Mikrobiologie-Praktikum Versuch Nr. 4: Membranfiltration Inhalt 1. Aufgabe S. 2 2. Nährbodenherstellung S. 2 2.1 Rezepturen S. 2 2.2 Durchführung S. 3 3. Beimpfung S. 3 3.1 HNB- und MacConkey-Agar-Platten S. 3 3.1.1 Durchführung S. 4 3.1.2 Aufbau der Filtrationsanlage S. 4 3.2 HNB-Flüssigagar S. 4 3.2.1 Durchführung S. 4 4. Bebrütung S. 4 5. Auswertung S. 5 5.1 MacConkey-Agar Ergebnis S. 6 5.2 HNB-Agar Ergebnis, 37 C S. 6 5.3 HNB-Flüssigagar Ergebnis, 37 C S. 6 5.4 HNB-Flüssigagar Ergebnis, RT S. 6 5.5 HNB-Agar Ergebnis, RT S. 6 6. Diskussion S. 7
1. Aufgabe In diesem Versuch sollen Mikroorganismen aus Wasser angereichert, bebrütet und ausgezählt werden. Hierzu wird die Probe durch einen Membranfilter aus Celluloseacetat filtriert. Dieser besitzt Poren in der Größe von 0,45µm und ist durch Linien in 100 Quadrate eingeteilt, was die Auszählung erleichtert. Die Bebrütung findet auf MacConkey- HNB- und HNB-Flüssig- Agar statt. Nach der Bebrütungszeit von 24 Stunden werden die Gesamtkeimzahlen auf den verschiedenen Platten miteinander verglichen, die Ergebnisse begründet und Einzelkolonien beschrieben. Mit diesem Verfahren lassen sich, durch das Einsetzen größerer Mengen von Versuchsflüssigkeiten, z.b. Spureninfektionen in Herstellungsprozessen erfassen. Aus diesem Grund ist dieses Verfahren in der Industrie weit verbreitet. 2. Nährbödenherstellung 2.1 Rezepturen Bestandteile: HNB-Agar (Komplexmedium zur Anzucht von Bakterien) Zusamensetzung pro 1 Liter Leitungswasser - 3g Fleischextrakt - 5g Pepton aus Fleisch - 5g Hefeextrakt - 5g reines Natriumchlorid - 15g Agar (ph: 7,2) Bestandteile: MacConkey-Agar (Selektivagar zur Isolierung von Enterobacteriacen) Zusammensetzung pro 1 Liter destilliertes Wasser - 17g Pepton aus Casein - 3g Pepton aus Fleisch - 5g reines Natriumchlorid - 10g Lactose - 1,5g Gallesalzmischung - 0,03g Neutralrot - 0,001g Kristallviolett - 13,5g Agar Bestandteile: Saline Zusammensetzung pro 1 Liter destilliertes Wasser - 5g reines Natriumchlorid - 0,12g MgSO 4. 7H 2 O 2
2.2 Durchführung Alle Bestandteile bis auf das Agarpulver werden in einen Erlenmeyerkolben eingewogen und in der Hälfte der erforderlichen Wassermenge gelöst. Durch gründliches Schütteln und mit Hilfe eines Magnetrührers wird die Lösung homogenisiert. Das Agarpulver wird in 500mL Meplatflaschen vorgelegt und die Lösung sowie das restliche Wasser unter Rühren hinzugefügt. Der ph-wert des MacConkey-Agars wird mit Hilfe eines ph-meters überprüft und wenn nötig mit HCl oder NaOH eingestellt. Anschließend wird der Agar bei 121 C 20 Minuten autoklaviert. Um steriles Arbeiten zu ermöglichen, wird der MacConkey- und der HNB-Agar unter der Clean-Bench in Petrischalen zu Nährböden gegossen. Beim Gießen ist darauf zu achten, dass eine luftblasenfreie ca. 5mm starke Schicht entsteht. Die Arbeitstemperatur sollte 50 C betragen, da sich der Agar ab 40 C verfestigt. Die abgekühlten Nährböden werden kopfüber im Kühlschrank bis zur Beimpfung gelagert. Der HNB-Flüssigagar wird zusammen mit der zu untersuchenden Wasserprobe zu einer Platte gegossen. Dies geschieht ebenfalls unter der Clean-Bench. 3. Beimpfung 3.1 HNB- und MacConkey-Agar-Platten Folgende Wasserproben wurden filtriert: - Teichwasser - Schillerquelle - Wohnheim-Leitungswasser - Aldi Sprudel - Hirschquelle - Silberbrunnen - Destilliertes Wasser 3.1.1 Durchführung Es werden drei mal 100mL der Wasserprobe durch je einen Membranfilter filtriert. Hierzu wird zuerst die Vakuumpumpe eingeschaltet und der Trichter sowie die Fritte mit sterilisiertem, deionisiertem Wasser gespült. Anschließend wird, bei geöffnetem Hahn, die Fritte mit einem ethanolgetränkten Tuch betupft, danach der Hahn geschlossen und die Fritte abgeflammt. Trichter und Fritte werden nun mit der Bunsenbrenner erwärmt und aufeinander gesetzt. Zur Abkühlung wird dann der Trichter mit sterilem Wasser gefüllt und mit dem ebenfalls erwärmten Deckel geschlossen. Das Wasser wird aus dem erkalteten Trichter abgelassen und ein Membranfilter mit einer abgeflammten Pinzette aufgesetzt. Nun kann die Wasserprobe, durch zwei Arbeitschritte, mit einer sterilisierten 50mL Vollpipette in den Trichter gegeben werden. 3
Ist die gesamte Menge durch den Filter gelaufen, kann die Wasserstrahlpumpe abgeschaltet und der Filter mit einer abgeflammten Pinzette abgenommen werden. Je ein Filterpapier wird in die Mitte auf die beiden HNB-Platten und die MacConkey-Platte gelegt. 3.1.2 Aufbau der Filtrationsanlage Unter einem Edelstahltrichter und somit über einer Sintermetallfritte befindet sich der Membranfilter. Die Fritte steckt in einer vakuumfesten Saugflasche, welche an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen ist. 3.2 HNB-Flüssigagar Mit folgenden Wasserproben wurde eine HNB-Platte gegossen: - Schillerquelle - Labor-Leitungswasser - Aldi Sprudel - Hirschquelle - Silberbrunnen 3.2.1 Durchführung: Mit einer Eppendorf-Pipette wird zwei mal ein Milliliter der zu untersuchenden Wasserprobe aus der Flasche entnommen und jeweils in eine Petrischale gegeben. Auf die Probe wird sofort eine etwa 3mm starke Schicht aus frisch autoklaviertem, noch ca. 45-50 C warmem flüssigen HNB-Agar gegossen. Durch Schwenken der Petrischale wird Probe gleichmäßig mit dem Nährmedium vermischt. Nach dem sich die Nährböden verfestigt haben, werden die umgedreht und kopfüber bebrütet. 4. Bebrütung Von jeder Wasserprobe werden jeweils eine HNB-Agar- und HNB-Flüssigagar-Platte, sowie die MacConkey-Agar-Platte im Brutschrank bei 37 C, die anderen HNB-Agar- und HNB- Flüssigagar-Platten bei Raumtemperatur (ca. 22 C) bebrütet. 4
5. Auswertung Um nun, nach einer Bebrütungszeit von 24 Stunden und einer weiteren von drei Tagen, die Wasserkeimzahl zu bestimmen, werden zum jeweiligen Zeitpunkt die Kolonien ausgezählt. Auszählung vom 1. Tag nach Beimpfung (14.11.2003): 37 C Raumtem peratur MacConkey HNB Flüssig-HNB Flüssig-HNB HNB Aldi-Sprudel 0 14 weiß glatt 0 0 0 Destilliertes Wasser 0 40 weiß glatt - - 5 weiß-gelb glatt Hirschquelle 0 139 weiß glatt + Verwuchs um gesamten Filter 3 weiß fusselig 0 64 weiß-gelb glatt Leitungswasser Labor 0-0 0 - Leitungswasser Wohnheim 0 3 weiß glatt - - 1 weiß glatt Schillerquelle 0 15 weiß glatt 0 0 1 weiß- gelb glatt Silberbrunnen 0 36 weiß glatt 7 weiß fusselig 0 0 Teichwasser 0 175 weiß glatt - - weiß-gelber glatter Verwuchs Auszählung vom 4. Tag nach Beimpfung (17.11.2003): 37 C Raumtemperatur MacConkey HNB Flüssig-HNB Flüssig-HNB HNB Aldi-Sprudel 0 weißer und gelber glatter Verwuchs 0 0 16 weiß-gelb glatt Destilliertes Wasser 2 Schimmelkolonien weißer glatter Verwuchs - - Hirschquelle 0 weißer glatter Verwuchs + 3 gelb glatt Leitungswasser Labor Leitungswasser Wohnheim weiß-glatter Verwuchs 1 gelb glatt weiß-gelber Verwuchs / weiß-pinker Schimmelverwuchs weiß-gelber glatter Verwuchs / 15 gelb glatt - - 0 2 gelb glatt - 1 weiß-gelb glatt weißer glatter Verwuchs - - Verwuchs (gelb, glatt)/ schwarzer Schimmel Verwuchs/ lachsfarbener Fadenverwuchs Schillerquelle 0 weißer glatter Verwuchs + 2 gelb glatt 1 weiß glatt 0 6 weiß-gelb glatt Silberbrunnen 0 weißer glatter Verwuchs + 2 gelb glatt Teichwasser 264 gelb glatt weißer und gelber glatter Verwuchs + grauer Schimmelverwuchs weiß-glatter Verwuchs 2 weiß glatt 28 weißlich-gelb glatt / 1 leuchtend gelb glatt - - weiß-gelber glatter Verwuchs 5
5.1 MacConkey-Agar Ergebnis Auf dem MacConkey-Agarplatten wuchsen am Tag nach der Beimpfung keine und nach weiteren 3 Tagen nur bei folgenden Proben sehr wenige Kolonien einer Art: destilliertes Wasser, Leitungswasser-Wohnheim und Teichwasser. Es ist anzunehmen, dass die im MacConkey-Agar enthaltenen Nährstoffe nicht für Wasserkeime geeignet sind. 5.2 HNB-Agar Ergebnis, 37 C Auf den im Brutschrank bebrüteten HNB-Agarplatten aller Wasserproben waren bereits am Tag nach der Beimpfung weiße, glatte Kolonien zu finden. Besonders viele befanden sich in der Hirschquelle-Probe und der Teichwasser-Probe. Am vierten Tag nach der Beimpfung waren auf den HNB-Nährböden aller Proben weißer Verwuchs und auf einigen auch gelbe Einzelkulturen zu finden. Da auf diesem Nährboden ein schnelles Wachstum zu erkennen war, ist anzunehmen, dass die darin befindlichen Nährstoffe gut für Wasserkeime geeignet sind. 5.3 HNB-Flüssigagar Ergebnis, 37 C Auf den im Brutschrank bebrüteten HNB-Flüssigagarplatten von der Hirschquelle- und der Silberbrunnen-Probe waren einen Tag nach der Beimpfung weiße, fusselig aussehende Kulturen zu finden. Vier Tage nach Beimpfung befand sich auf diesen beiden Platten ein weißer glatter Verwuchs und auf der Schillerquellen-Platte eine weiße glatte Kolonie. 5.4 HNB-Flüssigagar Ergebnis, RT Am ersten Tag nach der Beimpfung waren auf keiner der Wasserproben-Platten Kolonien zu finden. Am vierten Tag dann einige auf den Platten der Proben Hirschquelle, Leitungswasser- Labor und Silberbrunnen. 5.5 HNB-Agar Ergebnis, RT Am ersten Tag nach der Beimpfung waren auf den Platten der Proben von destilliertem Wasser, Wohnheim-Leitungswasser und Schillerquellequelle wenige Kulturen zu finden. Auf der Platte der Hirschquelle-Probe waren viele Kulturen zu erkennen und auf der Platte der Teichprobe war ein kompletter Verwuchs. Am vierten Tag nach der Beimpfung waren auf den Platten von Aldi-Sprudel, Schillerquelle und Silberbrunnen wenige Kolonien, auf denen von Hirschquelle und Teichwasser starker Verwuchs und auf den Platten von destilliertem Wasser und Wohnheim- Leitungswasser starker Verwuchs und weißlachsfarbener bzw. weiß-pinkfarbener Schimmel. 6
6. Diskussion Von den Sprudelwasserproben war das Aldi-Wasser am wenigsten verkeimt. Auch die Schillerquelle wies nur eine gering Anzahl an Keimen auf. Die Silberbrunnen-Probe war etwas mehr verkeimt. Die mit Abstand stärkste Verkeimung wies eindeutig die Hirschquelle- Probe auf. Bei dieser war auf fast allen Platten schon nach einem Tag starker Bewuchs zu finden. Das Wohnheim-Leitungswasser war sehr stark verkeimt. Schon am ersten Tag nach der Beimpfung waren auf allen HNB-Agarplatten Kolonien und nach vier Tagen auf der bei Raumtemperatur gelagerten Platte sogar Schimmelkulturen zu finden. Das Labor-Leitungswasser wies dagegen erst nach vier Tagen Kolonien auf der bei Raumtemperatur gelagerten HNB-Flüssigagarplatte auf. Mit diesem Wasser wurden jedoch auch nur wenige Nährböden beimpft. Auch die mit destilliertem Wasser und Teichwasser beimpften Nährböden, außer der MacConkey-Agar, wiesen schon einen Tag nach der Beimpfung Kolonien auf. Die Teichwasser-Platten zeigten nach vier Tagen sogar Schimmel. Dass das destillierte Wasser solch schlechte Ergebnisse lieferte könnte daran liegen, dass sich an den Filtermembranen der Anlage für destilliertes Wasser Keime angelagert haben, welche sich bei der Wasserentnahme gelöst haben und somit in Probe gelangen konnten. Denkbar wäre aber auch, dass das destillierte Wasser im Gegensatz zum Leitungswasser nicht gechlort, bzw. entkeimt wird und daher hier mehr Keime wachsen können Die Ergebnisse der Teichwasserprobe entsprechen der Erwartung, da das Wasser trüb und mit Schwebteilchen durchsetzt war. (Daher wurde bei dieser Probe vorher eine zusätzliche Filtration durchgeführt.) Die Ergebnisse der Sprudelwasserproben können aus zwei Gründen so unterschiedlich sein. Zum einen könnten die verschiedenen Wässer wirklich sehr unterschiedlich verkeimt gewesen sein, zum anderen könnte die Sterilität beim Filtrieren und Beimpfen durch unsaubere Arbeit teilweise nicht gegeben gewesen sein. Wahrscheinlich ist eine Mischung beider Hypothesen. 7