Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.)

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1 Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Thomas Schmid HCI D323 schmid@org.chem.ethz.ch

2 Elektrophorese 2

3 Elektrophorese Allgemein: Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld Analytische Chemie: Trennung von Ionen im elektrischen Feld Elektrophoretische Trenntechniken zählen im Allgemeinen nicht zur Chromatographie 3

4 Chromatographie-Check Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein: Trenntechnik Zwei nicht mischbare Phasen Eine mobile und eine stationäre Phase Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen 4

5 Elektrophorese Gel-Elektrophorese Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) Kapillarelektrophorese (CE) Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) 5

6 Gel-Elektrophorese 6

7 Gel-Elektrophorese Gel-Elektrophorese: Genetischer Fingerabdruck : 7

8 Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Standard Probe Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung Kleine Moleküle wandern schneller als grosse Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.b. Fluoreszenz) Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse + Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp) z.b. Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.b. Genetischer Fingerabdruck) 8

9 Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Trennung nach Ladung und Grösse Grösse: hydrodynamischer Durchmesser d.h.: Proteine werden nach Ladung, Molekulargewicht und Faltung getrennt Bei Proteinen wird häufig die SDS-PAGE angewandt 9

10 SDS-PAGE SDS = sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C 12 H 25 NaO 4 S Tensid SDS bildet Mizellen SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene Komplexe mit Proteinen 10

11 SDS-PAGE Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen Faltung beeinflusst nicht die Trennung Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle Trennung von Proteinen nur aufgrund des Molekulargewichts 11

12 SDS-PAGE Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen Faltung beeinflusst nicht die Trennung Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8) gemäss ihres Molekulargewichts. Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse als Molekulargewichtsstandard (14 97 kda) Trennung von Proteinen nur aufgrund des Molekulargewichts 12

13 Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis = CE) 13

14 CE: Theoretische Grundlagen Elektrophoretische Mobilität µ EP eines Ions im elektrischen Feld E µ EP = v E = Geschwindigkeit eines Ions Elektrische Feldstärke = e 6! " 1 # " z r e... Elementarladung η... Viskosität der Pufferlösung z... Ladung des Ions r... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions Konstante Pufferlösung Ion (Analyt) Trennung aufgrund von Ladung und Grösse der Ionen 14

15 CE: Theoretische Grundlagen Elektroosmotischer Fluss (EOF) Quarzkapillare (SiO 2 ) EOF + Anode Quarzkapillare (SiO 2 ) Kathode Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF). 15

16 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Trennung von Kationen und Anionen Neutrale Moleküle verlassen ungetrennt mit dem EOF die Kapillare Kationen Neutrale Moleküle (ungetrennt) Anionen Detektor wegen EOF kathodenseitig angebracht Nur Anionen, die schneller als der EOF wandern, erreichen den Detektor nicht 16

17 Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) Abhängig von ihrer Polarität halten sich die Analyten v.a. in der Pufferlösung (polar) oder in den Mizellen (unpolar) auf. Dem Puffer wird ein Tensid (z.b. SDS) zugegeben, welches Mizellen bildet. Trennung ungeladener Analyten (keine Ionen) Chromatographie Mobile Phase: Pufferlösung (polar) Pseudo-stationäre Phase: Mizellen (unpolar) 17

18 Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) Trennung von ungeladenen Analyten Pufferlösung (mobile Phase) bewegt sich wegen EOF in Richtung Kathode Mizellen (pseudo-stationäre Phase) bewegen sich langsamer Elutionsreihenfolge wie in RP-HPLC: polare Moleküle eluieren vor unpolaren hoch Polarität der Analyten gering Detektor wegen EOF kathodenseitig angebracht 18

19 Zusammenfassung: Elektrophorese Gel-Elektrophorese Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Trennung geladener Makromoleküle (z.b. DNA-Fragmente) Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand) Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex) Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts Kapillarelektrophorese (CE) Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.b. Aminosäuren, Ionen) Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF) Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) Trennung ungeladener, kleiner Moleküle Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC) 19