Rekombinante Wirkstoffe

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1 Gentechnik/Biotechnik Rekombinante Wirkstoffe Vorlesung im WS 2010/2011 Prof. Theo Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Goethe-Universität Frankfurt/Main

2 Die Geschichte der Gentechnik 1977: Entwicklung der DNA-Sequenzierung durch Walter Gilbert (1932) und Frederick Sanger (1918)

3 Die Geschichte der Gentechnik Maxam/Gilbert-DNA-Sequenzierung: Endmarkierte DNA-Fragmente werden chemisch gespalten: Purine mit Dimethylsulfat; Pyrimidine mit Hydrazin.

4 DNA-Sequenzierung nach Sanger

5 DNA-Sequenzierung nach Sanger "dda"

6 DNA-Sequenzierung nach Sanger Matrize Primer datp, dctp, dgtp, dttp ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp Puffersystem Mg 2+ -Salz DNA-Polymerase 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

7 DNA-Sequenzierung nach Sanger Matrize Primer datp, dctp, dgtp, dttp ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp Puffersystem Mg 2+ -Salz DNA-Polymerase 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

8 DNA-Sequenzierung nach Sanger Matrize Primer datp, dctp, dgtp, dttp ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp Puffersystem Mg 2+ -Salz DNA-Polymerase 5'-..AGGCC-3' 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

9 DNA-Sequenzierung nach Sanger Matrize Primer datp, dctp, dgtp, dttp ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp Puffersystem Mg 2+ -Salz DNA-Polymerase * 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

10 DNA-Sequenzierung nach Sanger * * 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

11 DNA-Sequenzierung nach Sanger * * * 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

12 DNA-Sequenzierung nach Sanger * * * * 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

13 DNA-Sequenzierung nach Sanger * * * * * * * * * * * 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

14 DNA-Sequenzierung nach Sanger 5'-..AGGCCATTGGGGATCTTAGTGAATTCCTACGGTAAA-3' 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

15 DNA-Sequenzierung nach Sanger Nachweis der Abbruchfragmente durch Autoradiographie 5'-..AGGCCATTGGGGATCTTAGTGAATTCCTACGGTAAA-3' [α 32 P]dATP 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

16 DNA-Sequenzierung nach Sanger Nachweis der Abbruchfragmente durch Autoradiographie 5'-..AGGCCATTGGGGATCTTAGTGAATTCCTACGGTAAA-3' 4 getrennte Reaktionsansätze dda ddc ddg ddt 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

17 DNA-Sequenzierung nach Sanger Polyacrylamid-Gelelektrophorese A C G T 1-2 kv Geldimensionen: ca. 30 cm breit ca. 60 cm lang ca. 0,2 mm dick +

18 DNA-Sequenzierung nach Sanger Nachweis der Abbruchfragmente durch Fluoreszenzmarkierung 5'-..AGGCCATTGGGGATCTTAGTGAATTCCTACGGTAAA-3' 1 Reaktionsansatz dda ddc ddg ddt 3'-..TCCGGTATACCCCTAGAATCACTTAAGGATGCCATTT-5'

19 DNA-Sequenzierung nach Sanger Polyacrylamid-Gelelektrophorese 1-2 kv dda ddc ddg ddt Argon-Laser +

20 DNA-Sequenzierung nach Sanger Kapillar-Elektrophorese Argon-Laser µm x 27 cm + dda ddc ddg ddt Start (Kathode) 5-20 kv Ende (Anode)

21 DNA-Sequenzierung nach Sanger

22 DNA-Sequenzierung nach Sanger

23 DNA-Sequenzierung nach Sanger Elektropherogramm

24 Die Geschichte der Gentechnik 1981: Entwicklung von DNA-Syntheseautomaten.

25 Chemische DNA-Synthese

26 Chemische DNA-Synthese

27 Chemische DNA-Synthese

28 Chemische DNA-Synthese die Kopplungseffezienz sollte in jedem Zyklus >98% betragen Ausbeute für ein 20mer und 99% Kopplungseffizienz: es haben nur 82% (0, ) die korrekte Länge; bei jeweils 90% Kopplungseffizient haben nur noch 12% die korrekte Länge! Ausbeute für ein 60mer und 99% Kopplungseffizienz: es haben nur 55% (0, ) die korrekte Länge also sind aufwändige (HPLC) Reinigungsverfahren notwendig

29 Chemische DNA-Synthese 5'-TTTGTGAACCAACACCTGTGCGG-3'

30 Chemische DNA-Synthese Heute nur noch 25% der damaligen Kosten!

31 Die Geschichte der Gentechnik 1982: Transfer und funktionelle Expression eines Rattengens in einer Maus;

32 Die Geschichte der Gentechnik 1982: Transfer und funktionelle Expression eines Rattengens in einer Maus; erste Synthese einer Vakzine; Zulassung von rekombinantem Insulin durch die FDA als erstes gentechnisch hergestelltes Medikament.

33 Zweiketten -Expression

34 Expression von Proinsulin

35 Expression von Proinsulin

36 Nachbehandlung von Proinsulin Trypsin

37 Nachbehandlung von Proinsulin Trypsin Carboxypeptidase B

38 Die Geschichte der Gentechnik 1983 Identifizierung der ersten genetischen Marker zur Diagnose von Erbkrankheiten;

39 Die Geschichte der Gentechnik Isolierung des Dystrophin-Gens

40 Die Geschichte der Gentechnik 1983 Identifizierung der ersten genetischen Marker zur Diagnose von Erbkrankheiten; rekombinantes Insulin wird auf dem Markt eingeführt.

41 Die Geschichte der Gentechnik 1984 Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms (ca Nukleotide)

42 Die Geschichte der Gentechnik HIV-Genom

43 Die Geschichte der Gentechnik 1984 Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms; Entwicklung des genetischen Fingerabdrucks;

44 Die Geschichte der Gentechnik Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) an repetitiven Allelen (Minisatelliten) repetitive Allele: zwei Banden pro diploidem Chromosom Banden auf mehrern Chromosomen Gelelektrophorese Allel 1 Allel 2

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