C. R. Newton A. Graham 12'CR. 2. Auflage

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1 C. R. Newton A. Graham 12'CR 2. Auflage

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3 Vorwort 1 1 Danksagung 13 Abkürzungen 1 4 Teil 1 : Die wesentlichen Prinzipien und Methoden 1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) Literatur Geräte, Reagentien und Hilfsmittel Geräte Wahl der Enzyme Taq/Amplitaq -DNA-Polymerase VentTM-DNA-Polymerase Pfu-DNA-Polymerase Tth-DNA-Polymerase U1T TM-DNA-Polymerase Pwo-DNA-Polymerase Weitere PCR-Reagentien Desoxynucleosidtriphosphate Puffer und MgCl Hemmstoffe und Beschleuniger der PCR DNA-Matrize Primer Konstruktion der Primer Schmelztemperatur der Primer Markierung der Primer Berechnung der Primer-Konzentration 44

4 2.5 Hilfsmittel Literatur Vervielfältigung des richtigen Amplikons Nachweis und Untersuchung von Amplikons Gelelektrophorese Nachweis von Amplikons in Echtzeit Immunologischer Nachweis von PCR-Produkten Scintillation proximity assay Nachweis durch Elektrochemoluminiszenz Vermeiden von Verunreinigungen Uracil-N-Glykosylase (Uracil-DNA-Glykosylase) UV-Strahlung Behandlung mit Enzymen Behandlung mit Psoralen und Isopsoralen Spezifität der Reaktion Heißstart (hot start) Heißstart-PCR mit Hilfe von Antikörpern Touchdown-PCR Verschachtelte PCR PCR langer DNA-Fragmente Die entscheidenden Parameter bei der PCR Literatur 6 5 Teil 2 : PCR-Techniken und Anwendungsmöglichkeiten 4. Klonierung und Modifizierung von PCR-Produkten Klonierung von PCR-Produkten Einführung von Restriktionsschnittstellen Klonierung über glatte Enden T-A-Vektoren Bildung von Restriktionshälften Klonieren ohne Ligation (LIC) UNG-Klonierung pcr-scripttm-klonierung Modifikation von PCR-Produkten Einbau von Promotoren und Ribosomenbindungs - stellen Verknüpfen überlappender PCR-Produkte 79

5 4.3.1 Bildung neuer Genkombinationen au s genomischer DNA Synthetische Gene Literatur Isolierung und Konstruktion von DNA-Klonen PCR von Genbanken Verankerte PCR RACE-PCR Ligationsverankerte PCR RNA-Ligase vermittelte RACE RNA-(RT-)PCR Herstellung von cdna-banken mit Hilfe der PCR PCR mit degenerierten Primern Differential display-pcr Literatur PCR-Mutagenese Deletion von Sequenzen Basensubstitutionen Insertionsmutagenese Literatur Sequenzierung von PCR- Produkten Direkte Sequenzierung Asymmetrische PCR Sequenzierung einzelsträngiger DNA mit de r Exonuclease III von Lambda Zyklische Sequenzierung Direkte Sequenzierung an einer Festphase Genamplifizierung mit anschließender Sequenzierung der Transkripte (GAWTS) Chemische Sequenzierung PCR im Rahmen von archäologischen Untersuchungen Literatur Charakterisierung unbekannter DNA-Bereiche Vektoretten-PCR Inverse PCR 130

6 8.3 Suche und Kartierung von Cosmiden, künstliche n Hefe- (YACs), P1- (PACs) un d Bakterienchromosomen (BACs) mit Hilfe der PCR Zuordnung von Amplikons zu den Chromosomen Alu-PCR Tests an transgenen Tieren Amplifizierung kleingeschnittener Chromosomen Literatur Fingerprint-Analysen Zufällig amplifizierte polymorphe DNA (RAPD) Längenpolymorphismus von amplifizierte n Fragmenten (AFLPs) Mikrosatelliten VNTRs (variable number of tandem repeats) Typisierung von HLA-Antigenen der Klasse II Literatur Charakterisierung unbekannter Mutationen Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) Parallele DGGE Senkrechte DGGE Untersuchung von Polymorphismen i m Einzelstrang (SSCP) Chemische Spaltung von Fehlpaarungen Literatur Charakterisierung bekannter Mutationen System der amplifizierungsresistenten Mutation (ARMS) Grundprinzipien Entwurf von Primern für das ARMS Hybridisierung allelspezifischer Oligonucleotide an fixierte PCR-Produkte im Dot-Blot Umgekehrter Dot-Blot RFLP-Analyse Gendiagnostik mit Multiplex-Analysen Multiplex-PCR-Analysen bei de r Duchenne-Muskeldystrophie Multiplex-ARMS bei Cystischer Fibrose Spezielle Methoden 170

7 Nachweis von Mutationen durch Einführen einer Restriktionsschnittstelle Amplifizierung mit kompetitiven Oligonucleotid - primern (COP) Mutationstest durch Primerverlängerun g (primer extension sequence test ; PEST) Mutationsnachweis mit Hilfe der 5'-*3'-Exo - nucleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase PCR-Amplifizierung vielfältiger spezifischer Allel e (PAMSA) Nachweis vereinzelter entarteter Zellen im Anschlu ß an eine Krebsbehandlung Diagnostik bei der in vitro-befruchtung Literatur Nachweis von Krankheitserregern Pilze Viren Menschliche Retroviren Andere klinisch relevante Viren Bakterien Untersuchungen an archivierten histologischen Präparaten Mit Hämatoxylin oder Eosin gefärbt e Gewebeschnitte Mit Formalin fixiertes und in Paraffin eingebettete s Material Zellabstriche In situ-pcr Literatur Quantitative PCR DNA RNA Literatur 19 5 Anhang A: Glossar 19 7 B: Produkte und Firmen 20 7 C: Weiterführende Literatur 21 3 Index 215