Vorlesung LV-Nr Molekularbiologie für Agrarwissenschaften. J. Glößl, SS 2007

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1 Vorlesung LV-Nr Molekularbiologie für Agrarwissenschaften J. Glößl, SS 2007 Thematik: Molekularbiologische Methoden Teil 2 Die ppt Folien wurden freundlicherweise von Prof. Florian Rüker aus der Vorlesung Einführung in die Molekularbiologie, LV , bereitgestellt Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 1

2 Eine einfache Klonierung Viele Fragen: Warum will ich etwas klonieren? Was mache ich mit dem klonierten Gen? Woher kommt die "Fremd-DNA"? Wie bringe ich den Vektor in die Zellen hinein? Was ist ein Vektor und wozu brauche ich ihn? Was für Vektoren habe ich zur Auswahl? Wie finde ich den "richtigen" Klon? Was mache ich dann damit? Wie führe ich die einzelnen Schritte durch? Was sind Restriktionsenzyme? Was ist Ligase? Brauche ich noch andere Enzyme? Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 2

3 Transformation, Transfektion, Infektion oder: Wie bringe ich die rekombinante DNA in die Zelle? Transformation: Bedeutet einmal die Aufnahme freier DNA durch ein Bakterium, zum anderen die Änderung von Eigenschaften eines Organismus nach dem Einbau von Fremd-DNA. Außerdem wird mit Transformation auch die Entartung einer Zelle zur Tumorzelle beschrieben Transfektion: Beschreibt (so wie die Transformation) den Einbau von DNA in eine intakte lebende Zelle. Transfektion wird aber vorwiegend zur Beschreibung der Manipulation mit Zellen höherer Organismen benutzt. Infektion ist der Befall eines Lebewesens durch Viren, Mikroorganismen (z.b. Bakterien) oder auch mehrzellige Organismen, der oft mit einer Übertragung genetischen Materials verbunden ist. Transduktion: Eine Art Gentransfer, der dann auftritt, wenn Bakteriophagen Bruchstücke der Erbsubstanz ihrer Wirtszelle mitschleppen und so auf andere Bakterien übertragen. Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 3

4 Transformation vs. Infektion wird DNA passiv über eine vorgeschädigte Membran in eine bakterielle Zelle aufgenommen, so bezeichnen wir das als Transformation. Die aktive Aufnahme von Fremd-DNA mit Hilfe von Phagen bezeichnen wir hingegen als Infektion. Transformation Infektion Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 4

5 Methoden zur Transformation lebender Zellen generell: physikalische, chemische und biologische Methoden Bakterien: Elektroporation, CaCl 2 Transformation Hefen: LiCl 2 Transfektion, Elektroporation tierische Zellen (Zellkultur in vitro): Ca 3 (PO 4 ) 2 Kopräzipitation von DNA, Elektroporation, Lipofektion, Mikroinjektion, "Gene gun" Pflanzenzellen: Gene gun, Infektion mit Agrobacterium tumefaciens, Elektroporation (aber nur für Protoplasten geeignet) Tiere: Injektion von DNA (intradermal, intramuskulär), Gene gun transgene Tiere: Mikroinjektion von befruchteten Eizellen Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 5

6 Gene Gun DNA-beschichtete Goldpartikel werden mit "Luft"druck (Helium, analog zum Luftdruckgewehr) beschleunigt und auf die Zellen geschossen. Die Zellmembran wird durchschossen, die DNA gelangt so ins Innere der Zellen und führt zur Transformation Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 6

7 Mikroinjektion Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 7

8 Was ist ein Vektor und wozu brauche ich ihn? Vektoren sind die Träger der rekombinanten DNA sie sind oft zur Einschleusung der DNA in die Zelle nötig sowie zur stabilen Erhaltung der DNA im transformierten (Mikro)organismus sie bringen meist nicht nur das Zielgen, sondern auch andere Funktionen in die Zelle ein Promotoren (Startpunkt der Transkription) Selektionsmarker Replikationsursprung (Startpunkt der Replikation) die wichtigsten Arten von Vektoren sind Plasmide Viren, Phagen künstliche Chromosomen (artificial chromosome, bacterial artificial chromosome, yeast artificial chromosome) Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 8

9 Vektoren für E. coli - Eigenschaften und Funktionen Plasmide "einfache" Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren einige Kilobasen können kloniert werden Transfer mittels physikalischer und chemischer Methoden (CaCl 2, Elektroporation,...) Bacteriophage Lambda Lambda Phage oft für das Anlegen großer Libraries verwendet, weil: Transfer mittels Infektion wesentlich effizienter als Transformation bis zu 23 Kilobasen können kloniert werden künstliche Chromosomen (artificial chromosome, bacterial artificial chromosome, yeast artificial chromosome) besonders für das Klonieren von besonders großen Inserts bis zu 300 Kilobasen können kloniert werden Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 9

10 Kriterien für die Auswahl eines Vektors brauche ich spezielle Funktionen? Promoter für Expression des Gens tag zur Reinigung bzw. Detektion des rekombinanten Proteins (z.b. His-tag, myctag) Regulationsgene (z.b. laci) welcher Selektionsmarker (Antibiotika-Resistanz, Auxotrophie-Marker)? welcher Replikationsursprung (Kopienzahl, Art der Replikation)? welche Restriktionsstellen stehen zur Verfügung? Brauche ich einen Shuttle-Vektor (kann in verschiedene Organismen eingebracht werden, z.b: in Bakterien und in Hefe)? Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 10

11 Beipiel für ein Plasmid als Expressionsvektor ori = origin of Replikation P = Promoter RBS = Ribosomenbindungsstelle ATG = Startcodon (His) 6 = Histidin-tag zur Reinigung des Proteins MCS = multiple cloning site term = Transkriptionsterminator amp R = Ampicillin-Resistenz-Gen laci = Lac Repressor (als Beispiel für eine Regulationsfunktion) Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 11

12 Replikation: Ori (Replikationsursprung) Ein Replikationsursprung ist für die unabhängige Replikation des Vektors in der Wirtszelle nötig. Man spricht von einem "Episom" und auch von "autonomer Replikation", die unabhängig von der Replikation des Chromosoms (des Genoms) der Wirtszelle verläuft. Enthält der Vektor keinen Replikationsursprung, so besteht immer noch die Möglichkeit der Integration in das Genom der Wirtszelle, und Weitervererbung auf diesem Weg. Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 12

13 Transkription: Promoter und Transkriptionsterminator Wenn das klonierte Gen exprimiert werden soll, d.h. wenn das entsprechende Protein produziert werden soll, müssen Transkription und Translation stattfinden. Entsprechende Vektoren nennt man auch "Expressionsvektoren" Animation der Transkription: Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 13

14 Translation: Ribosomen "Expressionsvektoren"...enthalten alle Sequenzen die nötig sind für Transkription und Translation also Promotor Transkriptionstermiator Ribosomenbindungsstelle Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 14

15 Resistenzgene, selektierbare Marker Die Transformation ist meistens sehr ineffizient (Ausnahme: Mikroinjektion), d.h. nur äußerst wenige der behandelten Zellen werden tatsächlich transformiert. Um diese wenigen Zellen finden zu können ist es nötig, alle nichttransformierten abzutöten. Dies macht man durch den Einsatz von Selektionsmarkern Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 15

16 Resistenzgene, selektierbare Marker Vektoren enthalten in der Regel einen oder mehrere selektierbare Marker. Hierbei handelt es sich um Gene, deren Produkte der transformierten Zelle besondere Eigenschaften verleihen, sodaß sie leicht von nicht-transformierten Zellen zu unterscheiden ist. Meist handelt es sich bei diesen Markern um Gene für eine Antibiotika- Resistenz. Der verbreitetste Marker ist das Gen für die ß-Lactamase. Dieses Gen verleiht E. coli Zellen die Fähigkeit, in Gegenwart von Ampicillin (ein ß-Lactam Antibiotikum) zu wachsen, da die ß-Lactamase den ß-Lactam Ring spaltet und das Antibiotikum damit inaktiviert. Auch andere Antibiotika-Resistenzen, z.b. gegen Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Neomycin können als Marker für Klonierungsvektoren verwendet werden. Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 16

17 Resistenzgene, selektierbare Marker Als Alternative zu Antibiotkaresistenzen werden häufig auch Auxotrophiemarker eingesetzt, vor allem beim Arbeiten mit Hefen. Voraussetzung ist, daß man als Wirtszelle für die Klonierung eine Mutante verwendet, die auf Minimalmedium nicht wächst. Erst nach Transformation mit dem Vektor, der das "richtige" (also das im Wirtsstamm nichtfunktionelle) Gen mitbringt, wird die Zelle prototroph, d.h. sie kann auf Minimalmedium wachsen. Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 17

18 Multiple cloning site Als "multiple cloning site" (MCS, oder "polylinker") wird ein Abschnitt auf dem Vektor bezeichnet, der eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für unterschiedliche Restriktionsendonukleasen enthält. Jede dieser Erkennungssequenzen kommt nur einmal auf dem Vektor vor, d.h. durch Schneiden mit den entsprechenden Restriktionsenzym wird der Vektor linearisiert, und damit bereit zum Aufnehmen der zu klonierenden DNA (des Inserts). Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 18

19 Regulierbare Promotoren Beispiel: lac Promotor/Operator mit laci Gen am Vektor Hintergrund: Regulation des lac Operons rekombinante Proteinexpression und "normales" Wachstum der Wirtzelle sind oft nicht vereinbar, deswegen werden viele gentechnische Prozesse zweistufig angelegt: Produktion der Biomasse (Promotor ist reprimiert), gefolgt von Induktion des Promotors und Proteinproduktion Dieses Prinzip ist auch bei transgenen Tieren und Pflanzen anwendbar. zusätzliche Kopie des lac Repressors am Vektor für noch dichtere Repression Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 19

20 Zusammenfassung Vektoreigenschaften Zweck: einfache Klonierung Library Expression shuttle vector Insertgröße: Plasmid: einige kb Lambda Phage: max ca 23 kb BAC: bis zu 300 kb Transformation / Infektion... Molekularbiologie für Agrarwiss., VO SS 2007, J. Glößl, Teil 2 20