Die Bestimmung der Keimzahl

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1 Themen Keimzahl, Mikroorganismen, Trinkwasseruntersuchung, Prinzip Die Keimzahl ist die Zahl der entwicklungsfähigen Mikroorganismen in einem Milliliter oder Gramm des Untersuchungsmaterials, zum Beispiel Wasser, Boden, Milch, Speiseeis usw. Ihre Bestimmung hat für Trinkwasser-, Boden- und Lebensmitteluntersuchungen große praktische Bedeutung. Eine exakte Keimzahlbestimmung ist nur möglich, wenn alle damit verbundenen Arbeiten so durchgeführt werden, dass eine Verunreinigung des Untersuchungsmaterials durch Fremdkeime ausgeschlossen ist. Material 2 Erlenmeyerkolben DURAN, Enghals Messzylinder 100 ml, BORO Reagenzglas, d = 16 mm, Petrischale, d = 100 mm, Glas Uhrglasschale, d = 60 mm Reagenzglasgestell, 12 Bohrung Becherglas DURAN, hohe Form, Universalschrank UNB 200, 32 l Kompaktwaage, OHAUS TA 302, Mikroskop B1, monokular Tisch-Autoklav mit Einsatz Doppelspatel, Stahl, l = Messpipette 1 ml, Teilung 0, Dreibein, Ring-d = 140 mm, Drahtnetz mit Keramik 160 x Laborschreiber, wasserfest Sicherheits-Gasschlauch, DVGW Bunsenbrenner mit Hahn, Objektträger, 50 Stück Deckgläser 18 mm x 18 mm, 50 St Pipettierball, Flip-Modell, Pi Glasrührstab, Boro Steristopfen für di = 15 mm Steristopfen für di = 29 mm Steilbrustflasche, Enghals Stopfen A NS 19/26 Glas Saugflasche 1000 ml, SB Gummistopfen 41/ Membranfilteraufsatz Membranfilter, d = 50 mm Pinzette, l = 120 mm, gerade Gummischlauch-Vakuum-, Innen-d Wasserstrahlpumpe, Kunststoff Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml Rundfilter, qualitativ, d = Nährkartonscheiben Standard, Heiz- und Kochplatte, 230 V Ethanol absolut, reinst 500 ml Wasser, destilliert 5 l Immersionsöl 50 ml Formaldehyd-Lösung, ca.35%, Methylenblau B,f.Mikrosk. 25 g Glycerin, 99%, 250 ml Liebigs Fleischextrakt, 10 g Pepton aus Fleisch 50 g ph Teststäbchen, ph 6,5-10,0, Natriumhydroxid, Perlen 500 g Agar-Agar, gepulvert 100 g Abb. 1: Membranfilter. P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 Die Bestimmung der Keimzahl Aufgabe: Bestimmen Sie die Keimzahl einer Probe. Ausführung Die sterile Entnahme des Untersuchungsmaterials Die sterile Entnahme einer Probe setzt voraus, dass alle dabei benutzten Arbeitsgeräte steril sind und jede Fremdinfektion während der Entnahme vermieden wird. 96%iges Ethanol Untersuchungsmaterial (Bodenproben, Wasserproben, usw.) Eine Bodenprobe wird steril entnommen, indem man mit einem sterilen Spatel, Löffel oder Spachtel eine ausreichende Bodenmenge in eine im Heißluftsterilisator sterilisierte Weithalsflasche mit Schliffstopfen füllt. Dabei ist sorgfältig darauf zu achten, dass die Flasche und der Stopfen während des Einfüllens an den Innenflächen nicht mit Fremd-keimen verunreinigt werden. Der Spatel, Abb. 2: Abflammen des Spatels. Löffel oder Spachtel wird unmittelbar vorher an der Untersuchungsstelle sterilisiert, indem man ihn etwa eine Minute in 96%iges Ethanol taucht und anschließend durch die Flamme eines Gasbrenners zieht (Abb. 2). Bei der Entnahme mehrerer, verschiedener Bodenproben dürfen keine Keime von einer Probe in die andere verschleppt werden. Die Entnahme anderen, nicht flüssigen Untersuchungsmaterials (z. B. Speiseeis) erfolgt in entsprechender Weise. Zur sterilen Entnahme einer Wasserprobe taucht man eine sterile Weithalsflasche mit Schliffstopfen an der Untersuchungsstelle in das Wasser, entfernt den Stopfen, lässt die gewünschte Wassermenge einlaufen und setzt den Stopfen unter Wasser wieder ein. Anderes flüssiges Untersuchungsmaterial wird entweder mit einer sterilen Pipette in eine sterile Flasche entsprechender Größe mit Schliffstopfen übertragen oder gegebenenfalls auch hinein gegossen. Jede Keimzahlbestimmung ist so schnell wie möglich nach der Entnahme des Untersuchungsmaterials durchzuführen. Das KOCHsche Plattengussverfahren Dieses Verfahren wurde von ROBERT KOCH in die bakteriologische Technik eingeführt. Es ist das älteste und auch heute noch mit am meisten benutzte Verfahren zur Keimzahlbestimmung. Von dem in einem sterilen Gefäß gesammelten Untersuchungsmaterial wird unter sterilen Bedingungen 1 g beziehungsweise 1 ml entnommen und mit 9 ml sterilem destilliertem Wasser vermischt. Handelt es sich dabei um festes Untersuchungsmaterial, zum Beispiel eine Bodenprobe, so wiegt man auf einem in der Flamme eines Gasbrenners abgeflammten, austarierten Uhrglas 1 g davon ab und bringt diese Menge in ein Reagenzglas mit 9 ml sterilem destilliertem Wasser. Der Boden wird dabei mit einem in der Flamme eines Gasbrenners abgeflammten und wieder abgekühlten Metallspatel übertragen. Ist das Untersuchungsmaterial flüssig, zum Beispiel eine Wasserprobe, Milch oder Limonade, so wird mit einer sterilen Messpipette (s. P ) 1 ml in ein Reagenzglas mit 9 ml sterilem destilliertem 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

3 Wasser übertragen. Von dieser Verdünnungsstufe des Untersuchungsmaterials im Verhältnis 1:10 stellt man weitere Verdünnungen jeweils im Verhältnis 1 :10 her, indem man unter sterilen Bedingungen immer jeweils 1 ml aus der zuletzt hergestellten Verdünnung in ein neues Reagenzglas mit 9 ml sterilem destilliertem Wasser überpipettiert (Abb. 3). Bis zu welcher Verdünnungsstufe man die Verdünnungsreihe führt, hängt von der Art des Untersuchungsmaterials ab. Bodenproben mit voraussichtlich hohem Keimgehalt, zum Beispiel Gartenerde, werden bis zur Stufe 1: oder 1 : verdünnt, Sandboden dagegen nur bis zur Stufe 1 :1000 oder 1 : Nachdem das Untersuchungsmaterial in dem erforderlichen Maße verdünnt worden ist, wird der Inhalt von vier Röhrchen mit Standard-Nähragar für Bakterien durch Kochen im Wasserbad verflüssigt und wieder auf 60 C (gut handwarm) abgekühlt. Als Wasserbad eignet sich sehr gut ein Becherglas von 600 mi Inhalt, das etwa zur Hälfte mit Wasser gefüllt ist. Man entfernt den Wattestopfen eines Röhrchens und pipettiert unter sterilen Bedingungen 1 ml aus der vorletzten Verdünnungsstufe des Untersuchungsmaterials in den noch flüssigen Nährboden. Durch Rollen des Röhrchens zwischen den Handflächen wird sein Inhalt gemischt (Abb. 4). Man flammt die Röhrchenmündung in der Flamme eines Gasbrenners ab und gießt den Inhalt in eine sterile Petrischale aus. Ein zweites Röhrchen mit Standard-Nähragar für Bakterien wird mit derselben Verdünnungsstufe, die beiden an-deren Röhrchen werden mit der letzten Verdünnungsstufe des Untersuchungsmaterials in gleicher Weise beimpft und jeweils in eine sterile Petrischale ausgegossen. Man beschriftet die Platten (Art des Untersuchungsmaterials, Verdünnungsstufe, Datum) und bebrütet sie bei 30 C im Brutschrank. Abb. 3: Verdünnen der Proben. Die Membranfiltermethode Abb. 4: Mischen der Proben. Das Prinzip der Keimzahlbestimmung nach der Membranfiltermethode ist die Anreicherung der Ke i- me aus einer bekannten Menge des Untersuchungsmaterials, zum Beispiel einer Wasser-oder Bodenprobe, auf der Oberfläche eines Filters und ihr anschließender mikroskopischer oder kultureller Nachweis. Der dazu verwendete Filter - der Membranfilter - besteht aus einer Gerüstsubstanz auf der Basis von Zellulose-Estern und Zelluloseregeneraten. Diese Stoffe bilden ein vielschichtiges Hohlraumsystem, dessen Porenweite so bemessen ist, dass Mikroorganismen zurückgehalten we r- P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 Die Bestimmung der Keimzahl den. Zur Filtration des Untersuchungsmaterials wird das Membranfilter in das Membranfiltergerät eingelegt. Als Auffanggefäß für das Filtrat dient eine Saugflasche, die über einen Vakuumschlauch mit einer Wasserstrahlpumpe verbunden ist (Abb. 1). Man schiebt einen in den Hals der Saugflasche (Abb. 5, 1) passenden Gummistopfen mit entsprechender Bohrung (Abb. 5, 2) über das Auslaufrohr des Unterteiles des Membranfiltergerätes (Abb. 5, 3). Zur Verbesserung der Gleitfähigkeit werden das Auslaufrohr und die Bohrung des Gummistopfens vorher mit etwas Glycerin eingestrichen. Man setzt den Gummistopfen mit dem Unterteil des Membranfiltergerätes in den Hals der Saugflasche ein und legt die Porzellanfritte (Abb. 5, 4), mit dem in sie eingelassenen blauen Dichtungsring nach unten, darauf. Anschließend wird ein Membranfilter (Abb. 5, 5) mit der karierten Seite nach oben auf die Porzellanfritte gebracht. Man setzt das Oberteil des Membranfiltergerätes (Abb. 5, 6), das zur Aufnahme des Untersuchungsmaterials dient, auf und verbindet Oberteil und Unterteil miteinander mit Hilfe der Metallklammer (Abb. 5, 7). Zum Schluss wird die Saugflasche über einen Vakuumschlauch an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen. Das Untersuchungsmaterial, zum Beispiel eine Wasserprobe, wird in das Oberteil des Membranfiltergerätes gegossen, die Wasserstrahlpumpe in Gang gesetzt und die Probe filtriert. Die zu filtrierende Menge hängt vom vermuteten Keimgehalt des Untersuchungsmaterials ab. Von Leitungswasser filtriert man im allgemeinen 1000 ml, von einem mäßig verschmutzten Flusswasser 100 ml. Zur Färbung der darauf angesammelten Keime wird das Membranfilter aus dem Gerät herausgenommen und zunächst an der Luft getrocknet. Abb. 5: Bauteile des Membranfilters. Man legt in eine Petrischale von 100 mm Durchmesser drei Rundfilter von 90 mm Durchmesser, streicht sie glatt, damit sie dem Boden der Schale dicht anliegen, und tränkt sie mit wässeriger Methylenblau-Lösung. Die Rundfilter sollen gut feucht sein, die Farblösung darf auf dem Papier jedoch keine Pfützen bilden. Man legt das an der Luft getrocknete Membranfilter für 10 Minuten mit der Schichtseite nach oben auf die mit der Farblösung getränkten Rundfilter (Abb. 6). Während dieser Zeit dringt die Farblösung in das Membranfilter ein und färbt es und die darauf angesammelten Keime dunkel-blau. Da nur die Keime gefärbt sein sollen, überträgt man den Membranfilter anschließend in eine zweite Petrischale auf eine dreifache Lage von Rundfiltern, die mit destilliertem Wasser getränkt sind. Der 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

5 Farbstoff wird auf diese Weise aus dem Membranfilter wieder herausgewaschen. Man entfärbt unter mehrfacher Erneuerung der Rundfilter, bis aus dem Membranfilter kein Farbstoff mehr herausgezogen wird und lässt es anschließend an der Luft trocknen. Nachdem alles durchgelaufen ist, werden die auf dem Filter zurückgehaltenen Mikroorganismen fixiert, indem man 10 ml einer 10%igen Formaldehyd-Lösung in das Oberteil des Membranfiltergerätes gießt und ebenfalls filtriert. Anschließend wird durch Filtration von ml destillierten Wassers gründlich ausgewaschen. Der mikroskopische Nachweis der Keime Der mikroskopische Nachweis gestattet nur eine größenordnungsmäßige Orientierung über, den Keimgehalt des betreffenden Untersuchungsmaterials. Für Schulversuche reicht dieses Verfahren, je nach der Aufgabenstellung, aber oft aus. Abb. 6: Rundfilter und Membranfilter. Zur mikroskopischen Untersuchung schneidet man aus dem Membranfilter kleine Stücke von etwa 5 mm Kantenlänge heraus. Sie werden in einen Tropfen Immersionsöl oder Glycerin auf einem Objek t- träger übertragen, wodurch sie transparent werden, mit einem Deckglas bedeckt und bei 400- und 1000facher mikroskopischer Vergrößerung untersucht (Objektiv 40x bzw. 100x, Okular 10x) Man sieht auf weißlich hellem oder schwach blau gefärbtem Untergrund dunkelblau gefärbte Keime. Zur Auswertung zählt man die Keime pro Gesichtsfeld an mehreren Stellen im Präparat und errec h- net den Mittelwert. Auf diese Weise kann der Keimgehalt verschiedenen Untersuchungsmaterials, zum Beispiel mehrerer Wasserproben, relativ verglichen werden. Eine absolute Bestimmung der Keimzahl ist nach der mikroskopischen Methode jedoch nicht möglich. Sie hat außerdem den Nachteil, dass nicht nur die in hygienischer Hinsicht bedeutungsvollen lebenden Keime, sondern auch die a b- gestorbenen erfasst werden, die sich auch mit anfärben. Der kulturelle Nachweis der Keime Soll die Keimzahl des Untersuchungsmaterials nicht nur größenordnungsgemäß geprüft und verglichen, sondern genau bestimmt werden, so muss man die Keime auf dem Membranfilter kulturell, d. h. durch ihre Entwicklung zu Bakterien- oder Pilzkolonien, nachweisen. Lediglich dann werden die in hygienischer Hinsicht bedeutungsvollen entwicklungsfähigen Keime allein erfasst. Dabei muss u n- ter sterilen Bedingungen gearbeitet werden. Das bedeutet, dass alle mit dem Untersuchungsmaterial in Berührung kommenden Teile des Membranfiltergerätes sterilisiert werden müssen, da sonst die daran haftenden und von dort auf das Filter geschwemmten Keime das Versuchsergebnis verfä l- schen würden Man verfährt zunächst in gleicher Weise wie beim mikroskopischen Nachweis der Keime, flammt j e- doch die Porzellanfritte nach dem Auflegen auf das Unterteil des Membranfiltergerätes zur Sterilisation mit der Flamme eines Gasbrenners mehrmals gründlich ab. Die Membranfilter werden zur kulturellen Keimzahlbestimmung jeweils zusammen mit Nährkartonscheiben in Polyethylenbeuteln steril verpackt geliefert. Man entnimmt mit einer durch Abflammen sterilisierten Pinzette ein Membranfilter aus dieser Verpackung und legt es auf die sterilisierte Po r- zellanfritte. Anschließend wird das Oberteil des Membranfiltergerätes innen sorgfältig abgeflammt, auf das Unterteil mit Porzellanfritte und Filter aufgesetzt und mit Hilfe der Metallklammer befestigt. P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

6 Die Bestimmung der Keimzahl Man gießt das Untersuchungsmaterial, zum Beispiel eine Wasserprobe, in das Membranfiltergerät und saugt mit der Wasserstrahlpumpe ab. Je nach dem vermuteten Keimgehalt, Muss das Untersuchungsmaterial gegebenenfalls wie beim KOCHschen Plattengussverfahren unter sterilen Bedingungen verdünnt werden. Nachdem alles durchgelaufen ist, wird das Oberteil des Membranfiltergerätes innen mit sterilem de s- tilliertem Wasser sorgfältig abgespült, damit eventuell noch an der Wandung haftende Keime auch auf das Membranfilter überführt werden. Dieses Wasser wird durch Absaugen mit der Wasserstrahlpumpe ebenfalls filtriert. Man entnimmt nun mit einer abgeflammten Pinzette eine Nährkartonscheibe aus der sterilen Verpackung und legt sie in eine sterile Petrischale von 100 mm Durchmesser, in die man zuvor mit einer sterilen Pipette 5 ml steriles destilliertes Wasser übertragen hat. Die mit der Nährkartonscheibe ve r- bundene Filtrierpapierscheibe muss nach unten gekehrt sein. Petrischalen werden im Heißluftsteril i- sator sterilisiert, Pipetten ebenfalls oder durch Alkohol und anschließendes Abflammen. Destilliertes Wasser sterilisiert man, abgefüllt in mit Wattestopfen verschlossenen Reagenzgläsern oder Erlenmeyerkolben, im Autoklaven. Das Membranfilter wird aus dem Membranfiltergerät mit einer durch Abflammen sterilisierten Pinze t- te herausgenommen und auf die mit dem sterilen destillierten Wasser durchtränkte Nährkartonscheibe gelegt (Abb. 7). Dabei ist sorgfältig darauf zu achten, dass keine Luftblasen zwischen Membranfilter und Nährkartonscheibe eingeschlossen werden. Die Petrischale ist für die einzelnen Arbeiten immer nur kurz zu öffnen und sonst ständig geschlossen zu halten, damit keine Keime aus der Luft hinein fallen und die Kultur verunreinigen können. Das Öffnen muss deshalb auch so erfolgen, dass der Deckel nur angehoben und immer über der Fläche der Schale gehalten wird. Die Petrischale mit Nährkartonscheibe und Membranfilter wird im Brutschrank bei 30 C bebrütet. Die Nährstoffe der Nährkartonscheibe werden von dem zugesetzten destillierten Wasser gelöst. Sie gelangen durch Diffusion an die Oberfläche des Membranfilters. Die dort angesammelten lebensfähigen Keime vermehren sich, soweit ihnen das Nährstoffangebot entspricht, und bilden innerhalb von drei bis fünf Tagen mit bloßem Auge erkennbare Bakterien- und Abb. 7: Membranfilter wird auf die Nährkartonscheibe gelegt. Pilzkolonien. Durch Auszählen der Kolonien wird die Zahl der entwicklungsfähigen Keime in der filtrierten Menge des Untersuchungsmaterials ermittelt. Ergebnisse Innerhalb von drei bis vier Tagen entwickeln sich auf den Nährböden zahlreiche Kolonien von Mikroorganismen. Man zählt die Kolonien auf jeder Platte aus, multipliziert mit dem reziproken Wert des jeweiligen Verdünnungsfaktors und ermittelt damit die Keimzahl, das heißt die Zahl der ent - wicklungsfähigen Keime in einem Gramm beziehungsweise Milliliter des Untersuchungsmaterials. Die Verdünnung des Untersuchungsmaterials soll zu einer für das Auszählen günstigen Menge von Kolonien auf den Nährböden führen. Sind es durch zu starke Verdünnung zu wenige, so sind die Ergebnisse bei vergleichenden Untersuchungen statistisch zu wenig gesichert. Sind es dagegen durch zu schwache Verdünnung zu viele Kolonien, so lassen sie sich nicht mehr gut auszählen. Man legt deshalb Platten aus zwei benachbarten Verdünnungsstufen an, und zwar zur besseren Sicherung der Ergebnisse aus jeder Stufe mindestens zwei. Dicht bewachsene Platten lassen sich leichter auszählen, wenn man sie durch Fettstiftmarkierungen außen auf dem Boden der Schale in 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

7 einzelne Sektoren teilt und diese getrennt auszählt. Das KOCHsche Plattengussverfahren geht von zwei Voraussetzungen aus, dass nämlich erstens alle Keime in den verwendeten Verdünnungsstufen einzeln verteilt vorliegen und zweitens jeder entwicklungsfähige Keim auf dem verwendeten Nährboden wächst und eine Kolonie bildet, die gezählt werden kann. Da das nicht für jeden vorhandenen entwicklungsfähigen Keim zutrifft, weichen die Ergebnisse bei Parallelversuchen oft nicht unerheblich voneinander ab. Der ermittelte Wert dürfte immer etwas zu niedrig sein. Trotz dieser Nachteile ist das KOCHsche Plattengussverfahren nach wie vor eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Keimzahlbestimmung, da es absolut genaue Bestimmungsmethoden bisher nicht gibt. P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7