ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße 49 55129 Mainz Tel.: 06131-9258-0 Fax: 06131-9258-58 Anti-MPO ORG 519 96 Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO) Gebrauchsanweisung
INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... 2 Einleitung... 3 Methodik... 3 Lieferumfang des Tests... 5 Technische Daten... 5 Erforderliche Laborgeräte... 5 Vorbereitung der Reagenzien... 6 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 6 Technische Hinweise... 6 Assaydurchführung... 7 Auswertung der Ergebnisse... 8 Normalwerte... 8 Spezifität... 8 Sensitivität... 8 Kalibrierung... 8 Linearität... 8 Reproduzierbarkeit... 9 Literatur... 9 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen... 10 Kurzanleitung... 11 2
EINLEITUNG Die Erstbeschreibung antineutrophiler zytoplasmatischer Antikörper (ANCA) in einigen we-nigen Patienten mit nekrotisierender Glomerulonephritis im Jahre 1982 führte zu der Entdeckung immundiagnostisch außerordentlich relevanter Autoantikörperspezifitäten, deren Nachweis für die Diagnose systemischer Vaskulitiden und für die Differenzierung ent-zündlicher Systemerkrankungen unerläßlich ist. Diese Autoantikörper, die gegen unterschiedliche intrazelluläre Antigene neutrophiler Granulozyten (PMN) und Monozyten gerichtet sind, wurden 1964 zum ersten Mal als granulozytenspezifische antinukleäre Faktoren (GS-ANA) beschrieben, ohne daß ihre Bedeutung zunächst erkannt wurde. Im Jahre 1985 wurden diese Autoantikörper unter dem Begriff APCA (anticytoplasmatische Antikörper) als ANCA mit einer, in der indirekten Immunfluoreszenz auf einem Granulozytensubstrat sichtbaren, zentral akzentuierten zytoplasmatischen Fluoreszenz (heute canca) als Maker für die Wegenersche Granulomatose (WG) beschrieben. Kurze Zeit später gelang die Identifikation des zugrundeliegenden Autoantigens, das lysosomale Enzym Proteinase 3. 1988 erfolgte die Abgrenzung eines weiteren ANCA-Fluoreszensmuster mit perinukleärer Fluoreszenz (panca) und dessen Zuordnung zur mikroskopischen Polyangiitis (MPA) und idiopathischen nekroti-sierenden Glomerulonephritis. Als ein Zielantigen des panca Musters wurde zunächst einmal nur die Myeloperoxidase (MPO) erkannt, ebenfalls ein lysosomales Enzym. Erst später erfolgte die Identifizie-rung weiterer panca Zielantigene. Nicht gegen MPO gerichtete panca finden sich bei einer ganzen Reihe entzündlicher, vornehmlich rheumatischer und gastrointestinaler Erkrankungen. Autoantigene dieser panca sind ebenfalls lysosomale Proteine: Laktoferrin, Lysozym, Cathepsin G und Elastase. Zusätzlich wurde auch neben der Proteinase 3 ein weiteres canca Zielantigen identifiziert, das "Bactericidal permeability increasing protein" (BPI). Vaskulitiden stellen eine außerordentlich facettenreiche Klasse von Erkrankungen dar, die durch eine Entzündung der Wände der Blutgefäße charakterisiert sind. Die klinischen Bilder der Vaskulitiden präsentieren sich insgesamt ausgesprochen heterogen, da die unterschiedlichsten Gefäßtypen betroffen sind und der Grad der Dissemination sowie die immunpathogenetischen Mechanismen sehr variieren können. Die Krankheitsdefinitionen gemäß der Chapel Hill Konferenz im Jahre 1992 orientieren sich bei der Einteilung der primären systemischen Vaskulitiden vorwiegend an dem betroffenen Gefäßtypus: Vaskulitiden der großen Gefäße (Riesenzellarteriitis und Takayasu Arteriitis), Vaskulitiden mittelgroßer Gefäße (Polyarteriitis nodosa, Kawasaki Arteriitis) und den ANCA assoziierten Vaskulitiden der kleinen Gefäße mit den Krankheitsbildern Wegener-Granulomatose (WG), Churg- Strauß-Syndrom, Mikroskopische Polyangiitis und Purpura Schönlein Henoch. Autoantikörper, die gegen MPO gerichtet sind, werden beim Churg-Strauss-Syndrom, einer allergischen Granulomatose und Angiitis, gefunden. Bei dieser Vaskulitis sind insbesondere die Lungengefäße betroffen. Bis zu 50% aller Patienten mit Churg-Strauss-Syndrom weisen MPO- ANCA auf. Anti-MPO werden auch bei ca. 70% aller Patienten mit Mikroskopischer Polyangiitis (MPA) gefunden. Im Vordergrund des Krankheitsbildes MPA stehen meist eine nekrotisierende Glomerulonephritis mit pulmorenalem Syndrom und vaskulitischen Läsionen der Haut, des Nervensystems, des Auges und des HNO-Traktes. Da die Abgrenzung der MPA von anderen autoimmunen Manifestationen mit pulmorenalem Syndrom (z.b. Goodpasture Syndrom, Systemischer Lupus erythematodes, Morbus Wegener) oft schwierig ist, kommt hier dem Nachweis von MPO-ANCA besonders in der Frühdiagnostik eine große Bedeutung zu. Myeloperoxidase, ein kationisches Enzym (Molekulargewicht: 146 kda) der Lysosomen neutrophiler Granulozyten und Monozyten, wurde zuerst 1941 isoliert und aufgrund ihrer grünen Farbe und ihrer Fähigkeit, Peroxidasereaktionen zu katalysieren, "Verdoperoxidase" genannt. Wie auch Anti-PR3 erkennen Anti-MPO ausschließlich native, also konformationelle Epitope. Indikationen: Vaskulitiden 3
METHODIK Der vorliegende Test ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO). Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit humaner Myeloperoxidase beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in den Standards, Kontrollen und in den Patientenproben werden an das immobilisierte Antigen in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igg Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. 4
LIEFERUMFANG DES TESTS Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die beschichtet sind... 1 mit humaner Myeloperoxidasedase Probenpuffer, Konzentrat, (gelb)... 1 Fläschchen, 20 ml Waschpuffer, Konzentrat... 1 Fläschchen, 20 ml Konjugat... 1 Fläschchen, 15 ml anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa), TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig... je 1 Fläschchen, 1,5 ml - Kontrolle 1 Positivkontrolle - Kontrolle 2 Negativkontrolle Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen:...je 1 Fläschchen, 1,5 ml 0-6,3-12.5-25 - 50-100 U/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial Serum oder Plasma Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 100 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung Gesamt-Inkubationszeit 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) Meßbereich: 0-100 U/ml Empfindlichkeit: 0,5 U/ml Meßwellenlänge 450 nm Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Wirbelmischer (Vortex) - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette - destilliertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung 5
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der MPO-ANCA wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. 6
ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: 1 2 3 4 5 6 A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. SA - SF: Standards A bis F D SB SF P2 P.. P1, P2... Pantientenprobe 1, 2... E SC K1 P3 K1: Positivkontrolle F SC K1 P3 K2: Negativkontrolle G SD K2 P4 H SD K2 P4 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferrest e müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 7. 100 µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. Bitte beachten Sie: Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen. 7
AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem Anti-MPO ELISA die folgenden Werte ermittelt: normal < 5 U/ml erhöht > 5 U/ml SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze für für Anti-MPO beträgt 0,5 U/ml. SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit hochgereinigter Myeloperoxidase beschichtet. Das Enzym wurde aus humanen Granulozyten unter Aufrechterhaltung seiner enzymatischen Aktivität isoliert. KALIBRIERUNG Das quantitative Meßsystem für Anti-MPO ist in relativen Einheiten kalibriert. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. 8
REPRODUZIERBARKEIT In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianzen des Anti-MPO Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianz wurden drei Seren mit unterschiedlichen anti-mpo Konzentrationen jeweils 24-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianzen wurden drei Proben mit unterschiedlichen anti- MPO Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen. Probe Nr. Intra-Assay Mittelwert (U/ml) Variationskoeffizient (%) Probe Nr. Inter-Assay Mittelwert (U/ml) Variationskoeffizient (%) 1 15,1 6,4 1 15,7 5,0 2 30,2 4,1 2 33,8 4,9 3 59,9 3,1 3 78,3 6,3 LITERATUR 1. Cohen Tervaert J.W., Goldschmeding, R., Elema, J.D., Limburg, P.C. et al. Association of autoantibodies to myeloperoxidase with different forms of vasculitis. Arthritis Rheum. 33 (8):1264-1272, 1990 2. Cotch, M.F., Hoffman, G.S., Yerg, D.E., et.al. The epidemiology of Wegener's granulomatosis. Estimates of the five-year period prevalence, annual mortality, and geographic disease distribution from population-based data sources. Arthritis Rheum., Vol 39, 87-92, 1996 3. de Grot, K., Schnabel, A., Gross, W. L. ANCA-assoziierte Vaskulitiden (Wegener Granulomatose, Churg-Strauß-Syndrom, Mikroskopische Polyangiitis) - 1. Diagnostisches Procedere. Z. Rheumatol., Vol 54, 291-302, 1995 4. Gross, W.L. Systemic necrotizing vasculitis. Baillieres.Clin.Rheumatol., Vol. 11, 259-284, 1997 5. Gross, W.L., Csernok, E., Helmchen, U. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies, autoantigens, and systemic vasculitis. APMIS, Vol. 103, 81-97, 1995 6. Jenette, J. C. Falk, R. J. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies and associated diseases. A review. Am. J. Kidney Dis., Vol 15, 517-529, 1990 7. Jennette, C.J., Falk, R.J., Andrassy, K., Bacon, P.A. et al. Nomenclature of systemic vasculitides. Proposal of an internation al consensus conference. Arthritis Rheum. Vol. 37, 187-192, 1994 8. Kallenberg, C.G Vasculitis 1995: new concepts in pathophysiology. Isr.J Med Sci., Vol. 32, 7-12, 1996 9. Kallenberg, C.G. Laboratory findings in the vasculitides. Baillieres Clin. Rheumatol., Vol 11, 395-421, 1997 9
10. Schmitt, W. H., Gross, W. L. Antineutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA). Internist, Vol. 36, 282-290, 1995 11. Wiik, A., Stumman, L., Kjeldsen, L., Borregaard, N., et al. The diversity of perinuclear antineut rophil cytoplasmic antibodies (panca) antigens. Clin. Exp. Immunol., Vol. 101, Suppl. I, 15-17, 1995 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 10
KURZANLEITUNG 11