Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

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David Schenck
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1 Troubleshooting Ni-NTA-Agarose Index 1. Probleme und Lösungsvorschläge PROBENAPPLIKATION ADSORPTIONSSCHRITT ELUTIONSSCHRITT Sonstiges Wichtige Informationen Gewährleistung Related Products...6 Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

..4 2. Sonstiges...5 2.1 Wichtige Informationen...5 2.2 Gewährleistung.

2 1. Probleme und Lösungsvorschläge Im Folgenden sind mögliche Ursachen für Probleme aufgelistet, die während der Durchführung des Aufreinigungsprotokolls mit Biomolekülen auftreten können. Falls ihr spezifisches Problem nicht aufgelistet sein sollte, können sie gerne unser Team über die auf unseren Webseiten veröffentlichten Kontaktadressen um Rat fragen. Die folgenden Tabellen beschreiben die für jeden Arbeitsschritt charakteristischen Probleme, welche zu mangelnder Leistungsfähigkeit des Systems führen können. 1.1 PROBENAPPLIKATION BEOBACHTUNG MÖGLICHE URSACHEN EMPFEHLUNG PROBENLÖSUNG IST HOCHVISKOS SEHR VERDÜNNTE ODER HOCH KONZENTRIERTE PROBEN Anwesenheit von DNA in der Probe. Anwesenheit von unlöslichem Material in der Probe/im Lysat Sehr stark verdünnte Probe. Sehr hoch konzentrierte Probe. Erhöhen Sie die Ultraschallbehandlungsdauer Zentrifugieren oder filtrieren Sie (0.45 µm Membran) die Probe, um Verstopfung der Säule zu verweiden Es ist vorteilhaft, die Probe vor dessen Aufreinigung aufzukonzentrieren. Oder führen sie einen Adsorptionsschritt im Batchverfahren durch und packen ihre Säule mit dem resultierenden Ni- NTA-Agarose-Material. Es ist vorteilhaft, die Probe vor dessen Aufreinigung zu verdünnen. 1.2 ADSORPTIONSSCHRITT BEOBACHTUNG MÖGLICHE URSACHEN EMPFEHLUNG DAS ZIELPROTEIN BINDET NICHT AN DIE AGAROSE Der His-Tag liegt nicht vor bzw. wurde zerstört. His-Tag liegt nicht an exponierter Stelle (Unerreichbarkeit). Prüfen Sie dies nach. Falls eine Zerstörung des His-Tags vorliegen sollte, führen Sie die Aufreinigung bei niedrigerer Temperatur (z.b. bei 4 C) durch. Zudem sollten Sie versuchen, die Zeit des Aufreinigungsschrittes zu verringern. Fügen Sie Proteaseinhibitoren zu (siehe Tabelle über die chemische Stabilität der Ni-NTA-Agarose). Reinigen Sie unter denaturierenden Bedingungen auf oder fügen Sie den His-Tag an anderer Stelle im Protein ein (z.b. N-terminal, C-terminal oder sogar an beiden Positionen). 2 Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

Die folgenden Tabellen beschreiben die für jeden Arbeitsschritt charakteristischen Probleme, welche zu mangelnder Leistungsfähigkeit des Systems führen können. 1.

3 DAS ZIELPROTEIN BINDET NUR PARTIELL AN DER AGAROSE Unzureichende Bindungsbedingungen. Die Kapazität der Säule ist überschritten. Das Harz wurde schon mehrere Male für Aufreinigungen benutzt. Dies führt im Regelfall zu einer Minderung der Bindungskapazität, welche von Fall zu Fall unterschiedlich und von der Anzahl der Aufreinigungen abhängig ist. Verlust von Metallionen am Harz. Der His-Tag befindet sich nicht an optimal exponierter Stelle. Schwache Proteinexpression Das Fusionsprotein bildet sog. Inclusion Bodies aus. Es haben sich Kanäle in der Säule gebildet, durch die die Probe hauptsächlich fließt. Prüfen Sie die Zusammensetzung des Bindungspuffers sowie dessen ph-wert. Falls zum Bindungsschritt Imidazol eingesetzt wurde, verringern Sie dessen Konzentration bzw. eliminieren Sie das Agens vollständig. Verifizieren Sie, ob während des Bindungsschritts eingesetzte Reagenzien mit der Bindungsreaktion interferieren können im Zweifelsfall sollte die Agarose für eine erneute Aufreinigungsprozedur regeneriert werden. Geben sie weniger Fusionsprotein auf die Säule. Reinigen sie das Harz wie im Handbuch angegeben oder verwenden sie frisches Material. Führen Sie einen Regenerationsschritt gemäß Angaben im Manual an der Säule durch. Vermeiden sie die Verwendung von chelatisierenden und reduzierenden Agenzien. Vermindern Sie die Flussrate oder führen Sie eine Adsorption im Batchverfahren durch. Damit erhöhen Sie die Kontaktzeit zwischen His-Tag und dem Harz. Beachten Sie: Dieses Problem kann in der Regel über denaturierende Bedingungen vermieden werden. Optimieren Sie die bakteriellen Expressionsbedingungen. Modifizieren Sie die Wachstumsbedingungen für die Bakterien. Arbeiten Sie unter denaturierenden Bedingungen. Packen sie die Säule neu. Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

Der His-Tag befindet sich nicht an optimal exponierter Stelle. Schwache Proteinexpression Das Fusionsprotein bildet sog. Inclusion Bodies aus.

4 1.3 ELUTIONSSCHRITT BEOBACHTUNG MÖGLICHE URSACHEN EMPFEHLUNG COELUIERTE PROTEINE LIEGEN VOR DAS ZIELPROTEIN WIRD SCHLECHT ELUIERT DAS ELUTIONSPROFIL KANN NICHT REPRODUZIERT WERDEN Die Kolonne ist zu groß gestaltet. Das Harz zeigt nur geringe Bindungsselektivität zum Fusionsprotein. Manchmal ist Ni2+ nicht selektiv genug, denn auch Proteine mit höherer Anzahl an His, Cys und Tryptophanresten können daran gebunden werden. Zu milde Elutionsbedingungen. Manchmal ist die Bindung des Fusionsproteins am Metallion zu stark. Beachten Sie: Über die Position des His-Tags im Protein kann die Bindungsstärke beeinflusst werden. Das Fusionsprotein kann präzipitiert sein. Die Probeneigenschaften wurden modifiziert, der His- Tag wurde zerstört bzw. ging verloren durch Proteaseaktivität. Proteine oder Lipide wurden präzipitiert. ph-wert oder die Ionenstärke der Pufferlösung hat sich verändert. Die Auftragungsproben sind unterschiedlich. Verringerung der Bindungskapazität. Reduzieren Sie die Harzmenge. Das Fusionsprotein und die Fremdproteine können somit mit einer geringeren Anzahl an Bindungsstellen konkurrieren. Dies erhöht die Bindungsselektivität für das Zielprotein. Versuchen sie über die Anwendung eines Imidazolkonzentrations-Gradienten das Zielprotein vom Rest der zurückgehaltenen Proteine zu separieren. Auch eine sog. Single Step Elution kann hilfreich eingesetzt werden. Erhöhen sie die Imidazolkonzentration oder reduzieren Sie den ph-wert im Elutionsschritt. Versuchen Sie, wenn möglich, die Temperatur für den Elutionsschritt zu erhöhen. Führen Sie die Elution mit Zugabe eines chelatisierenden Agens wie EDTA durch. Erhöhen Sie die Imidazolkonzentration auf maximal 1 M im Elutionspuffer. Zur Verlängerung der Kontaktzeit können Sie die Flussrate im Elutionsschritt erniedrigen oder die Elution im Batchverfahren durchführen. Eluieren Sie unter denaturierenden Bedingungen. Fügen Sie solubilisierende Agenzien zu (siehe Kompatibilitätsliste). Inkubieren Sie das Säulenmaterial 8 10 h mit Elutionspuffer und eluieren anschließend damit. Führen Sie die Bindungs- und Elutionsschritte im Batchformat durch. Dadurch können Sie lokale Konzentrationsverdichtungen und damit einhergehende Präzipitationen vermeiden. Hier ist es notwendig, die Probe neu herzustellen. Führen Sie das Protokoll bei 2 8 C durch und fügen Sie Proteaseinhibitoren zu (siehe Kompatibilitätsliste). Regenerieren Sie das Harz. Präparieren Sie den Puffer neu. Halten Sie alle Parameter und Bedingungen möglichst konstant. Regenerieren Sie das Harz. 4 Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

Manchmal ist Ni2+ nicht selektiv genug, denn auch Proteine mit höherer Anzahl an His, Cys und Tryptophanresten können daran gebunden werden. Zu milde Elutionsbedingungen.

5 2. Sonstiges 2.1 Wichtige Informationen Dieses Produkt wurde ausschließlich für die Forschung und für in vitro Anwendungen entwickelt und wird nur für diese Zwecke verkauft. Es darf nicht für therapeutische oder diagnostische Anwendungen am Menschen angewendet werden. 2.2 Gewährleistung Biontex gewährleistet nur dann für die beschriebenen Eigenschaften dieses Produktes bis zu dem auf dem Etikett aufgedruckten Verfallsdatum, wenn es gemäß der in diesem Manual angegebenen Informationen angewendet wurde. Sollten Sie trotzdem mit diesem Produkt nicht zufrieden sein, kontaktieren Sie bitte Biontex Laboratories GmbH über die angegebenen Kontaktdaten oder eine der angegebenen autorisierten Vertriebsfirmen. Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

2 Gewährleistung Biontex gewährleistet nur dann für die beschriebenen Eigenschaften dieses Produktes bis zu dem auf dem Etikett aufgedruckten Verfallsdatum, wenn es gemäß der in diesem

6 3. Related Products Transfection Product Pack Size Cat. No. Product Pack Size Cat. No. METAFECTENE EASY 2 T T METAFECTENE PRO 2 5 T T T METAFECTENE SI 2 T T METAFECTENE 2 5 T T T INSECTOGENE 2 5 T T T T DOTAP Protein Purification 2 5 T T T T Ni-NTA-Agarose 2 R R R R Ni-IDA-Agarose l 2 R R R R Highflow Ni-IDA-Agarose 2 R R R R Pre-Packed L-Column Ni Pre-Packed XL-Column Ni Pre-Packed Ni-Cartridge 5 x Harz 5 x 5 ml Harz 1 x Harz 5 x Harz P P P P Co-IDA-Agarose 2 R R R R Highflow Co-IDA-Agarose 2 R R R R Pre-Packed L-Column Co Pre-Packed XL-Column Co 5 x Harz 5 x 5 ml Harz P P Pre-Packed GST-Cartridge 1 x Harz 5 x Harz P P GST-Agarose 2 R R R R Empty S-Columns Empty L-Columns Empty XL-Columns Empty Spin-Columns Empty Cartridges Proteofection 50 x 1,5 ml 50 x 12 ml 50 x 35 ml 50 x 800 µl 5 x P-50S P-50L P-50XL SP-50 C PROTEOfectene 100 µl 250 µl E E E E PROTEOfectene AB Reagents for mycoplasma-free cell culture 100 µl 250 µl E E E E FBS MycoFREE (EU) FBS MycoFREE (US) FBS MycoFREE (AU) Trypsin MycoVIR (1 ) (1:250) 100 ml 500 ml 100 ml 500 ml 100 ml 500 ml M M M M M M ml M Trypsin MycoVIR (1 )+EDTA (1:250) 100 ml M Trypsin MycoVIR (10 )+ EDTA (1:250) 100 ml M MycoSPY Mycoplasmen-Detektionskit MycoRAZOR Mycoplasmen-Eliminierungskit Microfection Kits 10 Assays 25 Assays 50 Assays M M M ml M µ-transfection Kit VI 15 Slides K µ-proteofection Kit VI 15 Slides K µ-transfection Kit VI FluoR 15 Slides K µ-proteofection Kit VI AB 15 Slides K Visit the Biontex website ( and select your home country to get specific contact and ordering information. 6 Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

1 R040-10.1 R040-50.1 R040-50.2 Ni-IDA-Agarose l 2 R010-05.1 R010-10.1 R010-50.1 R010-50.2 Highflow Ni-IDA-Agarose 2 R011-05.1 R011-10.1 R011-50.

7 Biontex Laboratories GmbH Am Klopferspitz 19 im IZB Planegg/Martinsried Germany Phone: +49 (0) Fax: +49 (0) Fax 2: +49 (0) Internet: 7 Troubleshooting Ni-NTA-Agarose

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