörper an das in der Probe enthaltende bovine PTH. Nach dieser Inkubation erfolgten fünf Waschschritte (HydroFlex TM, Fa. TECAN) mit jeweils 350 μl der angesetzten Waschlösung, bestehend aus 20 ml Waschkonzentrat und 380 ml destillierten Wasser, in deren Anschluss der Überstand entfernt wurde. Im nächsten Schritt wurden 100 μl des Meerrettichperoxidasesubstrats Tetramethylbenzidin in die Wells pipettiert und zur Inkubation abgedeckt bei 300 rpm auf den Schüttler (Thermomixer comfort 1,5, Fa. Eppendorf) gestellt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl einer Stopplösung beendet und es erfolgte die Messung der durch den, mit einer Farbentwicklung assoziierten, Substratumsatz direkt beeinflussten Absorption mit einem Photometer (NanoQuant infinite M200, Fa. TECAN) bei 450 nm gegen den 0 pg ml -1 Standard, der als Leerwert verwendet wurde. Durch Einsatz der im Doppelansatz gemessenen Absorptionen in die sich aus der Standardreihe ergebene Gleichung konnten die PTH-Konzentrationen berechnet werden. 2.3.2.5 Knochenmarker 2.3.2.5.1 Knochenresorptionsmarker CrossLaps Lithiumheparinisierte Plasmaproben von sieben Tieren pro Gruppe wurden auf den spezifischen Knochenmobilisationssmarker CrossLaps untersucht. Für die Analyse wurden Proben bestimmter Zeitpunkte, vom 270.Trächtigkeitstag, von Tag -2, sechs Stunden p.p. (nur fünf Tiere pro Gruppe), zwölf Stunden p.p., 24 Stunden p.p. und 48 Stunden p.p. ausgewählt. Für die Bestimmung des Knochenmobilisationsmarkers CrossLaps wurde ein kommerziell erhältlicher ELISA verwendet (Serum CrossLaps ELISA, immunodiagnosticsystems (ids)), für den vom Hersteller eine Kreuzreaktivität für das Rind angegeben wird und der bereits bei HOLTENIUS & EKELUND (2005) Anwendung fand. Das Testprinzip ähnelt dem des PTH-ELISAs (2.3.2.4). 29
Material und Methoden Der Serum-CrossLaps -ELISA basiert auf zwei hochspezifischen monoklonalen Antikörpern gegen eine im C-terminalen Telopeptid des Kollagen-Typ-1 enthaltende Aminosäurensequenz des EKAHD-β-GGR, in der der Aspartatsäurerest (D) β-isomerisiert ist. Um ein spezifisches Signal in dem Serum-CrossLaps -ELISA messen zu können, müssen zwei Ketten des EKAHD-β-GGR kreuzvernetzt werden. Zur Vorbereitung der Untersuchung wurden die lithiumheparinisierten Plasmaproben der ausgewählten Zeitpunkte über Nacht im Kühlschrank aufgetaut und anschließend für zehn Minuten bei 990 g (Biofuge pico, Heraeus INSTRUMENTS, Jürgens) zentrifugiert. Nach der Vorbereitung der Antikörperlösung und des Waschpuffers gemäß den Herstellerangaben, wurden 50 μl der Standards, der Kontrollen und der zu analysierenden Proben in die dafür vorgesehenen, mit Streptavidin beschichteten Wells pipettiert. Dabei wurden zwei Wells mit jeweils derselben Probe belegt. Anschließend wurden 150 μl der Antikörperlösung, bestehend aus biotinylierten Antikörper, Peroxidase-konjugierten Antikörper sowie Inkubationspuffer, hinzu pipettiert. Die Immunostrips wurden mit Klebestreifen bedeckt und für 120 Minuten bei 18-20 C auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler (Thermomixer comfort 1,5, Fa. eppendorf) bei 300 rpm inkubiert. Der sich bildende Komplex aus CrossLaps- Antigen, biotinylierten und Peroxidase-konjugierten Antikörper wird aufgrund der hohen Affinität des Biotins zum Streptavidin an der Oberfläche der Mikrotiterplatte gebunden. Nach der Inkubation erfolgten fünf Waschzyklen mit jeweils 300 μl Waschpuffer. Anschließend wurden 100 μl der Substratlösung, gebrauchsfertiges Tetramethylbenzidin-Substrat, in jedes Well pipettiert und für 15 Minuten bei 18-20 C unter Lichtausschluss auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler (Thermomixer comfort 1,5, Fa. Eppendorf) bei 300 rpm inkubiert. Um die Farbreaktion zu stoppen, wurden 100 μl der Stopplösung, gebrauchsfertige 0,18 mol l -1 Schwefelsäure, hinzu pipettiert. Im Anschluss erfolgte die Messung der Absorption mittels Photometer (NanoQuant infinite M200, TECAN) bei 450 nm mit 650 nm als Referenz. Zur Auswertung der Plasmakonzentrationen wurde mittels der Standardreihe eine Standardkurve mit dazugehöriger Gleichung ermittelt, mit deren Hilfe durch 30
Material und Methoden Einsetzen der gemessenen Extinktion, bzw. deren Mittelwert aus dem Doppelansatz, die Kalkulation der Plasmakonzentrationen erfolgen konnte. 2.3.2.5.2 Knochenformationsmarker Osteocalcin EDTA - Plasmaproben von sieben Tieren pro Gruppe wurden auf den Gehalt an Osteocalcin, einem Knochenformationsmarker, untersucht. Zur Analyse wurden nur Proben ausgewählter Zeitpunkte herangezogen, nämlich Proben vom 270. Trächtigkeitstag, von Tag -2, zwölf Stunden p.p., 24 Stunden p.p. und 48 Stunden p.p. Für die Bestimmung der Osteocalcinkonzentration wurde ein kommerziell erhältlicher kompetitiver ELISA, für den vom Hersteller eine 100%-ige Kreuzreaktivität für das Rind angegeben wird, verwendet (MICROVUE TM Bone Health, Osteocalcin EIA Kit). Das ihm zugrundeliegende Testprinzip ist in Abbildung 2.4 dargestellt. Die ausgewählten Proben wurden über Nacht im Kühlschrank aufgetaut und anschließend bei 990 g (Biofuge pico, Heraeus INSTRUMENTS, Jürgens) abzentrifugiert. Der Waschpuffer, die Standardlösungen und die Kontrollen wurden gemäß den Herstellerangaben vorbereitet. Anschließend wurden im Doppelansatz jeweils 25 μl der Standardlösungen, der Kontrollen und der Proben in die mit Osteocalcin beschichteten Wells pipettiert. Nach Zugabe von 125 μl der Antikörperlösung, die einen monoklonalen, gegen Osteocalcin gerichteten Antikörper aus der Maus enthält, erfolgte eine zweistündige Inkubation bei 20-25 C. In dieser Zeit konkurrierte das an der Mikrotiterplatte fixierte Osteocalcin mit dem Osteocalcin aus der Plasmaprobe um die Bindungsstellen des Antikörpers (Anti-Osteocalcin). Nach der Inkubation erfolgten drei Waschzyklen mit jeweils 300 μl des Waschpuffers je Well und anschließender vollständiger Leerung. Dadurch wurden die Komplexe aus Probenosteocalcin und Antikörper entfernt. Anschließend wurden 150 μl einer Enzymkonjugatlösung, die einen mit Alkalischer Phosphatase konjugierten, gegen Maus-IgG gerichteten Antikörper aus der Ziege enthält, in die Vertiefungen pipettiert und die Mikrotiterplatte 60 Minuten bei 20-25 C inkubiert. Während dieser Inkubation erfolgte die Bindung des Enzym-markierten Antikörpers aus der Ziege an den gegen Osteocalcin gerichteten Antikörper aus der 31
Material und Methoden Maus, der im ersten Schritt an das Osteocalcin auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte gebunden hatte. Im Anschluss an den zweiten Inkubationsschritt wurde ein erneuter Waschschritt mit drei Waschzyklen durchgeführt. Dieser erfolgte wieder mit je 300 μl je Well und darauffolgender Leerung. Danach wurden je 150 μl der Substratlösung (p-nitrophenylphosphat) in die Wells pipettiert und für 35-40 Minuten bei 20-25 C inkubiert. Bevor nach dieser dritten Inkubation die Extinktion bei 405 nm mittels Photometer (NanoQuant infinite M200, TECAN) gemessen werden konnte, wurden je 50 μl der Stopplösung (0,5 M NaOH) hinzupipettiert. Abb. 2.4: Reaktionsprinzip des kompetitiven ELISA 32