Abschlussbericht Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung von Mais- und Soja- Saatgut auf GVO-Verunreinigungen (Frühjahr 2015) www.thueringen.de/th9/tll
Impressum Herausgeber: Bearbeiter: Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft Naumburger Str. 98, 07743 Jena Tel.: 03641 683-0, Fax: 03641 683-390 Mail: pressestelle@tll.thueringen.de Abteilung Untersuchungswesen Dr. Sabine Domey, Dipl. Ing. (FH) Maren Schmidt Dezember 2015 Copyright: Diese Veröffentlichung ist urheberrechtlich geschützt. Alle Rechte, auch die des Nachdrucks von Auszügen und der fotomechanischen Wiedergabe sind dem Herausgeber vorbehalten.
Inhaltsverzeichnis Seite 1 Aufgabenstellung... 2 2 Material und Methoden... 2 2.1 Anzahl und Menge der Proben... 2 2.2 Probenaufbereitung... 2 2.3 DNA-Extraktion... 3 2.4 Untersuchung der gentechnischen Veränderung... 3 mittels Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (real-time PCR) 3 Ergebnisse... 4 4 Zusammenfassung... 6 1
1 Aufgabenstellung Auf Grundlage des gemeinsamen Erlasses des Thüringer Ministeriums für Soziales, Familie und Gesundheit (TMSFG) jetzt Thüringer Ministerium für Arbeit, Soziales, Gesundheit, Frauen und Familie (TMASGFF) und des Thüringer Ministeriums für Landwirtschaft, Forsten, Umwelt und Naturschutz (TMLFUN) jetzt Thüringer Ministerium für Infrastruktur und Landwirtschaft (TMIL) vom 28. Januar 2003, zuletzt geändert am 20.12.2011, sollten im Auftrag des Thüringer Landesverwaltungsamtes (TLVwA) 35 Maissaatgutproben und 6 Sojasaatgutproben mit ausländischem Erzeugerland von der Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft (TLL) gezogen und auf Verunreinigungen mit gentechnisch-veränderten Organismen (GVO) im Frühjahr 2015 untersucht werden. 2 Material und Methoden Die molekularbiologische Diagnostik basierte auf der Subsamplingmethode der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 28b GenTG zum Nachweis von gentechnischen Veränderungen in Saatgut (G30.00.2, 2012). 2.1 Anzahl und Menge der Proben Die Probenahme erfolgte durch Mitarbeiter des Außendienstes der TLL unter Anleitung des Referates Saatgut nach den dafür geltenden Vorschriften im Zeitraum vom 26.01. - 23.03.2015 (Mais) sowie vom 14.04. - 13.05.2015 (Soja). Beprobt wurden Saatguthändler und landwirtschaftliche Betriebe laut Empfehlung der Bund / Länderarbeitsgemeinschaft Gentechnik (LAG) unter besonderer Berücksichtigung von zertifiziertem Importsaatgut (Drittstaaten und EU- Mitgliedstaaten). Es wurden insgesamt 35 Mais- und 7 Sojasaatgutproben geprüft. Für jede Probe existiert eine amtlich verschlossene Rückstellprobe, die im Referat Saatgut hinterlegt ist. Alle Proben gelangten trocken, amtlich verschlossen und gut beschriftet in das Gendiagnostiklabor der TLL. Da für Saatgut noch kein Schwellenwert für GVO-Verunreinigungen festgelegt wurde, besteht Nulltoleranz. Für die sichere Detektion eines GVO-Samens ist nach statistischer Berechnung eine Probenmenge von rund 3 000 Samen (mindestens 2 995 Samen) erforderlich, um die Hypothese, dass kein GVO-Samenkorn vorhanden ist, mit 95 %iger Sicherheit zu widerlegen. Unter Berücksichtigung einer technisch sicher realisierbaren Erfassungsgrenze von 0,1 % wurden die Proben analog zur amtlichen 28 B GenTG-Methode G30.00.2 (2012) in drei Teilproben von jeweils 1 000 Samen unterteilt (Subsampling). 2.2 Probenaufbereitung Die Saatgutproben wurden in jeweils drei Teilproben mit je 1 000 Samen mittels Körnerzählgerät Contador unterteilt und jede Teilprobe getrennt vermahlen, homogenisiert und analysiert. Zum Mahlen der Samen diente die Küchenmaschine TM 21 der Firma Vorwerk. 2
2.3 DNA-Extraktion Zur DNA-Extraktion wurden jeweils 3 g Mais- bzw. Sojamehl jeder Teilprobe eingesetzt und mit 10 ml PL1-Lysepuffer aus dem Invisorb Spin Plant Mini Kit (Fa. Stratec) (Mais) bzw. dem NucleoSpin Plant Kit II von Macerey-Nagel (Soja) versetzt. Nach 30 minütiger Inkubation bei 65 C im Schüttelwasserbad und anschließender Zentrifugation (10 min bei Maximum) wurde ein Aliquot von 400 µl des Überstandes entsprechend des jeweiligen Kit-Protokolls weiterbehandelt. Zur Kontrolle der Reinheit der Extraktion in der nachfolgenden real-time PCR sind jeweils zwei Kontrollen ohne Probenmaterial angelegt worden (Extraktionskontrolle). Die durchschnittliche DNA-Ausbeute wurde mit dem NanoDrop ermittelt. Proben mit DNA- Gehalten deutlich über 40 ng/µl wurden auf etwa diesen Gehalt verdünnt, um mögliche Inhibitionen während der PCR zu verhindern. Nach Ermittlung einer gentechnischen Veränderung (Sojaprobe der Sorte Anser mit der lfd. Nr. 7) wurde zur Absicherung des Ergebnisses die entsprechende Teilprobe wiederholt extrahiert (3 neue Extrakte: 7a2, 7b, 7c). 2.4 Untersuchung der gentechnischen Veränderung mittels real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) Der Nachweis einer gentechnischen Veränderung erfolgte anhand eines Screenings nach dem 35S-Promotor (p35s-camv) und dem NOS-Terminator (T-nos) mittels Real-Time PCR im Duplexansatz (ASU L 00.00-122, 2008). Es gelangte der GoTaq Probe qpcr Master Mix der Firma Promega zum Einsatz. Anhand dieses Screenings können außer LY038 und DAS- 40278-9 alle der gegenwärtig weltweit bekannten GV Maislinien erfasst werden. Für die eventspezifischen Nachweise von DAS-40278-9 und LY038 wurden die vom EURL veröffentlichten Methoden genutzt. Der GV-Sojanachweis erfolgte ebenfalls anhand des 35S/nos-Screenings, zusätzlich anhand des Screenings nach dem CTP2-CP4-EPSPS-Genkonstrukt entsprechend der ASU des 64 LFGB sowie der eventspezifischen Nachweise des EURL von DP-305423-1, BPS-CV127-9, MON87708, MON87701, MON87769 und DAS-68416-4, die nicht durch das Screening erfasst werden. Bei der Sojaprobe der Sorte Anser mit der lfd. Nr. 7, für die das 35Sund T-nos-Screening positiv verlief, wurden neben den o. g. Untersuchungen sachlogisch die Nachweise des bar-gens, des 35S-pat-Konstruktes entsprechend der ASU 64 LFGB sowie die EURL-Nachweismethoden des Events FG72 und des Events DP-356043-5 durchgeführt (vgl. Tabelle 3). Als negative Vergleichskontrolle diente je nach untersuchter Pflanzenart nicht gentechnisch veränderter konventioneller Mais bzw. Soja, als Positivkontrolle für die konstrukt- und eventspezifischen Nachweise entsprechende Referenzstandards der jeweiligen Events in geeigneter Konzentration. Die Kontrolle der Amplifizierbarkeit der extrahierten DNA basierte auf der Vervielfältigung des maisspezifischen hmg-gens (EURL, 2008) und einer konservierten Chloroplasten-Leu-tRNA- Sequenz (Methodensammlung der LAG) sowie des sojaspezifischen Lectingens (Lec, EURL, 2007). Zum Ausschluss einer möglichen Kontamination während des PCR-Ansatzes existierte jeweils eine Wasserkontrolle. Alle Probenextrakte und Kontrollen unterlagen einer PCR- Doppelanalyse. Der PCR-Lauf war auswertbar, wenn die Negativkontrollen (unbehandelter Mais / Soja, Extraktions- und Wasserkontrolle) kein Signal zeigten und die Positivkontrollen zu einem deutlichen Signal der erwarteten Größenordnung führten. 3
3 Ergebnisse Um Doppeluntersuchungen in den Ländern zu vermeiden und bei positiver Testung unverzüglich benachrichtigen und handeln zu können, wurden die Ergebnisse aus den einzelnen Probeneingängen kontinuierlich an die Verantwortlichen mitgeteilt. Der Eintrag der Ergebnisse erfolgte in die Saatgut-Datenbank am Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) und ist für alle registrierten Nutzer einsehbar. Die Untersuchungen waren am 27. März 2015 (Mais) bzw. 21. Mai 2015 (Soja) beendet. Tabelle 1 zeigt, dass in keiner der untersuchten Teilproben eine gentechnische Veränderung nachgewiesen werden konnte. Tabelle 1: Ergebnisse der Maissaatgutuntersuchung für Thüringen 2015 lfd. Nr. TLL- Nummer Sorte Anerkennungsnummer Erzeugerland GVO 1 TH 14/13/14 Toninio F 841H553648 Frankreich n.n. 2 TH 14/14/14 Laurinio F 111H911824 Frankreich n.n. 3 TH 14/15/14 SY Unitop H-4-99/ 997 Ungarn n.n. 4 TH 14/16/14 SY Comandor H-4-99/1 13 Frankreich n.n. 5 TH 4/12/14 Geoxx/Mesurol F 111H911679 Frankreich n.n. 6 TH 4/13/14 Futurixx F 111H91 899 Frankreich n.n. 7 TH 4/14/14 Ricardinio F 298H55 756 Frankreich n.n. 8 TH 4/15/14 Amelior F 424 H 156 225 Frankreich n.n. 9 TH 4/16/14 NK Falkone F 164 H 85 861 Frankreich n.n. 10 TH 4/17/14 SY UNITOP H-4-99/ 995 Ungarn n.n. 11 TH 6/12/14 DKC 3333 F 76 H 484 MEX Frankreich n.n. 12 TH 6/13/14 SY WERENA F 389 H 865199 Frankreich n.n. 13 TH 6/14/14 TOKALA F 964 H 21869NZ Frankreich n.n. 14 TH 6/15/14 P8105 Single Cross A 4P 346772 Österreich n.n. 15 TH 14/17/14 Colisee F 491 H 245 2 Frankreich n.n. 16 TH 11/11/14 LG 30.223 F 964 H 23253 NZ Frankreich n.n. 17 TH 11/12/14 SY Unitop H - 4-99/ 99 Ungarn n.n. 18 TH 11/13/14 SY Amboss F 4 24 H 823661 S Frankreich n.n. 19 TH 11/14/14 P 9027 F 1761 H 33627 Chile n.n. 20 TH 11/15/14 Colisee F 1551 H 3 4 S Frankreich n.n. 21 TH 11/16/14 Ricardinio F 1551 H 2 5 B Frankreich n.n. 22 TH 25/10/14 OSTERBI cs F 252 H 3 N 93 Frankreich n.n. 23 TH 25/11/14 Borelli hibrid 4BR5111-4BR 2/4TR Rumänien n.n. 24 TH 25/12/14 Feldi CS F 164 H 4T9252 Frankreich n.n. 25 TH 6/16/14 LG 30.222 F 964 H 22878 NZ Frankreich n.n. 26 TH 6/17/14 Pralina A4R32 7 Chile/Ungarn n.n. 27 TH 25/13/14 Severus F 298 H 55 738 Frankreich n.n. 28 TH 25/14/14 AGRO GAS F 298 H 22 5 7 Frankreich n.n. 29 TH 11/17/14 MILLESIM 4 IL 2621-4 BR 1 Rumänien n.n. 30 TH 11/18/14 DENNY A 4 R 3199 Österreich n.n. 31 TH 14/18/14 SY Comandor F 389 H 868 472 Frankreich n.n. 32 TH 07/13/14 Babene F 111 H 91338 Frankreich n.n. 33 TH 07/14/14 Colisee F 841 H 553 98 S Frankreich n.n. 34 TH 06/18/14 ES POGRESS F 44 H 165859CEX Frankreich n.n. 35 TH 27/05/14 Colisee DE 144-2 4697 Serbien/ Frankreich n.n. n.n. nicht nachgewiesen 4
Tabelle 2: Ergebnisse der Sojasaatgutuntersuchung für Thüringen 2015 lfd. Nr. TLL- Nummer Sorte Anerkennungsnummer Erzeugerland positiv 1 07/16/14 Amarok A 4 R 1125 Österreich n.n. 2 07/17/14 Merlin A 4 U 70275 Österreich n.n. 3 07/18/14 Merlin A 4 U 70319 Österreich n.n. 4 27/07/14 Merlin A 4 U 309 39/01 Österreich n.n. 5 27/08/14 Merlin A 4 U 94006/02 Österreich n.n. 6 4/18/14 Merlin A 4 U 94007 Österreich n.n. 7 4/19/14 Anser A 4 U 31045 Kanada GTS-40-3-2 n.n. nicht nachgewiesen Tabelle 3: Ergebnisse der GVO-Analyse für die Sojaprobe der Sorte Anser mit der Anerkennungsnummer A 4 U 31045 Nachweis 7/1 7/2 7/3 a1 7/3 a2 7/3 b 7/3 c P35S/T-nos P35S Ø Ø + + + + T-nos Ø Ø + + + + CTP2-CP4-EPSPS Ø Ø Ø Ø Ø Ø DP-305423-1 1 Ø Ø Ø Ø Ø Ø bar Ø Ø Ø Ø Ø Ø 35S/pat 2 Ø Ø Ø Ø Ø Ø CV127 1 Ø Ø Ø Ø Ø Ø DAS-68416-4 1 Ø Ø Ø Ø Ø Ø MON87701 1 Ø Ø Ø Ø Ø Ø MON87708 1 Ø Ø Ø Ø Ø Ø MON87769 1 Ø Ø Ø Ø Ø Ø GTS40-3-2 3 Ø Ø + + + + FG72 3 Ø Ø Ø Ø Ø Ø DP-356043-5 3 Ø Ø Ø Ø Ø Ø 1 nicht mit P35S/T-nos- und CTP2-CP4-EPSPS-Screening erfassbar 2 durchgeführt, da P35S/T-nos positiv, Ausschluss A2704-12 und A5547-127 3 durchgeführt, da P35S/T-nos positiv In der Probe mit der Anerkennungsnummer A 4 U 3145 konnte für eine der Teilproben das Event GTS40-3-2 nachgewiesen werden (vgl. Tabelle 2 und 3). Dieser GVO ist resistent gegenüber Glyphosat (Roundup) und hat eine Zulassung in Europa für das Inverkehrbringen und den Einsatz als Lebens- und Futtermittel, jedoch nicht für den Anbau. Entsprechend der Festlegungen im Gemeinsamen Erlass zur Saatgutuntersuchung in Thüringen wurden alle erforderlichen Maßnahmen ergriffen, um dieses Saatgut aus dem Verkehr zu ziehen bzw. unschädlich zu machen. In allen anderen Proben wurde keine gentechnische Veränderung nachgewiesen. 5
4 Zusammenfassung Im Rahmen der amtlichen Kontrolle wurden im Frühjahr 2015 im Auftrag des Thüringer Landesverwaltungsamtes durch die Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft 35 Mais- und 7 Sojasaatgutproben unterschiedlicher Sorten aus dem Saatguthandel auf GVO-Verunreinigungen untersucht. Die gendiagnostische Kontrolle des Saatguts basierte auf dem Handlungsleitfaden der Bund / Länderarbeitsgemeinschaft Gentechnik (LAG) zur Harmonisierten experimentellen Saatgutüberwachung auf GVO-Anteile sowie auf dem Vorschlag der LAG für ein bundeseinheitliches Vorgehen. In keiner der Maissaatgutproben konnte eine gentechnische Veränderung nachgewiesen werden. Bei der Sojasaatgutprüfung wurde in einer der drei Teilproben der Probe mit der österreichischen Anerkennungsnummer A 4 U 31045 und dem Erzeugerland Kanada (Sorte Anser) das Event GTS-40-3-2 nachgewiesen. Diese Partie wurde aus dem Verkehr gezogen. 6