AUFGABENSAMMLUNG. Restriktionsenzyme. Füllen Sie den Lückentext aus. Gentechnik Schroedel, Braunschweig

Transkript

1 Restriktionsenzyme Füllen Sie den Lückentext aus.

2 PCR 1a Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an.

3 PCR 1b Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an.

4 PCR 1c Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an.

5 PCR 1d Mit dem folgenden Quiz können Sie Ihr Wissen zum Thema PCR überprüfen. Klicken Sie jeweils die richtige Antwort an.

6 Genetischer Fingerabdruck 1 Erklären Sie, warum für einen genetischen Fingerabdruck proteincodierende Bereiche nicht geeignet sind. Die proteincodierenden DNA-Bereiche weisen bei allen Menschen kaum Unterschiede auf. Sie sind daher für die eindeutige Identifizierung einer Person ungeeignet. Genetischer Fingerabdruck 2 Nennen Sie zwei Gründe, warum der genetische Fingerabdruck nicht automatisch den Beweis für die Schuld eines Verdächtigen liefert. Das genetische Material eines Verdächtigen kann sich zufällig am Tatort befinden. Genetisches Material einer anderen Person (z. B. ein Haar) kann absichtlich vom Täter am Tatort deponiert worden sein, um den Verdacht von sich abzulenken. Eineiige Mehrlinge (z. B. eineiige Zwillinge) besitzen eine nahezu identische DNA, sodass keine eindeutige Zuordnung möglich ist.

7 Klonierung 1 Um ein DNA-Fragment zu klonieren, wendet man grundsätzlich vier Verfahrensschritte an: Selektion, Restriktionsverdau, Transformation, Ligation. Geben Sie diese in der richtigen Reihenfolge an und erklären Sie kurz, was bei jedem Schritt geschieht. 1. Restriktionsverdau: Der ringförmige Vektor wird durch Restriktionsenzyme an der MCS geöffnet. Das DNA-Fragment wird analog geschnitten und weist Enden auf, die komplementär zu den Enden des linearisierten Vektors sind. 2. Ligation: Das DNA-Fragment wird in den Vektor mittels Ligase integriert. 3. Transformation: Der rekombinante Vektor wird in Bakterien übertragen. 4. Selektion: Bakterien, die den rekombinanten Vektor aufgenommen haben, werden mithilfe von Selektionsmarkern identifiziert. Klonierung 2 Das Einfügen eines DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor kann mit nur einem Restriktionsenzym erfolgen, wenn das Enzym sowohl in der MCS als auch an beiden Enden des DNA-Fragments schneidet. Nennen Sie zwei Nachteile, die dieses Vorgehen im Vergleich zur Verwendung von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen hat. Die Enden des geöffneten Vektors sind zueinander komplementär und können daher von der Ligase verbunden werden. So kann der ringförmige Ausgangszustand des Vektors wieder hergestellt werden (Re-Ligation), anstatt das gewünschte DNA-Fragment in den Vektor zu integrieren. Bei Verwendung von nur einem Restriktionsenzym kann das DNA-Fragment in zwei unterschiedlichen Orientierungen eingebaut werden. Dies ist unerheblich, wenn es lediglich darum geht, eine Fremd-DNA in Bakterien zu vermehren. Bei der Expression eines Fremd-Gens ist jedoch sein Einbau in der korrekten Orientierung von Bedeutung, damit die bakterielle RNA- Polymerase den richtigen Einzelstrang zur Herstellung des gewünschten Proteins abliest. Klonierung 3 Der Restriktionsverdau von Vektor und DNA-Fragment mit anschließender Ligation kann im selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Warum müssen die Restriktions enzyme vor Zugabe der Ligase entfernt bzw. inaktiviert werden? Sind Restriktionsenzyme und Ligase gleichzeitig vorhanden, wird das DNA-Fragment nach der Ligation wieder aus dem Vektor geschnitten, sodass kaum rekombinante Vektoren für die Transformation entstehen können.

8 Klonierung 4 Welche Farbe haben bei der Blau-Weiß-Selektion Bakterien auf einem Nährboden mit Ampicillin und X-Gal, die a. einen Klonierungsvektor mit Insert aufgenommen haben? b. einen Klonierungsvektor ohne Insert aufgenommen haben? c. keinen Vektor aufgenommen haben? Begründen Sie jeweils Ihre Antwort. a. Weiß: Durch das Insert ist das β-galactosidase-gen unterbrochen, sodass X-Gal nicht umgesetzt werden kann. b. Blau: Die Bakterien bilden β-galactosidase, welche die Reaktion von X-Gal zu einem blauen Produkt katalysiert. c. keine Farbe: Bakterien ohne Vektor sind nicht resistent gegen Ampicillin und sterben in Gegenwart dieses Antibiotikums ab. Klonierung 5 Um nachzuweisen, dass Bakterien tatsächlich einen Vektor mit Fremd-DNA in sich tragen, führt man zunächst eine Plasmid-Isolierung durch. Anschließend kann man entweder per Restriktionsverdau oder PCR (jeweils mit nachfolgender Gelelektrophorese) überprüfen, ob ein DNA-Fragment der richtigen Größe in den Vektor integriert wurde. Erläutern Sie für beide Methoden, wie der Nachweis des DNA-Fragments erfolgen kann. Restriktionsverdau: Man schneidet den isolierten Vektor mit den gleichen Restriktions-enzymen, die für die Klonierung verwendet wurden. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung ist bei Vektoren ohne Insert nur eine Bande zu sehen. Die Länge ihrer DNA-Fragmente entspricht der des verwendeten Vektors. Wurde die Fremd-DNA jedoch erfolgreich integriert, zeigt sich dies in Form einer zweiten Bande, deren Laufstrecke abhängig ist von der Länge des klonierten Fragments. PCR: Man setzt den isolierten Vektor als Ausgangs-DNA in einer PCR ein. Dabei benutzt man Primer, deren Sequenzen komplementär zu den Enden des DNA-Fragments sind. (Alternativ werden als Primer Vektorsequenzen verwendet, welche unmittelbar an die MCS angrenzen.) Wurde das gewünschte DNA-Fragment in den Vektor integriert, ist im Elektropherogramm eine Bande zu sehen. Die Länge dieses PCR-Amplifikats entspricht der des klonierten DNA- Fragments. Bei Vektoren ohne Fremd-DNA ist keine Bande zu sehen, da bei der PCR keine DNA-Vervielfältigung stattfinden konnte. Klonierung 6 In manchen Fällen stellt sich bei der Längenüberprüfung eines Inserts heraus, dass dieses dreimal so lang ist wie das eigentlich zu klonierende DNA-Fragment. Geben Sie dafür eine mögliche Erklärung. Während der Ligation wurden zunächst drei DNA-Fragmente an ihren komplementären Enden von der Ligase miteinander verbunden. Anschließend wurde dieses Konstrukt vom Enzym in den geöffneten Vektor eingefügt.