Biomaterialien KKNMS Kohorte + PBMC AUTOREN Jochim A Hemmer B Posevitz-Fejfar A Wiendl H INHALT Anleitungen und Leitlinien: Stand: 30. 10. 2012 Übersicht über das Blutentnahmeset Liquorasservierung Blutentnahme zur RNA-Gewinnung (Tempus-Röhrchen) Blutentnahme zur DNA-Gewinnung (EDTA) Blutentnahme zur Plasma-Gewinnung (EDTA) Blutentnahme zur Liquorgewinnung (OPTIONAL) Informationen zur Hämolyse NEU: Blutentnahme für PBMC-Biobanking / Weiterverarbeitung
Kohortenstudie Das Blutentnahme-Set 1. Die Blutröhrchen und ihre Bestimmung 2 Tempus-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -100 und -200) Versand zur TU München Zentrifugation 10 Minuten Serum-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -300) Serum in 8 Aliquots Versand zur TU München Zentrifugation 10 Minuten Serum-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -400) Serum in 8 Aliquots Lokale Lagerung (-80 C) EDTA-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -500) Versand zur TU München Zentrifugation 15 Minuten EDTA-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -600) Plasma in 8 Aliquots Lokale Lagerung (-80 C) Die Blutröhrchen und Aliquot-Röhrchen für eine Visite sind mit der gleichen Probenset- Codenummer mit unterschiedlichen Endziffern etikettiert. 2. Zur Blutentnahmetechnik Reihenfolge: Tempus > Serum > EDTA (fortlaufend nach den Endziffern -100 bis -600) 1. 2. 3. Venenpunktion 4. Tempus-Röhrchen direkt nach der Blutabnahme bitte für 15 Sek. kräftig schütteln!
3. Serum- und Plasmaasservierung Kohortenstudie Bitte Reihenfolge der Asservierung beachten: Direkt nach der Blutentnahme: EDTA-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -600) Zentrifugation 1300 g 15 Minuten bei Raumtemperatur Aliquotröhrchen für Plasma: blaue Deckel Plasma in 8 Aliquots pipettieren (je 600 l) Blaue Deckel (Endziffern -601 bis -608) Plasma einfrieren (-80 C) und lokal lagern - Die Aliquotröhrchen sind im Probenset enthalten (in der Schaumfolie). - Codenummer-Endziffern -601 bis -608 - Ein leeres 96er-Rack zum Einfrieren der Plasma-Aliquots von 12 Patienten (1 Reihe = 1 Patient) wird Ihnen im Karton mit den Probensets zugesandt. 20-30 Minuten nach der Blutentnahme: Serum-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -300) Zentrifugation 1300 g 10 Minuten bei Raumtemperatur Serum in 8 Aliquots pipettieren (je 600 l) Rote Deckel (Endziffern -301 bis -308) Versand zur TUM Serum-Röhrchen (Codenr.-Endziffern -400) Aliquotröhrchen für Serum: rote Deckel Serum in 8 Aliquots pipettieren (je 600 l) Rote Deckel (Endziffern -401 bis -408) Serum einfrieren (-80 C) und lokal lagern -Röhrchen für direkten Versand zur TUM: - Die Aliquotröhrchen sind im Probenset enthalten (in einem Schutzgefäß). - Codenummer-Endziffern -301 bis -308 - Gefüllte Aliquots wieder in ein Schutzgefäß-> in Versandschachtel-> Versand zur TUM - Röhrchen für lokale Asservierung: - Die Aliquotröhrchen sind im Probenset enthalten (in der Schaumfolie). - Codenummer-Endziffern -401 bis -408 - Ein leeres 96er-Rack zum Einfrieren der Serum-Aliquots von 12 Patienten (1 Reihe = 1 Patient) wird Ihnen im Karton mit den Probensets zugesandt. Wenn nicht ausreichend Material für je 8 Aliquots à 600 l vorhanden ist, bitte trotzdem alle Aliquotröhrchen einer Sorte (Serum bzw. Plasma) mit möglichst gleichem Volumen füllen (Mindestfüllmenge 300 l).
4. Dokumentation Kohortenstudie - Online-Dateneingabe in KKNMS-Maske Wenn nicht am gleichen Tag möglich: Bitte formlose Email an biobank@lrz.tum.de zur Information über den Versand mit Versanddatum und Probensetnummer - Probenbegleitschein - Eigene Liste: Patientenname mit Probensetnummer - Eigene Liste: Lagerungsbedingungen des Serum und Plasma (bzw. ggf. auch Liquor): Ort des Gefrierschranks, Ort im Gefrierschrank, Temperatur - zusätzlich auf der Checkliste in der Versandbox 5. Versand nach München 1 EDTA- Röhrchen (Endziffern -500) 2 Tempus-Röhrchen (Endziffern -100 und-200) in 3 Schutzgefäße Je 8 Serum-Aliquots (Endziffern -301 bis -308) in 1 Schutzgefäß Schutzgefäße in die Schaumfolie Schaumfolie in die Versandbox mit passender Probensetnummer Versandbox per Post zur TU München Bis zum Versand bitte im Kühlschrank lagern (4 C). Bitte Versand mit vollständig ausgefülltem Probenbegleitschein! Vielen Dank! Bei Fragen wenden Sie sich bitte an: Stefanie Wirth, Klinikum rechts der Isar der TU München, Neurologie biobank@lrz.tum.de, Tel.: 089/4140-4687
Kohortenstudie 6. Wann? Liquorasservierung Eine Lumbalpunktion ist im eigentlichen Visitenplan der Kohortenstudie nicht vorgesehen. Trotzdem ist im Studienprotokoll festgehalten, dass bei Einverständnis des Patienten Liquor für die Kohortenstudie asserviert werden kann, - elektiv im Rahmen der 1. Visite der Kohortenstudie (oder zu einem späteren Zeitpunkt) - wenn aus diagnostischen Gründen eine Lumbalpunktion im Verlauf der Studie nötig wird. Bei den meisten Patienten wurde vor Einschluss in die Studie im Rahmen der Erstdiagnose eine Lumbalpunktion durchgeführt. Ist hiervon noch Liquor vorhanden, kann dieser - bei Einverständnis des Patienten- dem KKNMS zur Verfügung gestellt werden. 7. Wie? Zu Beginn der Kohortenstudie stellen wir Ihnen unetikettierte Aliquotröhrchen mit weißem Schraubverschluss zur Verfügung (in 96er-Racks). Zusätzlich erhalten Sie Bögen mit Etiketten zur Codierung. Für einen Patienten stehen jeweils 20 Etiketten mit gleicher Probensetnummer (z.b. 123456-99-) und fortlaufenden Endziffern zur Verfügung. Wir bitten Sie, den Liquor (wenn keine Zellen mehr untersucht werden sollen) bei 1300 g über 10 Minuten zu zentrifugieren, den Überstand in ein gemeinsames Gefäß zu überführen und dann in die Aliquotröhrchen à 600 l zu pipettieren. Etikettieren Sie dann die Röhrchen, beginnend mit der Endziffer 001, in aufsteigender Reihenfolge. Wünschenswert wären mindestens 8 Aliquotröhrchen, maximal 20. Wir freuen uns aber auch über kleinere Mengen. Frieren Sie den Liquor bitte anschließend bei 80 C im 96-er Rack ein und dokumentieren Sie den Standort. Wenn Sie zeitgleich Blut asservieren, entnehmen Sie die Blutröhrchen bitte einem Blutentnahmeset und verarbeiten bzw. dokumentieren nach der zugehörigen Anleitung (eigene Probensetnummer). 8. Dokumentation - Online-Dateneingabe in KKNMS-Maske - Eigene Liste: Patientenname mit Probensetnummer - Eigene Liste: Lagerungsbedingungen des Liquor (bzw. ggf. auch begleitend abgenommener Blutproben): Ort des Gefrierschranks, Ort im Gefrierschrank, Temperatur
Kohortenstudie 1. Leitlinien für die Blutentnahme zur RNA-Gewinnung (Tempus-Röhrchen) Kohortenstudie Control-MS im KKNMS (externes Zentrum) Issue: Prozedur: Idealsituation: 1 Umfang: Mind. 6 ml 2 Entnahmestelle: Vene peripher 3 Nadeltyp: BD Vacutainer Safety Lok mit BD Vacutainer Holder 4 Sammelröhrchentyp: 2 Tempus Blood RNA tubes (Applied Biosystems) (je 3 ml) 5 Tageszeit der Abnahme und Lagerung: Vorzugsweise in jedem Zentrum standardisiert unter Berücksichtigung der Unterschiede zwischen den Zentren in der lokalen Logistik. Dokumentation von Datum und Zeit der Abnahme, Medikamenteneinnahme, Abnahme-Reihenfolge (Tempus - Serum - EDTA), Versand 6 Handhabung direkt nach Tempus Blood RNA tubes kräftig schütteln Blutentnahme 7 Lagertemperatur bis zum Kühlschrank (4 C) Versand 8 Zeitabstand zwischen Abnahme und Versand Am selben Tag oder am Folgetag mit zwischenzeitlicher Lagerung bei 4 C 9 Versand Bei Raumtemperatur. Röhrchen in Schutzgefäße (Sarstedt ) in vorcodierter und etikettierter Schachtel. 10 Kodierung: Eindeutige und gefrierfeste Beschriftung mit Codenummer, um einheitlichen, leicht überprüfbaren Code für alle Röhrchen eines Patienten zu gewährleisten. Namen des Patienten in zentrumseigener Liste mit der Codenummer notieren.
Kohortenstudie 2 Leitlinien für die Blutentnahme zur Serum-Gewinnung (Serum-Röhrchen) Kohortenstudie Control-MS im KKNMS (externes Zentrum) Issue: Prozedur: Idealsituation: 1 Umfang: Mind. 15 ml (ideal 20 ml) 2 Entnahmestelle: Vene peripher 3 Nadeltyp: BD Vacutainer Safety Lok 4 Sammelröhrchentyp: 2 Vacutainer Röhrchen für die Serumanalyse ohne Gel, PET (je 10 ml) (BD) 6 Tageszeit der Abnahme und Lagerung: Vorzugsweise in jedem Zentrum standardisiert unter Berücksichtigung der Unterschiede zwischen den Zentren in der lokalen Logistik. Dokumentation von Datum und Zeit der Abnahme, Medikamenteneinnahme, Abnahme-Reihenfolge (ideal: Tempus - Serum - EDTA für Plasma, EDTA für DNA. Die Reihenfolge ist durch die fortlaufenden Endziffern der Codenummern vorgegeben.), Versand 9 Lagertemperatur bis zum Gefrieren Raumtemperatur vor, während und nach der Zentrifugation. 10 Zentrifugieren: Serum: 1300 g, 10 min bei Zimmertemperatur. 11 Zeitabstand zwischen Abnahme und Zentrifugieren und Gefrieren Optimal für Serum: <1 Stunde Vor der Zentrifugation sollten die Serumröhrchen 20-30 Minuten stehen gelassen werden. Nach der Zentrifugation werden die Proben beider Serum-Vacutainer (Endziffer der Codenummer 300 und -400) getrennt aliquotiert. Das Serum eines Vacutainer (-300) wird nach Aliquotierung gefroren und bei -80ºC im Zentrum gelagert. Bei gleichzeitiger Abnahme von Serum und Liquor: möglichst
zeitgleiche Asservierung. Kohortenstudie Das Serum des zweiten Vacutainer (-400) wird nach der Aliquotierung direkt zur TU München versandt. 12 Aliquotröhrchen: Kleine Polypropylenröhrchen (1,1 ml) mit roten Schraubverschlüssen (Integra Biosciences GmbH). 13 Aliquotierung: 8 Aliquots pro Blutentnahmeröhrchen 14 Aliquotmenge: 600 l pro Röhrchen. Die Röhrchen sollten zu 75% befüllt werden. 15 Kodierung: Eindeutige und gefrierfeste Beschriftung mit Codenummer, um einheitlichen, leicht überprüfbaren Code für alle Röhrchen eines Patienten zu gewährleisten. Die Röhrchen werden vorcodiert an die Zentren versendet. Endziffern der Codenummern: -300 und -400 für die Blutentnahmeröhrchen, -301 bis -308 bzw. -401 bis -408 für die entsprechenden Aliquots. Namen des Patienten in zentrumseigener Liste mit der Codenummer notieren. 16 Gefriertemperatur: -80ºC 17 Zusätzlich im Probenprotokoll Standort der Proben zu erfassen: 18 Zusätzlich im Probenprotokoll Überwachung der Gefriergeräte zu erfassen: 19 Zusätzlich im Probenprotokoll zu erfassen: Aufteilung von Proben auf zwei oder mehr Gefriergeräte.
3. a) Leitlinien für die Blutentnahme zur DNA-Gewinnung (EDTA) Kohortenstudie Kohortenstudie Control-MS im KKNMS (externes Zentrum) Issue: Prozedur: Idealsituation: 1 Umfang: Mind. 9 ml 2 Entnahmestelle: Vene peripher 3 Nadeltyp: BD Vacutainer Safety Lok mit BD Vacutainer Holder 4 Sammelröhrchentyp: Vacutainer EDTA Röhrchen, PET (10 ml) (BD) 5 Tageszeit der Abnahme: Unabhängig von der Tageszeit 6 Lagertemperatur bis zum Kühlschrank (4 C) Versand 7 Zeitabstand zwischen Abnahme und Versand Am selben Tag oder am Folgetag mit zwischenzeitlicher Lagerung bei 4 C. 8 Versand Bei Raumtemperatur. Vacutainer in Schutzgefäß (Sarstedt ) in vorcodierter und etikettierter Versandschachtel. 9 Kodierung: Eindeutige und gefrierfeste Beschriftung mit Codenummer, um einheitlichen, leicht überprüfbaren Code für alle Röhrchen eines Patienten zu gewährleisten (Röhrchen werden vorcodiert versandt). Namen des Patienten in zentrumseigener Liste mit der Codenummer notieren.
Kohortenstudie 3.b) Leitlinien für die Blutentnahme zur Plasma-Gewinnung (EDTA) Kohortenstudie Control-MS im KKNMS (externes Zentrum) Issue: Prozedur: Idealsituation: 1 Umfang: 10 ml 2 Entnahmestelle: Vene peripher 3 Nadeltyp: BD Vacutainer Safety Lok 4 Sammelröhrchentyp: Vacutainer EDTA Röhrchen, PET (10 ml) (BD) 6 Tageszeit der Abnahme und Lagerung: Vorzugsweise in jedem Zentrum standardisiert unter Berücksichtigung der Unterschiede zwischen den Zentren in der lokalen Logistik. Dokumentation von Datum und Zeit der Abnahme, Medikamenteneinnahme, Abnahme-Reihenfolge (ideal: Tempus - Serum - EDTA für Plasma, EDTA für DNA. Die Reihenfolge ist durch die fortlaufenden Endziffern der Codenummern vorgegeben.), Versand 9 Lagertemperatur bis zum Gefrieren Raumtemperatur vor und während der Zentrifugation. Danach sofortiges Einfrieren bei 80 C. 10 Zentrifugieren: Serum: 1300 g, 15 min bei Zimmertemperatur. 11 Zeitabstand zwischen Abnahme und Zentrifugieren und Gefrieren Optimal für Plasma: <1 Stunde. Zentrifugation, Aliquotierung und Einfrieren sollen so bald wie möglich nach der Blutentnahme erfolgen. 12 Aliquotröhrchen: Kleine Polypropylenröhrchen (1,1 ml) mit blauen Schraubverschlüssen (Integra Biosciences GmbH). 13 Aliquotierung: 8 Aliquots pro Blutentnahmeröhrchen 14 Aliquotmenge: 600 l pro Röhrchen. Die Röhrchen sollten zu 75% befüllt werden. 15 Kodierung: Eindeutige und gefrierfeste Beschriftung mit Codenummer, um einheitlichen, leicht überprüfbaren
Kohortenstudie Code für alle Röhrchen eines Patienten zu gewährleisten. Die Röhrchen werden vorcodiert an die Zentren versendet. Endziffern der Codenummern: -500 für das EDTA- Blutentnahmeröhrchen, -501 bis -508 für die Plasma- Aliquots. 16 Gefriertemperatur: -80ºC Namen des Patienten in zentrumseigener Liste mit der Codenummer notieren. 17 Zusätzlich im Probenprotokoll Standort der Proben zu erfassen: 18 Zusätzlich im Probenprotokoll Überwachung der Gefriergeräte zu erfassen: 19 Zusätzlich im Probenprotokoll zu erfassen: Aufteilung von Proben auf zwei oder mehr Gefriergeräte.
Kohortenstudie 4. Leitlinien für die Blutentnahme zur Liquor-Gewinnung (OPTIONAL) Kohortenstudie Control-MS im KKNMS (externes Zentrum) Issue: Prozedur: Idealsituation: 1 Umfang: Mindestens 12 ml. 1-2 ml für die Liquordiagnostik (nach hausinternem Standard) 2 Entnahmestelle: L3-L5 10 ml für das Biobanking. Dokumentation der abgenommenen Menge und Teilmenge für das Biobanking 3 Wenn blutig: Kein weiteres Vorgehen. Kriterium für blutig: mehr als 500 rote Blutkörperchen / L. Dokumentation der Blutkörperchen in den diagnostischen Proben. 4 Nadeltyp: atraumatisch 5 Sammelröhrchentyp: Liquor; Polypropyleneröhrchen, Schraubverschluss, 10ml (Röhrchentyp dokumentieren) 6 Tageszeit der Abnahme und Lagerung: Vorzugsweise in jedem Zentrum standardisiert unter Berücksichtigung der Unterschiede zwischen den Zentren in der lokalen Logistik. Dokumentation von Datum und Zeit der Abnahme. 7 Gleichzeitige Abnahme anderer Serum (BD Vacutainer Röhrchen ohne Gel) Körperflüssigkeiten 8 Gleichzeitige Abnahme anderer Körperflüssigkeiten 9 Lagertemperatur bis zum Gefrieren Plasma: EDTA (besser als Zitrat). (Röhrchentyp dokumentieren) Raumtemperatur vor, während und nach der Zentrifugation
Gefrieren Zentrifugation Kohortenstudie 10 Zentrifugieren: Serum: 1300 g, 10 min bei Raumtemperatur. CSF: 400g, 10 min bei Zimmertemperatur /1300g wenn keine Zellen konserviert werden sollen. Nach dem Zentrifugieren müssen die jeweiligen Proben zunächst in ein Gefäß zusammengeführt werden. 11 Zeitabstand zwischen Abnahme und Zentrifuieren und Gefrieren Optimal für Liquor: <1 Stunde Optimal für Serum: <1 Stunde Bei gleichzeitiger Abnahme: idealerweise 1 Stunde. Nach dem Zentrifugieren müssen die Proben aliquotiert, gefroren und bei -80ºC gelagert werden. 12 Aliquotröhrchen: Kleine Polypropylenröhrchen (1,1 ml) mit weißen Schraubverschlüssen (Integra Biosciences GmbH). 13 Aliquotierung: Mindestens 2 Aliquots. Die empfohlene Probenmenge von 10 ml sollte für mindestens 8 Aliquots reichen. 14 Aliquotmenge: 600 l. Die Röhrchen sollten zu 75% befüllt werden. 15 Kodierung: Eindeutige und gefrierfeste Beschriftung. Idealerweise Barcodes, um das Suchen zu erleichtern, für die Blindung der Analyse und zum Schutz der Privatsphäre der Patienten. Die uncodierten Röhrchen sowie vorbedruckte Codierungsetiketten werden den Zentren zur Verfügung gestellt. Nach Punktion sollen die Röhrchen mit der gleichen Codenummer mit fortlaufender Endziffer versehen werden. 16 Gefriertemperatur: -80ºC 17 Zusätzlich im Probenprotokoll Standort der Proben
zu erfassen: Kohortenstudie 18 Zusätzlich im Probenprotokoll Überwachung der Gefriergeräte zu erfassen: 19 Zusätzlich im Probenprotokoll zu erfassen: Aufteilung von Proben auf zwei oder mehr Gefriergeräte. Dokumentation in der Online-Datenbank neben MS-spezifischen Parametern: Gesamtzellzahl (Mono-nukleär) Erythrozyten Gesamteiweiß im Liquor und Serum Albumin im Liquor und Serum IgG im Liquor und Serum OCBs (incl Methode) [optional IgA und IgM im Liquor und Serum] [optional Zellphänotypisierung Liquor und Blut] [optional Blutbild]
Kohortenstudie Informationen zum Auftreten hämolytischer Blutproben Beispiele für Ursachen von Hämolyse: Endogen: - gehäuft bei Patienten mit Hämatomen - nach Zytostatikagabe - schwierige Venenverhältnisse Präanalytisch: - Blutentnahme aus dem Katheter - Lang andauernde Stauung - Traumatische Punktion (u.a. gebogene Nadel) - Desinfektionsmittel nicht getrocknet vor der Punktion - Starkes Schüttelnder Blutprobe - Starke Erschütterungen der Probe auf dem Transport (z.b. Rohrpos) - Lagerung bei zu hohen oder zu niedrigen Temperaturen - Übermäßiger Sog bei Blutentnahmen mit Aspirationstechnik Quelle: Informationsblatt Becton, Dickinson and Company Bei Fragen wenden Sie sich bitte an: S. Wirth, Klinikum rechts der Isar der TU München, Neurologie, biobank@lrz.tum.de, Tel.: 089/4140-4681
University Hospital Münster Neurology Clinic Dept. of Inflammatory diseases of the nervous system and Neurooncology Director: Univ.-Prof. Dr. Heinz Wiendl Standard Operating Procedure KKNMS_PBMC (Biobanking group) Isolation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) Version: 02 Gültig ab: 01.11.2012 Ersetzt Version: KKNMS 13.10.2010 Autoren: 28.09.2012 Dr. Anita Posevitz-Fejfár Verena Schütte Datum Geprüft durch: 01.10.2012 Dr. Anita Posevitz-Fejfár -biobank manager- Datum Genehmigt durch: 04.10.2012 Prof. Dr. Heinz Wiendl -head of clinic- Datum Anhänge: Anhang 1 Anhang 2 Bedienung/set-up der Zentrifugen Zellzählung Unterschrift Unterschrift Unterschrift
BB_PBMC_1 PBMC Isolation V02 1 Ziel der SOP Beschreibung der Verarbeitung von peripheren Blut mit dem Ziel der Isolation und Aufbewahrung von PBMC 2 Genehmigung der SOP für folgende Projekte Ø KKNMS Kohorte Ø KKNMS PPMS Ø KKNMS REGIMS Ø KKNMS B1 3 Hintergrund PBMC sind eine Gruppe von Blutzellen mit rundem Nukleus: Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen. Die Lymphozyten-Population besteht aus T-Zellen (ca. 75%), B-Zellen und NK-Zellen. Die Trennung von Blut in verschiedene Schichten wird mithilfe eines hydrophilen Polysaccharides (Ficoll, Lymphoprep) und eines Zentrifugationsschrittes durchgeführt. Die obere Plasma-Schicht wird von den PBMC s gefolgt. Die untere Fraktion enthält Zellen mit polymorphen Zellkern und Erythrozyten. 4 Geräte und Verbrauchsmaterialien Geräte Hersteller Kat. Nr. Sterilbank Scanlaf Mars 1800 Pipetten (10-100, 100-1000) Eppendorf 3120 000.046/.062 Pipetteboy AccuJet Pro Brand 26300 Zentrifuge Eppendorf 5810R Vacuum-Pumpe neolab 2-9335 Microskop Leica DM IL LED Mr. Frosty Nalgene 5100-0001 Freezer -80 C Sanyo MDF-U 3386 Cryo Tank CBS V3000AB Material 50 ml tube Corning 430829 15 ml tubes Corning 430791 Cryo tubes Nunc/Thermo Fischer 368632 Serlogische Pipette 25 ml Corning 4489 Pipette tips (100-1000 µl) Sarstedt 70.762 Pipette tips (10-200 µl) Sarstedt 70.760.002 0,2ul filter unit Millex GP SLGP033RS Syringe 10ml BD Neubauer Kammer-improved HBG Etiketten Roth X548.1 Reagenzien 1xPBS w/o Ca 2+, Mg 2+ PAA H15-002 Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Trypanblau Sigma T8154 CTL Cryo ABC kit C.T.L. CTLC-ABC 2-propanol Merck 1.09634.2500-2 von 7-01.10.2012
BB_PBMC_1 PBMC Isolation V02 5 Vorbereitung 5.1 Erwärmung von PBS, Lymphoprep und Gefriermedium (CTL) auf Raumtemperatur 5.2 Etiketten: geliefert aus Münster (Anita Posevitz-Fejfár, Tel.: 0251 83 46 813, anita.posevitz-fejfar@ukmuenster.de) oder selbst gedruckt. Kohorte Studie: Probenset-Nummer-01-701(-714) PPMS Studie: Probenset-Nummer-05-701(-714) Die Probensetnummer ist die gleiche wie auf der KKNMS-Box für München. 6 Durchführung Steril und bei Raumtemperatur arbeiten! 6.1 Poolen Sie den Inhalt der Blutröhrchen (Monovette oder Vacutainer) in einem 50ml Röhrchen (max 25ml). Waschen Sie das verbleibende Blut aus den Röhrchen mit PBS und fügen Sie es zu dem gepoolten Blut hinzu. 6.2 Fügen Sie 1xPBS (w/o Ca 2+, Mg 2+ ) zu dem 50ml Röhrchen mit dem gepoolten Blut hinzu bis ein 1:1-Verhältnis erreicht ist (max. 25ml). 6.3 Nehmen Sie ein neues 50ml Röhrchen und geben Sie 15ml Lymphoprep hinein. 6.4 Geben Sie 25ml der Blut-PBS-Mischung LANGSAM auf die Lymphoprep-Lösung. Stellen Sie dafür den Pipette-boy auf gravity oder slow Modus und halten Sie das Röhrchen mit dem Lymphoprep für die ersten 10ml in einem 30 Winkel, danach steigern Sie den Winkel langsam. 6.5 Zentrifugieren Sie mit 800g für 30 min, Raumtemperatur, langsame Beschleunigung, OHNE BREMSE Setzen Sie die Verarbeitung direkt nach der Zentrifugation fort! 6.6 Entnehmen Sie die ringförmige Interphase (PBMC) mit einer 10ml Pipette oder einer Pasteur-Pipette und geben Sie es in ein neues 50ml Röhrchen: vermeiden Sie, die Lymphoprep- Lösung unter der PBMC-Schicht aufzunehmen. Wenn das Blut in mehr als einem 50ml Röhrchen zentrifugiert wurde, entnehmen Sie die Interphase aus jedem Tube und geben Sie es in ein neues 50ml Röhrchen. Die Helligkeit der Ringphase ist Spender-abhängig. Das Volumen der entnommenen Ring-Phase beträgt normalerweise 5-15ml. Die Plasma-Schicht (über dem Ring) beschädigt die Zellen nicht und wird während der Waschschritte herausgewaschen. Das Lymphoprep (unterhalb des PBMC-Ringes) ist toxisch, daher muss beim Sammeln der PBMC s vermieden werden, Lymphoprep anzusaugen. - 3 von 7-01.10.2012
BB_PBMC_1 PBMC Isolation V02 6.7 Verdünnen Sie die PBMC s mit vorgewärmten 1xPBS (w/o Ca 2+, Mg 2+ ), indem Sie das Röhrchen auf 50ml auffüllen. 6.8 Zentrifugieren Sie mit 300g für 10min, bei Raumtemperatur, schnelle Beschleunigung, mit Bremse 6.9 Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1ml 1xPBS (w/o Ca 2+, Mg 2+ ). Füllen Sie danach das Röhrchen auf 50ml auf. 6.9.1 Zählen Sie die Zellen (Beschreibung: siehe Anhang 2) 6.10 Überführen Sie 100 Millionen (10x10 7 ) Zellen in ein 15ml Tube und zentrifugieren Sie es mit 300g für 10min bei Raumtemperatur. Falls weniger oder mehr als 10x10 7 Zellen vorhanden sind, passen Sie das Volumen der Gefrier-Lösung in den nächsten Schritten an. 6.11 Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5ml vorgewärmten CTL-Cryo C Medium. Passen Sie, falls nötig, das Volumen von Cryo C der Zellzahl proportional an: rechnen Sie mit 2x10 7 /ml (z.b.: 40 Millionen PBMCs in 2mL CTL-Cryo C Medium). 6.12 Pipettieren Sie die CTL-Cryo B Lösung tropfenweise in die CTL-Cryo A Lösung und filtern Sie die Mischung mit einem 0,2µm-Filter (in ein separates Röhrchen, nicht direkt auf die Zellen!). Falls sich Präzipitate (Flocken) gebildet haben, erwärmen Sie Lösung B im Wasserbad bis sich die Präzipitate aufgelöst haben (37 C). Wichtig: Das Volumen der Cryo AB Mischung muss äquivalent zu der PBMC/CryoC-Mischung sein. Falls weniger als 10x10 7 Zellen eingefroren werden, entstehen Reste der Cryo AB Mischung und der Cryo C Lösung. Sie können die AB-Mischung im Gefrierschrank bei -20 C bis zu einem Jahr lagern, die Mischung darf nur einmal aufgetaut werden. Lagern Sie Cryo C bei 4 C. 6.13 Fügen Sie die Cryo AB Mischung langsam und tropfenweise zu den Zellen (in CTL C resuspendierte PBMC). Damit sich die Lösungen gut vermischen, sollten Sie dabei das Röhrchen leicht drehen. 6.14 Aliquotieren Sie die PBMCs/Cryo ABC-Mischung in Cryo-Tubes: 1ml/Röhrchen. Die Zellzahl ist 10 Millionen (1x10 7 ) / Röhrchen. 6.15 Setzen Sie die Cryo-Röhrchen in einen Mr. Frosty und lassen Sie sie mindestens 48 Stunden bei -80 C gefrieren. 6.16 Überführen Sie die Cryo-Röhrchen nach 48 Stunden und innerhalb einer Woche in einen Cryo-Tank (Flüssig-Stickstoff, -195 C). 7 Referenzen - Das Format dieser SOP basiert auf der PZ-GE01-A1 (Version 01 vom 09.09.2010) Richtlinie vom TMF (Technology, Methods and Infrastructure for Networked Medical Research) - Weitere relevante Richtlinien: Note for Guidance on Good Clinical Practice (CPMP/ICH/135/95) Reflection paper for laboratories that perform the analysis or evaluation of clinical trial samples (EMA/INS/GCP/532137/2010; 28 February 2012) - https://iqa.center.duke.edu/modules/iqa_plabs/index.php?id=26 (homepage of Duke University School of Medicine, Immunology Quality Assessment): ACTG Presentations useful tips, videos - 4 von 7-01.10.2012
BB_PBMC_1 PBMC Isolation V02 8 Änderungen Änderungen im Vergleich zur vorherigen Version Section 6.5: Section 6.9: Anhang: Geschwindigkeit der Zentrifugation Volumen des PBS im Waschschritt 1-2 hinzugefügt - 5 von 7-01.10.2012
BB_PBMC_1 PBMC Isolation V02 BB_PBMC_1_V02_A1 Anhang 1 zu SOP KKNMS_PBMC_1_V02 (Biobanking group) Bedienung und Einstellen der Zentrifuge Hersteller: Eppendorf Type: 5810R Zentrifuge Rotor mit Einsätzen für 15ml und 50ml Röhrchen 1. Öffnen Sie den Deckel und platzieren Sie die Röhrchen in die Einsätze. Achten Sie darauf, dass die Zentrifuge korrekt ausbalanciert ist! 2. Einstellen der Temperatur: Drücken Sie temp. Wenn die Zahl blinkt, ändern Sie den Wert mithilfe der Knöpfe auf der rechten Seite. 3. Einstellen der Geschwindigkeit (rcf=g): Drücken Sie speed bis ein vor den Zahlen erscheint. Dies bedeutet die Anzeige in rcf (=g). Ändern Sie die Zahl mithilfe der Knöpfe. 4. Einstellen der Zeit: Drücken Sie time. Die Zahl zeigt Minuten, wenn kein Zeichen davor erscheint. Ändern Sie die Zahl mithilfe der Knöpfe. 5. Anpassen der Beschleunigung/Bremse: Drücken Sie time, bis das Zeichen für Beschleunigung/Bremse (U ) vor der Zahl erscheint. Für eine langsame Beschleunigung stellen Sie 0 ein, für eine schnelle Beschleunigung 9. Die Bremsstufe 0 entspricht dem freien Auslauf (keine Bremse) und die Bremsstufe 9 dem schnellsten Auslauf (Bremse eingeschaltet). 6. Starten Sie das Program 7. Öffnen Sie den Deckel, wenn das Programm abgelaufen ist und der open -Knopf blau - 6 von 7-01.10.2012
BB_PBMC_1 PBMC Isolation V02 BB_PBMC_1_V02_A2 Anhang 2 zu SOP KKNMS_PBMC_1_V02 (Biobanking group) Zellzählung 1. Mischen Sie 10µl Trypanblau mit 10µl Zellsuspension in einem Eppendorf-Tube. Die Zellen sollten innerhalb von 3-10 min nach dem Mischen mit Trypanblau gezählt werden, längere Inkubationszeiten führen zum Zelltod. 2. Platzieren Sie das Deckgläschen auf der Oberfläche der Zählkammer. 3. Nehmen Sie 10µl der Zell-Mischung und geben Sie sie in die Zählkammer. Neubauer-improved Kammer Platzieren Sie die Kammer unter dem Mikroskop und zählen Sie die Zellen im mittleren Quadrat (innerhalb der gelb markierten Fläche). Beispiel: Sie haben 80 Zellen in den 25 Quadraten gezählt. Dies heißt, dass Sie 8x10 7 (80 Mio) Zellen in dem 50ml Röhrchen haben. Berechnung: 80 x 2 (aufgrund der Verdünnung mit Trypanblau) x 10.000 = 1.600.000/ml 1.600.000 x 50ml (das Volumen der Zellsuspension) = 80x10 6 =8x10 7 Waschen und reinigen Sie die Neubauer Kammer und das Deckgläschen nach dem Zählen mit Wasser und Ethanol! - 7 von 7-01.10.2012