Sequenzierung. Aufklärung der Primärstruktur von DNA. Biotechnik Kurs WS 2006/07

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1 Sequenzierung Aufklärung der Primärstruktur von DNA Biotechnik Kurs WS 2006/07 AK Engels Angelika Keller

2 Übersicht Geschichtlicher Hintergrund Maxam-Gilbert Sequenzierung Sanger Sequenzierung Neuere Sequenzierungstechnologien

3 Geschichtlicher Hintergrund 1965 Sequenzierung der ersten biologisch relevanten Nucleinsäure mit hohem Aufwand: 76 Nukleobasen in 7 Jahren 1977 erstes komplettes Gen (Bakteriophage ϕx174) durch Sanger sequenziert: 5000 Nukleobasen in < 1 Jahr 1980 Nobelpreis der Chemie für Gilbert und Sanger 1997 Totalsequenz des E.coli Bakteriums ( bp) 2001 HUGO (Nature), Graig Venter (Science): Menschliches Genom ( bp)

4 Maxam-Gilbert Sequenzierung wurde 1977 erstmals von A.Maxam und W.Gilbert publiziert Prinzip: chemische Sequenzierungsmethode; Oligonukleotide werden chemisch modifiziert und gespalten Statistischer basenspezifischer Strangbruch => radiogelabelte Fragmente mittels PAGE auftrennen Bis zu 750 Basen analysierbar, jedoch eher für kürzere Sequenzen geeignet (Dauer ca. 1d) => größter Erfolg: Komplettsequenzierung der T7 Bakteriophagen DNA (1983)

5 Maxam-Gilbert Sequenzierung

6 Maxam-Gilbert Sequenzierung Bedingungen für die basenselektive chemische Spaltung

7 Maxam-Gilbert Sequenzierung Detektion von Pyrimidinbasen: C5-C6-Doppelbindung ist am reaktivsten Reaktion mit Hydrazin führt zum Verlust der Aromatizität und Planarität des Pyrimidin-Ringes Die Hydrazin-Reaktion der Thymidine wird durch Zusatz von NaCl stark verlangsamt

8 Strangbruch durch Behandlung des Guanosins mit 1 M Piperidin, NaOH und Erhitzen

9 Gelelektrophorese: Wanderung der Fragmente von Kathode zu Anode ergibt sog. Sequenz-Leiter Kleinste Fragmente bewegen sich am schnellsten durch das Gel Elektrophorese 3' => 5 (minus nach plus), Leserichtung 5' => 3'

10 Gelbild aus Maxam-Gilbert Sequenzierung

11 Sanger Sequenzierung Enzymatisches Aufbauverfahren Schnellere und genauere Methode als Maxam-Gilbert Sequenzierung (Dauer 1-2 h) Automatisierbarkeit durch Fluoreszenzdetektoren => Routineanwendung im Labor Für längere Sequenzen geeignet (Standard 1000bp) Zu beachten ist jedoch, dass dem der gesuchten Sequenz komplementäre Strang synthetisiert wird! Er muss daher nach der Detektion in sein Komplementäres übersetzt werden

12 Sanger Sequenzierung

13 Sanger Sequenzierung Primer hybridisiert an das 3 -Ende des Templats DNA Polymerasen starten (nur) an doppelsträngigen Bereichen mit der PCR-Reaktion Zugabe geringer Mengen ddntp s: statistisch wird nach jeder einzelnen Base der Sequenz einmal ein ddntp eingebaut Abbruch der PCR Reaktion nach Einbau eines ddntps => Entstehung von Oligonucleotiden unteschiedlicher Länge Auftrennung und Detektion der Fragmente mittels Gelelektrophorese

14 Gelbild aus Sanger Sequenzierung Abgelesene Sequenz 5 -CCTGGCCAGTC... muss übersetzt werden in 3 -GGACCGGTCAG... um zur gesuchten Sequenz zu gelangen

15 Sanger Sequenzierung - Radiolabelling Vorteile Hohe Empfindlichkeit bei der Detektion Geringe Substanzmengen werden benötigt Strukturelle Gleichheit der Proben Nachteile Aufwendige Probenvorbereitung β-strahlung führt zur partiellen Zerstörung des DNA-Stranges Leselänge durch Länge des Gelbilds begrenzt Geringe Haltbarkeit der Proben (Halbwertszeit: 32 P=14d; 35 S=88d)

16 Sanger Methode - Fluoreszenzmarkierung Echtzeitdetektion mittels Durchlaufverfahren => Trennstrecke ist länger als das Gel Fluoreszenzmarker sind kovalent an die Fragmente gebunden Dye Primer Sequenzierung: - am 3 ( internal labelling )-oder 5 -Ende farbstoffmarkierter Primer Dye Terminator Sequenzierung - Farbstoffmarkierung an der Baseneinheit der Terminatoren (ddntp)

17 Dye Primer-Sequenzierung Prinzip nach Sanger, aber Farbstoffmarkierung am 5 - Ende des Primers (meist 5 - Position des Zuckers) Vorteile: hohe Leselängen Geringe Fehlerrate Aber: Detektion unspezifischer Termination möglich (z.b. durch Abdiffundieren der Polymerase) führt zu Fehlinformationen bei hohen Leselängen

18 Dye-Terminator Sequenzierung Aminopropargyl-Linker an den Nukleobasen zur Ankupplung des Fluorophors Pro: keine unspezifischen Abbrüche, 4 verschiedene Farben=> one-pot sequencing Contra: schlechtere Akzeptanz der gelabelten Terminatoren durch die Polymerase

19 Dye-Terminator Sequenzierung Vorteile: nur detektierbare Abbruchfragmente, wenn Terminator auch tatsächlich eingebaut ist; unspezifische Abbrüche tragen keinen Marker Verwendung von 4 unterschiedlichen Farbstoffen => one-pot -Reaktion möglich Nachteil: - meist etwas geringere Akzeptanz des Terminators durch Basenmodifikation

20 Fluoreszenzmarker zum Dye-Terminator-Verfahren

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