3. Quartärstruktur und Symmetrie. Lernziel:

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1 3. Quartärstruktur und Symmetrie Lernziel: 1) Verstehen dass einige Proteine mehrere Untereinheiten haben können, welche normalerweise symmetrisch angeordnet sind. U.Albrecht BC1 Polypeptid-Untereinheiten können in einer spezifischen Geometrie assoziieren. Die räumliche Anordnung dieser Untereinheiten wird als Quartärstruktur bezeichent. Vorteile: Grosse Proteine können aus untereinheiten Bausatzmässig zusammengebaut werden. Effizienter als Verlängerung der Polypeptidkette. Auf Genom die Gene der Untereinheiten verteilt. Regulationsmöglichkeit beim Aufbau von Komplexen. 4 Unterein- heiten = Protomere 1

2 Symmetrie in Proteinen U.Albrecht BC1 In oligomeren Proteinen sind Protomere symmetrisch angeordnet Protomere formieren sich um einen Punkt Proteine nur rotationssym- metrisch. Keine Inversions- oder Spiegel- symmetrien, sonst müssten L-AS zu D-AS werden. z.b. Virusproteine 4. Proteinstabilität Lernziele: 1) Verstehen dass Proteinstabilität vorwiegend von hydrophoben Kräften abhängt und sekundär von elektorstatischen Interaktionen. 2) Verstehen dass ein denaturiertes Protein unter gewissen Bedingungen sich renaturieren kann. 2

3 Native Proteine eigentlich nur schwach stabil unter physiologischen Bedingungen. z. B. ist die gefaltete Form eines 100 AS Proteins nur etwa 40 kj/mol stabiler als seine ungefaltete Form. Die Proteinstruktur ist eine delikate Balance zwischen gegensätzlichen Kräften. A. Kräfte welche die Proteinstruktur stabilisieren -) hydrophobe Effekte sind die Hauptkräfte welche die Proteinstruktur bestimmen. Kombinierte hydrophobe und hydrophile Tendenzen werden als Hydropathien ausgedrückt. U.Albrecht BC1 Hydrophatie-Index = Mass für Hydrophobizität. Für jede AS anders. Negative Werte = hydrophile AS, positive Werte = hydrophobe AS interne Regionen Hydrophatie-Plot des Chymotrypsinogens externe Regionen 3

4 -) elektrostatische Interaktionen Wasserstoffbrücken sind zentral in Proteinstukturen tragen aber nur wenig zur Stabilität des Proteins bei, da solche Reste auch mit Wasser H-Brücken machen können -> deshalb Unterschied zwischen nativem und ungefalteten Protein nur etwa -2 bis 8 kj/mol. -> feinmoduliert Proteinstruktur bloss. Salzbücken sind aus Ionenpaaren. Sie tragen wenig zur Proteinstabilisierung bei, da die Ladungsinteraktionen den Verlust an Solvatationsenergie nicht kompensieren können. Deshalb Ionenpaare wenig konserviert in homologen Proteinen. -) Chemische Cross-links Disulfidbrücken: In Proteinen welche Disulfidbrücken haben kann Cys mutiert werden und Protein faltet sich trotzdem richtig -> Disulfidbrücken nicht essentiell für aktive Konformation. Möglicherweise für locking-in Sie sind selten in cytoplasmatischen Proteinen zu finden da Umgebung reduzierend ist. Sekretierte Protein meist mit Disulfidbrücken (oxidierende Umgebung) -> zusätzliche Strukturelle Bedingung (vrgl. Insulin). Zink Finger: Zn2+ als Metall ion das interne Strukturen von Proteinen cross-linked Zink hat nur einen stabilen Oxidationsstatus und nimmt nicht an Redox- Reaktionen in der Zelle Teil. Beispiel für ein Zn Protein DNA-Bindeprotien Zif268 Cys2 His2 Zinkfinger. 4

5 B. Proteindynamik Proteine sind flexible und schnell fluktuierende Moleküle deren strukturelle Mobilität funktionell signifikant sind. Beispiel Myoglobin: einzlene Schnappschüsse übereinander angeordent illustrieren das Atmen des Proteins. Die funktionelle Hämgruppe ist orange und die Hämgruppe gelb. Die verschiedenen Konformationen haben ähnliche Stabilität. C. Denaturieren und Renaturieren von Proteinen Die schwache konformationelle Stabilität von Proteinen machen sie leicht denaturierbar. Proteine können durch folgende Bedingungen und Substanzen denaturiert werden: 1. Temperatur -> cooperatives, simultanes Denaturieren. 2. ph Veränderung -> ionizationsstatus der AS Seitenketten wird verändert vrgl. saure Milch 3. Detergenzien, Lösungmittel -> assoziieren mit unpolaren Resten -> hydrophobe Interaktionen werden zerstört. Beispiel Alkohol 4. Chaotropische Agentien -> Guanidin hydrochlorid, Harnstoff -> erhöhen Löslichkeit unpolarer Reste in Wasser -> hydrophobe Kräfte gestört. 5

6 Denaturierte Proteine können renaturieren Anfinson experiment mit RNAse A -> Disulfid Brücken formen sich spezifisch zurück sonst wäre Wahrscheinlichkeit 1/7 x 1/5 x 1/3 x 1/1 = 1/105 d.h. 1% würde sich spontan in aktive Form zurückverwandeln. Im Experiment zeigt sich aber dass alles renaturiert -> Die Primärstruktur des Proteines diktiert die dreidimensionale Struktur. 5. Proteinfaltung Lernziele: 1) Verstehen dass ein sich faltendes Protein einem Weg von hoher Enerige und hoher Entropie zu tiefer Energie und tiefer Entropie folgt. 2) Verstehen dass molekulare Chaperone Proteinfaltung durch ATP-abhängige Reaktionen unterstützen. 3) Verstehen wie Amyloid Krankheiten aus Misfaltung von Proteinen entstehen. 6

7 hypothetischer Proteinfaltungsweg Für zufälliges Falten: ein Protein mit n Resten hat 2^n Torsionwinkel, φ und ψ haben 3 stabile konformationen. Dies ergibt 3^2^n etwa 10^n mögliche Konformationen. Wenn alle 10^-13s eine neue Konformation ausprobiert würde wäre die Zeit die dzu benötigt wird 10^n/10^13. Für ein Peptid von 100 AS wären das 10^87 s, was länger als das alter des Univesums wäre. -> Proteine müssen die korrekte Faltung schneller als das annehmen. A. Proteinfaltungswege Proteine falten in ihre native Konformation über direkte Wege und nicht über zufallssuche der richtigen Konformation. Zuerst Sekundärstrukturen (Helices, Faltblätter) Dann Subdomänen und Quartärstruktur Dies ist ein kooperativer Process Entropiediagramm für Proteinfaltung 7

8 B. Protein Disufid Isomerase RNAse A falted sich in vivo schneller zurück als in vitro. Grund: spezielles Enzym welches Ausbildung der Disulfidbrücken lenkt -> nich alle Varianten müssen durchgespielt werden. Das Enzym ist Protein disulfid isomerase (PDI). 1) katalysiert Neubildung on Disulfidbrücken 2) iniziert auch Disulfidbrückenbildung 8

9 Proteine können bis zu einem gewissen grade nachgebildet werden und für kleine Strukturen kann die Struktur vorausgesagt werden. Nachbildung (rot) von Zif 268 (blau) 9

10 C. Molekulare Chaperone Proteine falten sich oft schon während ihrer Synthese, deshlab immitiert die in vitro Faltun nicht immer die in vivo Faltung. Molekulare Chaperone sind essentielle Proteine welche ungefaltete und partiell gefaltete Proteine binden um falsche Assoziation exponierter hydrophober Segmente zu verhindern was zu nicht-nativem Falten und Protein Assoziation und Präzipitation führen könnte. Wichtig für Multisubunit und Multidomänen Proteine. Chaperone können auch falsch gefaltete Protein zum korrekten Rückfalten animieren. Viele der Chaperone als Hitze-Schock Proteine identifiziert, da sie mehr synthetisiert werden bei hoher temperatur um Hitzedenaturierte Protein zurückzufalten. 3 Hauptklassen: 1) Hsp70 familie (70kD) die als Monomere funktionieren. 2) Chaperonine welche grosse Multisubunit Proteine sind 3) Hsp90 proteine die involviert sind mit dem falten von Proteinen welche in Signaltransduktionswegen wie Steroidhormon rezeptoren eine Rolle spielen. Alle Chaperone binden ungefaltete oder aggregierte Lösungexponierte hydrophobe Seitenketten eines Proteins. Proteine werden wieder losgelassen. Binden und loslassen passiert häufig mehrere male bis Protein richtig gefaltet ist. -> Energie von ATP hydrolyse -> deshlab sind Chaperone ATPasen. GroEL/ES Chaperone haben Fass Struktur. Diese Chaperonine von E.coli sind symmetrisch zusammengesetzt aus 7 mal der gleichen Untereinheit. diese bilden einen Ring. 2 Ringe liegen dann übereinander = GroEL Hier Seitenansicht gezeigt. 10

11 Aufsicht eines GroEL Rings aus 7 Untereinheiten GroES Untereinheit Aufsicht 11

12 Röntgenstruktur des GroEL-GroES-(ADP)7 Komplexes Hohlräume cis Ring ADP trans Ring 12

13 ATP Bindung und hydrolyse koordinieren die konformationellen Aenderungen in GroEL7GroES 1) Ungefaltetes Protein bindet an cis Ring mit ATP -> GroES bindet und Höhle vergrössert siche->mikro- Umgebung hydrophob die Protein in geschützter Umgebung rückfalten lässt. 2) Innerhalb von 13s werden die 7ATPs hydrolysiert. Das Fehlen der gamma Phosphatgruppe destabilisiert Bindung zwischen GroEL und GroES 3) Ein zweites ungefaltetes Protein bindet an den Transring und 7 ATP binden auch an den Transring. 4) Der cis Ring entlässt das gefaltete erste Protein und den GroES Deckel und 7 ADPs. Der Transring wird zum cis Ring für die nächste Runde. Im Durchschnitt bruacht ein Protein etwa 24 Faltungszyklen d.h. 7-25= 168 ATPs Welche Proteine werden durch Chaperonine gefaltet? In E. coli nur eine Fraktion der Proteine. Von 2500 cytosolischen Proteinen werden sicher 52 durch diese Chaperonine gefaltet. Es handelt sich um kd grosse Proteine welche Enzyme für metabolische Funktionen haben oder involviert sind in der Transkription und Translation. Gewisse Proteine kehren immer wieder zu den Chaperoninen zurück was zeigt dass diese Proteine für korrektes Rückfalten in den Service gehen das sie selber instabil sind oder aggregieren. 13

14 D. Krankheiten die durch falsche Proteinfaltung hervorgerufen werden Alzheimers Krankheit. Eine Prozessierungsvariante des Amyloid beta Proteins aggregiert und bildet klumpen in Neuronen was ihre Funktion zerstört. Prionen: PrP Protein in falscher Konformation -> in Kontakt mit gesunden -> induziert diese auch falsche Konfomation anzunehmen. Aggregate-> stört funktion der Neuronen. 14

15 Normale gefaltetes PrP Falsch gefaltetes PrP 15

16 Amyloidoses mehrere Faltblätter einzelnes Faltblatt Lysozyme Misfolding -> Familia visceral amyloidosis Transthyretin (protein that carries waterunsoluble proteins like thyroxin in blood palsma) -> familial amyloid polyneuropathie Fibrinogen -> Hereditary renal amyloidosis Ability to form amyloid may be intrinsic to all polypeptide chains. 16