Prepito DNA Blood D250 Kit (Art.-Nr. D-2002)

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1 Prepito DNA Blood D250 Kit (Art.-Nr. D-2002) V Seite 1 / 11

2 Symbole 180 Kit enthält Reagenzien für 180 Isolierungen Informationen im Handbuch V Verfallsdatum Chargennummer In-vitro Diagnostikum Temperaturbeschränkungen D-2002 chemagen Biopolymer-Technologie Aktiengesellschaft Arnold-Sommerfeld-Ring 2 D Baesweiler Tel.: Verwendungszweck Mit dem Prepito DNA Blood D250 Kit werden Nukleinsäuren aus humanem Vollblut zum nachfolgenden Einsatz in der In-vitro Diagnostik isoliert und aufgereinigt. Das Kit ist für die automatisierte Durchführung mit dem chemagic Prepito zu verwenden. Das Produkt ist ausschließlich durch Personal anzuwenden, das im Umgang mit Nukleinsäureseparations- und Amplifikationstechniken geschult ist. Um das Risiko einer negativen Auswirkung auf die Ergebnisse der diagnostischen Tests zu minimieren, sollten bei der Nukleinsäure-Isolierung und in den anschließend durchgeführten Nachweisreaktionen geeignete Kontrollen mitgeführt werden. Alle diagnostischen Ergebnisse, die mit Hilfe dieser Probenvorbereitungsmethode in Verbindung mit nachfolgenden diagnostischen Tests gewonnen werden, sollten nur zusammen mit anderen klinischen und/oder labormedizinischen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. V Seite 2 / 11

3 Inhalt Symbole...2 Verwendungszweck...2 Funktionsprinzip...4 Qualitätskontrolle...4 Anwendungseinschränkungen...4 Haltbarkeit und Lagerung...4 Protokolldauer...4 Typische Ausbeuten...4 Inhalt pro Verpackungseinheit (entspr. 180 Isolierungen aus 250 µl Blut)...5 Sicherheitshinweise...6 Vom Anwender bereitzustellende Reagenzien und Ausrüstung...7 Aufreinigungsprotokoll für den chemagic Prepito...7 Positionierung von Deep-Well Platte und chemagic Tip & Tube Rack...7 Protokoll-Schritte (chemagic Prepito Seriennummern 1 99)...8 Protokoll-Schritte (chemagic Prepito Seriennummern 100)...9 Allgemeine Anmerkungen...10 UV-Messung...10 Troubleshooting...11 V Seite 3 / 11

4 Funktionsprinzip Das Prepito DNA Blood D250 Kit basiert auf chemagens patentrechtlich geschützter Magnetpartikel- Technologie. Im Isolierungsprozess werden Blutproben zunächst chemisch aufgeschlossen. Die freigesetzten Nukleinsäuren binden an kleine magnetisierbare Partikel, die anschließend magnetisch aus dem aufgeschlossenen Blut isoliert werden. In weiteren Schritten werden enthaltene Verunreinigungen ausgewaschen und die Nukleinsäuren in ein Elutionsmedium überführt. Durch die automatisierte Prozessführung mit dem chemagic Prepito werden Kreuzkontaminationen ausgeschlossen und eine sichere Handhabung potentiell infektiöser Probenmaterialien gewährleistet. Qualitätskontrolle Jede Charge ist gemäß chemagens umfassendem Qualitätssicherungssystem getestet. Vorgehensweisen, die von den im Handbuch beschriebenen Vorgaben abweichen, können zu unzureichenden Ergebnissen führen. Anwendungseinschränkungen Das Kit ist zur Verwendung mit humanem Vollblut vorgesehen und nicht für den Einsatz von Plasma-, Serum- oder Gewebeproben bestimmt. Für sonstige Probenmaterialien liegen keine Daten bezüglich der Isolierungseffizienz vor. Haltbarkeit und Lagerung Die Verfallsdaten sind auf der Verpackung und auf den Komponenten des Kits angezeigt. Alle Kit-Komponenten werden im Lieferzustand bei Raumtemperatur gelagert. Gelöste Protease muss bei 4 C gelagert werden. Unter diesen Bedingungen hat die Protease-Lösung eine Haltbarkeit von 6 Wochen. Zur Langzeitaufbewahrung muss die Protease-Lösung aliquotiert und bei -20 C gelagert werden. Einmal aufgetaute Protease-Lösungen dürfen nicht wieder eingefroren werden. Protokolldauer Die Dauer des automatisierten Aufreinigungsprotokolls beträgt 60 Minuten. Typische Ausbeuten Aus 250 µl Vollblut werden zwischen 5-10 µg DNA aufgereinigt. Das Elutionsvolumen beträgt 200 µl. Die erhaltenen Ausbeuten sind von der Anzahl der Leukozyten im Probenmaterial abhängig und variieren von Probe zu Probe. V Seite 4 / 11

5 Inhalt pro Verpackungseinheit (entspr. 180 Isolierungen aus 250 µl Blut) 1. Magnetic Beads 30 ml 2. Lysis Buffer 1*: 120 ml Guanidinhydrochlorid %, Triton X % 3. Binding Buffer 2*: 240 ml Tris-HCl-Puffer, Sorbitansesquioleat 2 3 %, Natriumperchlorat %, Ethanol % 4. Wash Buffer 3*: 200 ml Tris-HCl-Puffer, Guanidinhydrochlorid 3 5 %, Natriumperchlorat %, Ethanol % 5. Wash Buffer 4*: 200 ml Tris-HCl-Puffer, Sorbitansesquioleat <1 %, Natriumperchlorat %, Ethanol % 6. Wash Buffer 5*: 200 ml Ethanol % 7. Wash Buffer 6*: 200 ml 8. Elution Buffer 7*: 80 ml 10 mm; Tris-HCl-Puffer ph 8,0 9. Protease: 2.0 ml 10. Disposable Tips: 180 Stück ml Deep-Well Platten: 15 Stück 12. 0,75 ml Reaktionsgefäße: 360 Stück 13. 0,75 ml Verschlusskappen: 180 Stück *Umverpackt im chemagic 8-Pack V Seite 5 / 11

6 Sicherheitshinweise Tragen Sie zum sicheren Umgang mit Chemikalien immer Schutzbrille, Einmal-Schutzhandschuhe und einen Laborkittel. Im Sicherheitsdatenblatt (MSDS) sind die Sicherheitsinformationen ausführlich beschrieben. Reagenz 1: Magnetic Beads, keine gefährlichen Inhaltsstoffe Reagenz 2: Lysis Buffer 1 Guanidin-Hydrochlorid CAS No EC No Xn R22-36/38, S2-22 Triton X-100 CAS No EC No. R22-41 S Reagenz 3: Binding Buffer 2 Sorbitan Sesquioleate CAS No R36/37/38, S23-24/25 Sodium Perchlorate CAS No EC No , Xn R9-22, S Ethanol CAS No EC No , F R11, S7-16 Reagenz 4: Wash Buffer 3 Ethanol CAS No EC No , F R11, S7-16 Guanidin-Hydrochlorid CAS No EC No Xn R22-36/38, S2-22 Sodium Perchlorate CAS No EC No , Xn R9-22, S Reagenz 5: Wash Buffer 4 Ethanol CAS No EC No , F R11, S7-16 Sorbitan Sesquioleate CAS No R36/37/38, S23-24/25 Sodium Perchlorate CAS No EC No , Xn R9-22, S Reagenz 6: Wash Buffer 5 Ethanol CAS No EC No , F R11, S7-16 Reagenz 7: Wash Buffer 6, keine gefährlichen Inhaltsstoffe Reagenz 8: Elution Buffer 7, keine gefährlichen Inhaltsstoffe Reagenz 9: Protease CAS No EC No , Xn R36/37/38-42/43 S /37/39 46 V Seite 6 / 11

7 Vom Anwender bereitzustellende Reagenzien und Ausrüstung chemagic Prepito, Einmal-Schutzhandschuhe, Pipetten und Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere, Aqua dest. Aufreinigungsprotokoll für den chemagic Prepito Das Protokoll ist für die gleichzeitige Bearbeitung von 1-12 Proben geeignet (s.u. Protokoll-Schritte). (Ausführliche Informationen zum Umgang mit dem chemagic Prepito entnehmen Sie dem Handbuch). Arbeiten, die vor dem Beginn des automatisierten Isolierungsprozesses durchzuführen sind: Prüfen Sie die Kit-Bestandteile nach der Lieferung auf Beschädigungen. Im Falle von Beschädigungen wenden Sie sich an den zuständigen Lieferanten. Verbinden Sie die Schläuche des chemagic Prepito entsprechend ihrer Nummerierung mit den entsprechenden Positionen der einzelnen Pufferflaschen im chemagic 8-Pack. Entfernen Sie dazu die Abrisslaschen der Pufferflaschen und durchstechen Sie die Septen mit den an den Schläuchen befestigten Spikes. Hängen Sie das chemagic 8-Pack kopfüber in den Reagenzienhalter. Befüllen Sie das Abfüllsystem über die manuelle Priming-Funktion (siehe Handbuch chemagic Prepito). Sie erhalten die benötigte Protease-Lösung indem Sie die lyophilisierte Protease in Aqua dest. pro Vorratsgefäß lösen. Die entsprechende Volumeninformation ist auf dem Gefäß angegeben. Positionierung von Deep-Well Platte und chemagic Tip & Tube Rack Das nachfolgende Schema zeigt die Anordnung der 96er Deep-Well Platte und des chemagic Tip & Tube Rack. Ausführliche Informationen befinden sich unter dem entsprechenden Punkt Protokoll- Schritte (s.u.). Rückseite 96er - deep well plate Probenposition Tip and Tube Rack Pos. 4 Pos. 3 zusätzliche Disposable Tip Position für Sonderprotokolle Disposable Tips Pos. 2 Reaktionsgefäße mit M-PVA Magnetic Beads Pos. 1 Elutionsposition Vorderseite V Seite 7 / 11

8 Protokoll-Schritte (chemagic Prepito Seriennummern 1 99) 1. Schalten Sie den chemagic Prepito ein und warten Sie den Selbsttest des Gerätes ab. 2. Drücken Sie die [change protocol]-taste. 3. Wählen Sie das Prepito Blut DNA D250 Kit-Protokoll durch Drücken der [Blood 250]-Taste aus. 4. Geben Sie den vierstelligen Zugangscode [1458] ein und drücken Sie die [enter]-taste. 5. Drücken Sie zur Bestätigung die [enter]-taste. 6. Lesen Sie die Protokollinformationen im erscheinenden Informationsfenster. Bestätigen Sie durch Drücken der [continue]-taste. 7. Wählen Sie die vorgesehenen Probenpositionen aus und bestätigen Sie die Auswahl durch Drücken der [continue]-taste. 8. Lesen Sie mit dem Barcode-Scanner den Kit Barcode ein. Bestätigung Sie dies mit der [ok]- Taste. 9. Zur Registrierung der Proben und Aufbewahrungsgefäße für die Eluate drücken Sie die [yes]-taste. Folgen Sie den Anweisungen des Eingabefensters und geben Sie die Barcodes der Proben und der Aufbewahrungsgefäße ein. 10. Bestücken Sie das chemagic Tip & Tube Rack mit den benötigten Materialien (s.o. Positionierung von Deep-Well Platte und chemagic Tip & Tube Rack). Pro Probenposition benötigen Sie ein leeres 0,75 ml Reaktionsgefäß (Position 1), ein mit 150 µl Magnetic Beads- Suspension befülltes 0,75 ml Reaktionsgefäß (Position 2) und ein Disposable Tip (Position 3).! Schütteln Sie das Gefäß mit den Magnetic Beads bis alle Magnetic Beads vollständig resuspendiert sind. Eine nicht vollständige Resuspension der Magnetic Beads kann zu verringerten Ausbeuten von Nukleinsäuren führen. 11. Geben Sie je 10 µl Protease-Lösung in die Probenposition der Deep-Well Platte. 12. Geben Sie je 250 µl Blutprobe in die mit Protease-Lösung befüllte Probenposition.! Eine 5 Minuten überschreitende Inkubationsdauer der Blut/Proteasemischung kann zu verringerten Ausbeuten und Reinheiten der extrahierten DNA führen. Die folgenden Protokollschritte sind daher unverzüglich nach Zugabe der Blutproben auszuführen. 13. Ein Informationsfenster zeigt die zuvor ausgewählten Probenpositionen an. Vergleichen Sie die Positionen des chemagic Tip & Tube Rack und der Proben in der Deep-Well Platte mit der Vorgabe. Stellen Sie die Deep-Well Platte auf die Arbeitsplattform. Bestätigen Sie durch Drücken der [continue]-taste. 14. Stellen Sie das chemagic Tip & Tube Rack in die vorgegebene Position auf der Arbeitsplattform. Kontrollieren Sie Deep-Well Platte und chemagic Tip & Tube Rack auf korrekten Sitz. Fixieren Sie die Deep-Well Platte und das chemagic Tip & Tube Rack durch Schließen des Sicherungsbügels auf der Arbeitsplattform. 15. Schließen Sie die Fronttüre und starten Sie den Isolierungsprozess unverzüglich durch Drücken der [start]-taste. V Seite 8 / 11

9 Protokoll-Schritte (chemagic Prepito Seriennummern 100) 1. Schalten Sie den chemagic Prepito ein und warten Sie den Selbsttest des Gerätes ab. 2. Drücken Sie die [Change Protocol]-Taste. 3. Drücken Sie die [Blood]-Taste im Protokollgruppenfenster (Select Protocol Group). 4. Wählen Sie das Prepito Blut DNA D250 Kit-Protokoll durch Drücken der [Blood 250]-Taste aus und bestätigen Sie dies durch Drücken der [OK]-Taste. 5. Bestätigen Sie die Protokollauswahl im Protokollgruppenfenster (Select Protocol Group) durch Drücken der [OK]-Taste. 6. Geben Sie den vierstelligen Zugangscode [1758] ein und drücken Sie die [Enter]-Taste. 7. Drücken Sie die [Start Process]-Taste. 8. Lesen Sie die Protokollinformationen im erscheinenden Informationsfenster und bestätigen Sie dies durch Drücken der [Continue]-Taste. 9. Wählen Sie die vorgesehen Probenpositionen aus und bestätigen Sie die Auswahl durch Drücken der [OK]-Taste. 10. Lesen Sie mit dem Barcode-Scanner den Kit Barcode ein. Bestätigung Sie dies mit der [OK]- Taste. 11. Zur Registrierung der Proben und Aufbewahrungsgefäße für die Eluate drücken Sie die [Yes]-Taste. Folgen Sie den Anweisungen des Eingabefensters und geben Sie die Barcodes der Proben und der Aufbewahrungsgefäße ein 12. Bestücken Sie das chemagic Tip & Tube Rack mit den benötigten Materialien (s.o. Positionierung von Deep-Well Platte und chemagic Tip & Tube Rack). Pro Probenposition benötigen Sie ein leeres 0,75 ml Reaktionsgefäß (Position 1), ein mit 150 µl Magnetic Beads- Suspension befülltes 0,75 ml Reaktionsgefäß (Position 2) und ein Disposable Tip (Position 3).! Schütteln Sie das Gefäß mit den Magnetic Beads bis alle Magnetic Beads vollständig resuspendiert sind. Eine nicht vollständige Resuspension der Magnetic Beads kann zu verringerten Ausbeuten von Nukleinsäuren führen. 13. Geben Sie je 10 µl Protease-Lösung in die Probenposition der Deep-Well Platte. 14. Geben Sie je 250 µl Blutprobe zu der mit Protease-Lösung befüllten Probenposition.! Eine 5 Minuten überschreitende Inkubationsdauer der Blut/Proteasemischung kann zu verringerten Ausbeuten und Reinheiten der extrahierten DNA führen. Die folgenden Protokollschritte sind daher unverzüglich nach Zugabe der Blutproben auszuführen. 15. Ein Informationsfenster zeigt die zuvor ausgewählten Probenpositionen an. Vergleichen Sie die Positionen des chemagic Tip & Tube Rack und der Proben in der Deep-Well Platte mit der Vorgabe. Stellen Sie die Deep-Well Platte auf die Arbeitsplattform. Bestätigen Sie dies durch Drücken der [Continue]-Taste. V Seite 9 / 11

10 16. Stellen Sie das chemagic Tip & Tube Rack in die vorgegebene Position auf der Arbeitsplattform. Kontrollieren Sie Deep-Well Platte und chemagic Tip & Tube Rack auf korrekten Sitz. Fixieren Sie die Deep-Well Platte und das chemagic Tip & Tube Rack durch Schließen des Sicherungsbügels auf der Arbeitsplattform. 17. Schließen Sie die Fronttüre und starten Sie den Isolierungsprozess unverzüglich durch Drücken der [Start]-Taste. Allgemeine Anmerkungen Es wird ausdrücklich empfohlen, die isolierten Nukleinsäuren umgehend in eine nachfolgende Anwendung einzusetzen. Werden die isolierten Nukleinsäuren nicht umgehend nach der Präparation verwendet, lagern Sie die Extrakte max. 1 Tag bei 4 C ansonsten bei mind. -20 C oder bevorzugt bei -70 C. Der im Kit enthaltene Elution Buffer ist 10 mm Tris-HCl-Puffer/pH 8.0. UV-Messung In einigen Fällen können Spuren von Magnetic Beads in den Eluaten verbleiben. Verbleibende Magnetic Beads stören in den meisten Nachfolgeanwendungen nicht, können jedoch das Hintergrundsignal einer UV-Messung verstärken. In diesem Fall wird eine Nachseparation der im Elution Buffer verbliebenen Magnetic Beads durch einen manuellen Magnetseparator (z.b. chemagic Stand 2x12, Art.-Nr.: 300) empfohlen. V Seite 10 / 11

11 Troubleshooting Problem Mögliche Ursache Empfehlung/Problemlösung Unzureichende DNA-Ausbeute Kontaminierte oder inaktive Protease Nachfolgende Untersuchungsreaktionen funktionieren mit der aufgereinigten DNA nicht optimal. Der Quotient der Absorptionen A 260/A 280 ist zu niedrig. Funktionsstörung des Gerätes Eine fehlerhafte Menge an Magnetic Beads wurde zugegeben. Die Puffer im chemagic 8-Pack sind nicht mit dem Gerät verbunden. Das chemagic 8-Pack wurde nicht korrekt auf dem Reagenzienhalter positioniert. Die Schläuche der Abfülleinheit wurden nach dem Anschluss des chemagic 8-Pack nicht befüllt. Die Puffer im chemagic 8-Pack sind leer. Die Puffer im chemagic 8-Pack sind fehlerhaft mit den Anschlüssen am chemagic Prepito verbunden. Unzureichende Mengen an Puffer abgefüllt. Blutproben vor der Probenentnahme nicht gründlich durchmischt. Sichtbares mikrobielles Wachstum in der Proteaselösung Fehlerhafte Lagerung der Proteaselösung. Zu wenig DNA in der nachfolgenden Reaktion eingesetzt. Zu viel DNA in der nachfolgenden Reaktion eingesetzt. Im Elutionspuffer verbliebene Magnetic Beads verfälschen das Ergebnis der Absorptionsmessung. z.b. mechanische, elektrische oder elektronische Probleme Resuspendieren Sie die Magnetic Beads sorgfältig vor der Zugabe *Verbinden Sie die Puffer im chemagic 8-Pack mit dem Gerät. *Positionieren Sie das chemagic 8- Pack korrekt auf dem Reagenzienhalter. *Befüllen Sie die Schläuche des Abfüllsystems mit der Primingfunktion. *Tauschen Sie das chemagic 8-Pack aus. Verwenden Sie das chemagic 8-Pack nicht über die Anzahl der vorgesehen Präparationen hinaus. *Kontrollieren und korrigieren Sie den Anschluss der Puffer am chemagic Prepito/chemagic 8-Pack. *Kontrollieren Sie die Kalibrierung der Pumpen. Durchmischen Sie die Blutproben vor der Probenentnahme gründlich. Benutzen Sie steriles Wasser zum Lösen der Protease. Lagern Sie die Proteaselösung bei 4 C Verwahren Sie die Aliquots bei -20 C. Benutzen Sie die Lösung nicht länger als 6 Wochen. Frieren Sie einmal aufgetaute Protease- Lösung nicht wieder ein. Bestimmen Sie photometrisch den Gehalt an isolierter DNA und setzen Sie eine geeignete Menge in der Untersuchungsreaktion ein. Führen Sie eine Nachseparation der im Elutionspuffer verbliebenen Magnetic Beads an einem manuellen Separator (z.b. chemagic Stand 2x12, Art.- Nr.: 300) durch. Nehmen Sie zu chemagen oder dem zuständigen Vertriebspartner Kontakt auf. *Ausführliche Informationen gibt das Handbuch des chemagic Prepito. V Seite 11 / 11