Methoden der Gentechnik

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1 Methoden der Gentechnik *** DNA-Rekombination und Klonierung *** 1. Allgemeine Grundprinzipien 1.1. Wesen der Gentechnik 1.2. Allgemeine Ziele der Gentechnik 1.3. Molekulare Voraussetzungen 1.4. Wichtige Begriffe aus der Gentechnik 2. Überblick über Teilschritte und Methoden 2.1. Gemeinsame Teilschritte vieler gentechnischer Experimente 2.2. Gewinnung des genetischen Ausgangsmaterials 2.3. DNA-Rekombinationstechnik 2.4. Einbringen von fremder DNA in Wirtszellen 2.5. Klonierung 2.6. Selektion 2.7. Expression 2.8. Spezielle Techniken und Methoden

2 3. Klonierungsvektoren 3.1. Plasmide Grundlegende Merkmale Größe und Kopienzahl Konjugation und Kompatibilität Klassifikation Genkarten wichtiger Plasmide 3.2. Bakteriophagen Eigenschaften Lysogene Phagen Lambda- und M13-Phagen Cosmide 3.3. Klonierungsvektoren für andere Organismen als E.coli Überblick Künstliche Hefechromosomen (YAC) Ti-Plasmid 4. Isolierung und Reinigung von DNA und RNA aus Zellen 4.1. Grundsätzliche Probleme und Teilschritte 4.2. Gesamt-DNA Bakterienzucht und -ernte Zellaufschluß und Gewinnung des Zellextraktes Reinigung der DNA aus dem Zellextrakt Anreicherung und Konzentrationsbestimmung der DNA Gesamt-DNA aus anderen Organismen als Bakterien 4.3. Plasmid-DNA Grundproblem der Plasmidisolierung Trennung nach der Molekülgröße Trennung nach der Konformation Plasmidamplifikation 4.4. Bakteriophagen-DNA Spezielle Probleme der Phagenkultivierung Ernte der Phagenkultur und DNA-Reinigung aus λ-phagen Präparation der DNA aus M13-Phagen

3 4.5. Gewinnung von RNA Strategien zur RNA-Isolierung Inhibierung der RNase-Aktivität 5. Enzyme zur DNA-Manipulation 5.1. Überblick über wichtige Enzymklassen Nucleasen Ligasen Polymerasen Modifikationsenzyme 5.2. Restriktionsendonucleasen Bedeutung und Vorkommen Einteilung Wirkungsweise Durchführung einer Restriktionsspaltung Analyse der Restriktionsprodukte 5.3. Ligasen Wirkungsweise Probleme der Ligation Linker, Adaptoren und tailing 6. Einschleusen von DNA in lebende Zellen 6.1. Ziele der Klonierung 6.2. Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA Herstellung kompetenter Zellen Selektion transformierter Zellen Selektion der Rekombinanten Inaktivierung eines Antibiotika-Markers Inaktivierung eines Nicht-Antibiotika-Markers 6.3. Transfektion von Bakterienzellen mit Phagen-DNA Transfektion und in-vitro-verpackung Selektion der infizierten Zellen Selektion rekombinanter Phagen

4 6.4. Einschleusen von DNA in eukaryotische Zellen Transformation/Transfektion einzelner Zellen Transformation/Transfektion ganzer Organismen 7. Selektion von Klonen eines speziellen Gens 7.1. Das Problem der spezifischen Selektion 7.2. Selektionsprinzipien Direkte Selektion und marker rescue -Verfahren Selektion aus Genbibliotheken 7.3. Klon-Suche in Genbibliotheken Arten von Genbibliotheken Genomische Bibliothek cdna-bibliothek Methoden zur Klon-Identifizierung Nucleinsäure-Hybridisierung Kolonie- und Plaque-Hybridisierung Verwendung geeigneter Gen-Sonden Identifizierung durch Nachweis des Genproduktes 8. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Genen 8.1. Lokalisierung eines Gens auf einem DNA-Molekül Gelelektrophorese und Nucleinsäure-Blotting Genlokalisierung auf kleinen DNA-Molekülen (Plasmide, Phagen-DNA) Genlokalisierung auf großen DNA-Molekülen (eukaryotische Chromosomen) Genom-Kartierung 8.2. Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) Mutationsanalyse Genetischer Fingerabdruck 8.3. Sequenzierung eines Gens Sanger-Coulson-Methode Maxam-Gilbert-Methode

5 8.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Grundprinzip der Methode Experimentelle Durchführung Möglichkeiten und Probleme der PCR-Anwendung 8.5. Untersuchungen zur Genexpression Analyse der Transkripte Untersuchungen zur Expressionsregulation Analyse der Translationsprodukte 9. Praktische Anwendungsgebiete der Gentechnik 9.1. Synthese wertvoller Proteine mit klonierten Genen Expression eukaryotischer Gene in E.coli Beispiele für gentechnische Herstellung wichtiger Proteine Synthese von Impfstoffen 9.2. Gene als diagnostische Sonden 9.3. Gentherapie 9.4. Tumorgene 9.5. Transgene Pflanzen und Tiere 9.6. Gentechnik in Industrie und Landwirtschaft