Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene FTIR-Spektroskopie in der klinischen Mikrobiologie Erste Erfahrungen Dr. J. Liese MALDI Biotyper Anwendertreffen Bremen 23. November 2017
Warum Typisierung? Identifizierung von Übertragungsereignissen und Erregerquellen Über Speziesidentifizierung hinaus z.b. multiresistente Stämme
Dunkle Materie der Epidemiologie im Krankenhaus Antibiotika-empfindliche Stämme? Übertragungen? Endemische Krankenhausstämme?
Typisierung: Parameter Zeit Probenvorbereitung, Analysendauer, Auswertung Auflösung Subspezies, Serogruppen, clonal complexes, Sequenztypen Kosten pro Isolat, Gerät
Typisierungsverfahren nicht DNA-basiert DNA-basiert Serotypisierung Pulsfeld Gelelektrophorese (PFGE) Phagentypisierung rep-pcr Resistotyping Single locus sequence typing (SLST) Metabolic typing Multilocus sequence typing (MLST) MALDI-TOF cgmlst, wgmlst FTIR-Spektroskopie Whole genome sequencing (WGS) Spektrum-basierte Typisierung
Fourier-Transform Infrarot (FTIR) Spektroskopie SP SP Q Pr D
Fourier-Transform Infrarot (FTIR) Spektroskopie Absorption von Infrarotlicht (Energie) durch chemische Bindungen Spektrum als Abbild der chemischen Zusammensetzung z.b. Veränderung in der Zusammensetzung von bakt. Zellwand oder Kapsel Anwendung in der Mikrobiologie: - Speziesidentifizierung von Bakterien - v.a. in Veterinär- und Lebensmittelmikrobiologie
Typisierung mit FTIR-Spektroskopie Erreger Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Acinetobacter baumannii Escherichia coli Yersinia enterocolitica Campylobacter spp. Salmonella enterica Referenz Johler et al. (2016) Syst Appl Microbiol Fetsch et al. (2014) Int J Food Microbiol Grunert et al. (2013) J Clin Microbiol Bertsch et al. (2013) Int J Syst Evol Microbiol Sousa et al. (2014) J Photochem Photobiol Dawson et al. (2014) Eur J Clin Micrbiol Infect Dis Sousa et al. (2013) Sci Rep Davis et al. (2012) Food Microbiol Kuhm et al. (2009) Appl Environ Microbiol Mouwen et al. (2005) Appl Environ Microbiol Preisner et al. (2010) Appl Environ Microbiol
FTIR: Analyse 1300 cm -1 800 cm -1 Summenspektren (technische oder biologische Replikate) Differenz als Maß der Ähnlichkeit der Spektren Clustering oder Vergleich mit Datenbank
Clustering cutoff Ähnlichkeitsmatrix (z.b. Euklidische Distanz) Clustering-Algorithmen (z.b. hierarchisch: single linkage, Ward)
Kongruenz von Typisierungsverfahren Adjusted Wallace Coefficient (AWC) Adjusted Rand Index (ARI) A B C D 1 10 2 10 3 10 4 10 A B C D 1 10 2 10 3 1 8 1 4 5 5 A B C D 1 2 3 3 2 2 3 2 2 3 3 2 2 3 3 4 3 3 2 2 ARI = 1.0; AWC = 1.0 ARI = 0.658; AWC = 0.630 ARI = 0; AWC = 0
FTIR: Workflow Standardisierte Wachstumsbedingungen (Agar, Temperatur, Dauer)
FTIR: Workflow Silikat-Probenträger nach Trocknen
FTIR: Workflow Software: Isolatmanager und Analyse
FTIR: Workflow Software: Auswertung
Klebsiella pneumoniae 38 Isolate aus Neonatologie-Screening Rep-PCR (Diversilab) als Referenz MALDI Spezifische MALDI peaks FTIR Spektroskopie
Klebsiella pneumoniae 8 rep-pcr cluster 7 FTIR cluster AWC: 0.883 ARI: 0.872 Reproduzierbar in verschiedenen Laboren
Enterobacter aerogenes
Piperacillin Piperacillin+Tazobactam Cefotaxim Ceftazidim Cefepim Cefpodoxim Imipenem Meropenem Enterobacter aerogenes 17 besiedelte Neugeborene über 2 Monate Aufnahmestopp, Kohortierung Isolate teilweise mit variabler Koloniemorphologie und (phänotypischer) Resistenz S S S S S S S S I S S S S S S S I I S S S R S S R R R R S R S S R R S S S R S S R R R R I R S S R R R I S R S S R S I I S R S S R S I S S R S S R R S R S R S S
Enterobacter aerogenes FTIR Spektroskopie - 4 techn. Replikate - 3 biol. Replikate 2 oder 3 Cluster???
Enterobacter aerogenes rep-pcr * * * * unrelated isolates
Enterobacter aerogenes Whole genome sequencing 2 Stämme: Abstand >20000 SNPs Cl. 1: 5 Kinder; Cl. 2: 12 Kinder keine Doppelbesiedlungen
WGS cluster Pseudomonas aeruginosa 36 Isolate (WGS) von Patienten und der Patientenumgebung FTIR cluster 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 Total A 1 1 B 1 1 C 2 1 3 D 2 1 3 E 1 1 F 2 2 G 9 9 H 2 2 I 1 1 J 1 1 K 1 1 2 L 1 1 M 1 1 N 2 2 O 1 1 P 1 1 2 Q 2 2 R 1 1 Total 1 2 2 1 2 2 1 1 1 11 1 2 2 1 1 1 1 1 2 36 Adjusted Wallace coefficient: 0.651 (0.320-0.982)
Pseudomonas aeruginosa 167 konsekutive Blutkulturisolate Ganzgenomsequenzierung und SNP-basierte Phylogenie M. Willmann
Pseudomonas aeruginosa paarweiser Vergleich von core genome-snps
Pseudomonas aeruginosa Ähnlichkeit der Einzelspektren - je 4 technische Replikate: 93,4% ± 3,9% - je 3 biologische Replikate: 90,8% ± 5,8%
Pseudomonas aeruginosa FTIR: paarweiser Vergleich der Summenspektren
Pseudomonas aeruginosa 0-200 SNPs: 80.8% >18000 SNPs: 55.6%
Pseudomonas aeruginosa ST-308 M. Willmann
Pseudomonas aeruginosa FTIR Spektroskopie: Distanz innerhalb ST-308: 83,0% außerhalb: 44,5%
VRE: FTIR vs. WGS 77 Stämme (WGS vorhanden) FTIR similarity vs. core genome SNP difference Similarity TechRepl: 92,9% ± 2,8% Similarity BiolRepl: 90,5% ± 6,8% 0-20 SNPs: 86.4% >20 SNPs: 75.0% within outside ST ST ST-117 86,8% 75,7% ST-17 75,9% 73,0% ST-192 73,0% 73,7% ST-80 77,4% 74,8% ST-202 74,9% 71,8% ST-203 89,6% 71,4%
ST-117 ST-17 ST-192 ST-80 VRE: Künstliches Neuronales Netzwerk
Klebsiella oxytoca Mikrobiologisches Neonatologie-Screening Übertragungen sind von Zimmerbelegung abhängig
Klebsiella oxytoca: FTIR
09.07.2017 10.07.2017 11.07.2017 12.07.2017 13.07.2017 14.07.2017 15.07.2017 16.07.2017 17.07.2017 18.07.2017 19.07.2017 20.07.2017 21.07.2017 22.07.2017 23.07.2017 24.07.2017 25.07.2017 26.07.2017 27.07.2017 28.07.2017 29.07.2017 30.07.2017 31.07.2017 01.08.2017 02.08.2017 03.08.2017 04.08.2017 05.08.2017 06.08.2017 07.08.2017 08.08.2017 09.08.2017 10.08.2017 11.08.2017 12.08.2017 13.08.2017 14.08.2017 15.08.2017 16.08.2017 17.08.2017 18.08.2017 19.08.2017 20.08.2017 21.08.2017 22.08.2017 23.08.2017 24.08.2017 25.08.2017 26.08.2017 27.08.2017 28.08.2017 29.08.2017 30.08.2017 31.08.2017 01.09.2017 02.09.2017 03.09.2017 04.09.2017 05.09.2017 06.09.2017 07.09.2017 08.09.2017 09.09.2017 10.09.2017 11.09.2017 12.09.2017 13.09.2017 14.09.2017 15.09.2017 16.09.2017 17.09.2017 18.09.2017 19.09.2017 20.09.2017 21.09.2017 22.09.2017 23.09.2017 24.09.2017 25.09.2017 26.09.2017 27.09.2017 28.09.2017 29.09.2017 30.09.2017 01.10.2017 02.10.2017 03.10.2017 04.10.2017 05.10.2017 06.10.2017 07.10.2017 08.10.2017 09.10.2017 10.10.2017 Klebsiella oxytoca: Timeline (K) A A A O O O P P P M G G G G G G G G G G G R C H/Q Q G G B B B B B E D D D J B F F N N (K) N (K) N L K P P S
Real-Time Surveillance? Routinemäßige Typisierung aller Isolate (oder Gruppen) (z.b. multiresistente Erreger) Identifizierung von Transmissionsclustern oder endemischen Stämmen im Krankenhaus Angepasste Präventionsmaßnahmen FTIR als Screening für andere Typisierungsverfahren (z.b. WGS)?
Real-Time Surveillance? Identifizierung Antibiogramm (Vorläufige) Typisierung Mikrobiologischer Befund Stationsbelegungsdaten Isolat-Datenbank Hinweis für Krankenhaushygiene
Zusammenfassung FTIR-Spektroskopie: Analyse der chemischen Zusammensetzung eines Bakterienisolats Vergleich von FITR-Spektren möglich Einfache und günstige Methode der Erregertypisierung Robuste Validierung gegen Referenzmethoden notwendig
Danke! UK Tübingen Angelina Röchner Ariane Dinkelacker Sebastian Grashorn Sophia Vogt Matthias Marschal Silke Peter Matthias Willmann Ingo Autenrieth CVUA Fellbach Jörg Rau Bruker Daltonics GmbH Dr. Jan Liese Institut für Med. Mikrobiologie und Hygiene Universitätsklinikum Tübingen jan.liese@med.uni-tuebingen.de Norman Mauder Markus Kostrzewa