1. Sekundärstruktur 2. Faserproteine 3. Globuläre Proteine 4. Protein Stabilisierung 5. Quartärstruktur

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1 Dreidimensionale Struktur von Proteinen (Voet Kapitel 7) 1. Sekundärstruktur 2. Faserproteine 3. Globuläre Proteine 4. Protein Stabilisierung 5. Quartärstruktur

2 4. Protein-Stabilisierung Proteine sind unter physiologischen Bedingungen stabil. Stabilisierungsenergie kommt von nichtkovalenten Kräften: A. elektrostatische Wechselwirkungen B. Wasserstoff-Brücken C. hydrophobe Kräfte Proteinstruktur = Gleichgewicht von sich ausgelichenden Kräften A. Elektrostatische Kräfte Moleküle = Ansammlung von elektrisch geladenen Partikeln Coulomb-Gesetz: U = k q1 q2 U = Anziehungskraft D r q1 q2 = elektrische Ladungen k = Konstante Elektrostat. Kräfte wirken über grosse D = Dielektrizitätskonstante Räume schwierig Beitrag zur Stabilität Medium (=1 in Vakuum) zu quantifizieren r = Abstand zwischen Ladungen

3 Ionische Wechselwirkungen sind stark, tragen aber nicht sehr zur Proteinstab. bei Ionenpaare Salzbrücken müssen jedoch solvatisiert werden. Solvatationsenergie ist etwa gleich wie die freie Energie einer Ionenbrücken Bildung in nicht solvatisiertem Zustand. Netto Energie ist 0. Beitrag von Ionenbrücken zur Stabilisierung von Proteinen gering.

4 Dipol - Dipol - Wechselwirkungen sind schwach, tragen jedoch zur Stabilisierung bei Nichtkovalente Anziehung zwischen elektr. neutralen Molekülen van der Waals Kräfte 0.5 nm -9.3 kj/mol Carbonyl- und Amidgruppen besitzen permanentes Dipolmoment = viel schwächere Ladungen als Ionen. Anziehung nimmt mit r 3ab. In Protein sind diese Dipole oft geordnet additiv im Proteininneren (D niedrig) signifikante Stabilisierung Diese Kräfte spielen nur bei kontaktierenden 6 Gruppen eine Rolle. Proportional zu r Bei grosser Anzahl interatomarer Kontakte wichtig zur Festlegung der Konformation -0.3 kj/mol

5 B. Wasserstoffbrücken-Bindungen Donor - H... Akzeptor H-Brücken stärker gerichtet als van der Waals Kräfte. N-H... O=C nm -12 bis -30 kj/mol Protein ungefaltet, Akzeptor = Wasser d.h. Netto kein Energiegewinn gefaltet vs. ungefaltet. Wenn Protein gefaltet würde ohne H-Brücken würde freie Energie verloren gehen, d.h. H-Brücken bilden sich aus

6 C. Hydrophobe Kräfte Als hydrophoben Effekt bezeichnet man ein Phänomen das den Kontakt unpolarer Substanzen mit Wasser minimiert. Polare Lösungsmittel (DMSO, DMF) denaturieren Proteine Orientierung von Wassermolekülen in Umgebung eines unpolaren gelösten Stoffes Wassermoleküle überziehen unpolaren Stoff und maximieren ihre H-Brücken. geordnete Struktur des Wassers ist treibende Kraft bei der Proteinfaltung Solvatation von unpolaren Gruppen Verringerung des Wasservolumens

7 Einschlussverbindung (Clathrat). Clathrate sind kristalline Komplexe unpolarer Verbindungen mit Wasser. Polyederkäfig bildet sich aus.

8 Hydrophatie-Index = Mass für Hydrophobizität. Für jede AS anders. Negative Werte = hydrophile AS, positive Werte = hydrophobe AS interne Regionen Hydrophatie-Plot des Chymotrypsinogens externe Regionen

9 D. Disulfid-Bindungen (S-S) Disulfid-Bindungen sind kovalente Bindungen welche die Dreidimensionale Struktur stabilisieren. Cytoplasma hat reduziernden chemischen Charakter wo S-S Bindungen nicht stabilisierend wirken. Extrazelluläre Umgebung ist oxidierend, deshalb haben Proteine die einen extrazellulären Bestimmungsort haben Disulfid-Brücken zur Stabilisierung Im Labor werden Disulfid-Brücken mit reduzierenden Agenzien wie β Mercaptoethanol geöffnet.

10 E. Protein-Denaturierung Native Proteinstruktur = kooperative Wechselwirkungen jede partielle Entfaltung destabilisiert Reststruktur Temperatur beeiflusst kooperative WW stark Temp. wo Struktur zur Hälfte denaturiert= Schmelztemperatur TM. Thermophile Bakterien haben sehr hohe TM z.b. Taq Polymerase ph-variation ändert Ionisierung der AS (H-Brücken) Detergenzien (z.b. Seifen) stören hydrophobe WW optische Rotation von RNAse A als Funktion der Temperatur. Tm ist Wendepunkt der Kurve wasserlösl. org. Substanzen stören hydrophobe WW (z.b. ethylenglycol, Saccharose)

11 Einfluss von Salzen auf Proteine Einige Salze stabilisieren andere destabilisieren Proteinstruktur zum Aussalzen von Proteinen werden vor allem stabilisierende Salze verwedet Ionen die Protein-Denaturierung fördern bezeichnet man als chaotrop Auch Harnstoff und das Guanidinium Ion denaturieren Proteine bei einer Konzentration von 5 M bis 10 M Schmelztemperatur von RNAse A in Abhängigkeit von den Konzentrationen verschiedener Salze

12 Dreidimensionale Struktur von Proteinen (Voet Kapitel 7) 1. Sekundärstruktur 2. Faserproteine 3. Globuläre Proteine 4. Protein Stabilisierung 5. Quartärstruktur

13 5. Quartärstruktur Polypeptid-Untereinheiten können in einer spezifischen Geometrie assoziieren. Die räumliche Anordnung dieser Untereinheiten wird als Quartärstruktur bezeichent. Vorteile: Grosse Proteine können aus untereinheiten Bausatzmässig zusammengebaut werden. Effizienter als Verlängerung der Polypeptidkette. Auf Genom die Gene der Untereinheiten verteilt. Regulationsmöglichkeit beim Aufbau von Komplexen. 4 Untereinheiten = Protomere

14 Symmetrie in Proteinen In oligomeren Proteinen sind Protomere symmetrisch angeordnet Protomere formieren sich um einen Punkt Proteine nur rotationssymmetrisch. Keine Inversions- oder Spiegelsymmetrien, sonst müssten L-AS zu D-AS werden. z.b. Virusproteine

15 Präalbumin-Dimer entlang einer zweizähligen Achse (rot). Jedes Protomer aus zwei 4 strängigen β Faltblättern. Zwei dieser Dimere assoziieren Rücken an Rücken und bilden ein Tetramer mit D2-Symmetrie.

16 Elektronenmikroskopie kann Hinweise auf oligomere Symmetrien geben Aufsicht verschiedene Seitenansichten Elektronenmikroskopische Aufnahme von E. Coli Glutaminsynthetase (600 kd) in drei charakteristischen Orientierungen.

17 Helicale Symmetrie Einheit an den Enden leicht andere Umgebung Umgebung für Einheiten quasiäquivalent Viele strukturelle Proteine bilden Fasern mit helicaler Symmetrie z.b. Muskel

18 Bestimmung der Zusammensetzung der Untereinheiten Wenn Untereinheiten gleich, Veränderung einer UE durch chemische Modifikation, welche die Mobilität verändert. So wurde Quartärstruktur von E. Coli Aspartat-Transcarbomoylase bestimmt Hybridmoleküle liefern Information über Quartärstruktur Lactatdehydrogenase (LDH) zwei Arten: M-Typ (Skelettmuskulatur) H-Typ (Herzmuskulatur) wiederhohltes Einfrieren liefert 5 Isozyme sichtbar durch elektrophoret. Auftrennung

19 Blick entlang der einzähligen Achse Blick entlang der zweizähligen Achse Quartärstruktur von ATCase. Das Molekül besitzt D3-Symmetrie

20 Quervernetzende Agentien stabilisieren Oligomere Vergleich der Protomer Masse mit der Masse nach Verknüpfung ergibt Anzahl Untereinheiten. 8C Länge des Cross-Linkers kann Aufschluss über die Abstände zwischen Untereinheiten geben 5C Vernknüpfung zweier Lys Seitenketten