Die Bedeutung des. mitochondrialen ABC-Transporters ATM3. für die Molybdäncofaktor-Biosynthese. in Arabidopsis thaliana

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Irmela Minna Gärtner
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1 Die Bedeutung des mitochondrialen ABC-Transporters ATM3 für die Molybdäncofaktor-Biosynthese in Arabidopsis thaliana Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Julia Teschner aus Hannover

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Molybdän und seine Bedeutung in der Natur Struktur des Molybdäncofaktors Biosynthese des Molybdäncofaktors Molybdoenzyme Biosynthese von Eisen-Schwefel-Clustern Mitochondriale ABC-Transporter Der mitochondriale ABC-Transporter ATM3 aus A. thaliana Der humane ABC-Transporter ABCb Ziel der Arbeit 16 2 Ergebnisse Lokalisierung der Proteine des ersten Schrittes der Moco-Biosynthese cdna-lsolierung von cnx2und cnx In vivo-lokalisierung der Proteine Cnx2 und Cnx Lokalisierung von Cnx2 mittels Agrobakterien-Infiltration Lokalisierung von Cnx2 und Cnx3 mittels Protoplasten-Transformation Lokalisierung von MOCSIAin Heia-Zellen Lokalisierung von MOCS1A in Heia-Zellen mittels Anti-MOCS1A- Antikörper In wfro-lokalisierung der Proteine Cnx2 und Cnx3 in Mitochondrien Expression und Aufreinigung von Cnx2 und Cnx3 zur Gewinnung von Antikörpern Lokalisierung von Cnx2 und Cnx3 in gereinigten Mitochondrien Submitochondriale Lokalisierung von Cnx2 und Cnx Lokalisierung des ersten Schrittes der Moco-Biosynthese durch den Nachweis des ersten Moco-Biosynthese-Intermediates cpmp Nachweis von cpmp in bzw. an gereinigten Mitochondrien Nachweis von cpmp in mitochondrialen Subtraktionen Untersuchungen zur Lokalisierung der Proteine Cnx2 und Cnx3 in Chloroplasten Untersuchungen zur Lokalisierung von Cnx2 und Cnx3 in gereinigten Chloroplasten mittels Immunoblot-Analyse Nachweis von cpmp in bzw. an gereinigten Chloroplasten Beteiligung des mitochondrialen ABC-Transporters ATM3 aus

3 Arabidopsis an der Moco-Biosynthese Biochemische und molekulare Charakterisierung der sfaf-mutante aus Arabidopsis über einen Zeitraum von neun Wochen mrna-expressionsanalysen der Arabidopsis-Mutante sta1 im Vergleich zum C24-Wildtyp Analyse der Mo-Enzyme AO, XDH, NR und SO in der sta7-mutante Analyse von Aldehydoxidase und Xanthindehydrogenase in unterschiedlich alten sfa7-pflanzen mittels Aktivitäts-Bestimmung und Immunoblot Analyse der Nitratreduktase in unterschiedlich alten ste7-pflanzen mittels in vitro Nitratreduktase-Aktivitätstest und Immunoblot Analyse der Sulfitoxidase in unterschiedlich alten Pflanzen der Arabidopsis-Mutante sta1 mittels in vitro Sulfitoxidase-Test und Immunoblot Chemischer Nachweis der Intermediate des Moco-Biosynthesewegs Nachweis von MPT in unterschiedlich alten sfa7-mutanten durch quantitative FormA-Analyse Nachweis von cpmp in sta /-Mutanten und C24-Wildtypen durch quantitative CompoundZ-Analyse Bestimmung der ABA-Konzentration in der Arabidopsis-Mutante sta1 im Vergleich zum C24-Wildtyp In vivo-bestimmung der L-Cystein-Desulfurase- und L-Selenocystein- Lyase-Aktivtät von ABA3 in der Arabidopsis-Mutante sta1 im Vergleich zum C24-Wildtyp Biochemische und molekulare Charakterisierung der Arabidopsis-Mutante atm Molekulare Charakterisierung der T-DNA Insertion in der afm3-2-mutante Analyse der Mo-Enzyme in der afm3-2-mutante mittels Enzymaktivitäts- Assay und Immunoblot Nachweis der Moco-Biosynthese-Intermediate in der Arabidopsis-Mutante atm Phänotypischer Vergleich der Arabidopsis a/m3-mutanten Mutanten des ersten und zweiten Schrittes der Moco-Biosynthese Charakterisierung der Arabidopsis-Mutante chl Analyse der Mo-Enzym-Aktivitäten in der Arabidopsis cw2-mutante Nachweis der Moco-Biosynthese-Intermediate in der Arabidopsis-Mutante chl2 64

4 Charakterisierung der Arabidopsis-Mutante sir1/cnx Analyse der Mo-Enzym-Aktivitäten in der Arabidopsis-Mutante sir1/cnx Nachweis der Moco-Biosynthese-Intermediate in der Arabidopsis-Mutante sir1/cnx Nachweis von cpmp in isolierten Mitochondrien von sta1- und sir1/cnx5- Mutanten Biochemische und molekulare Charakterisierung der Arabidopsis- Mutanten atm1-1, atm1-2 und atm2 über einen Zeitraum von neun Wochen Analyse der Mo-Enzymaktivitäten in unterschiedlich alten atm1-1, atm1-2 und afm2-mutanten Nachweis der Moco-Biosynthese-Intermediate in unterschiedlich alten Arabidopsis atm1-1, atm1-2 und afm2-mutanten Biochemische Charakterisierung unterschiedlicher Fe-S-Mutanten aus Maus Biochemische Charakterisierung von ABCb7-Mutanten aus Maus Nachweis der Moco-Biosynthese-Intermediate in konditionalen ABCb7- Mutanten aus Maus Analyse der Mo-Enzymaktivitäten in konditionalen ABCb7-Mutanten aus Maus Biochemische Charakterisierung verschiedener konditionaler Frataxin- Mutanten aus Maus Biochemische Charakterisierung leberspezifischer Frataxin-Mutanten aus Maus Biochemische Charakterisierung herzspezifischer Frataxin-Mutanten aus Maus 84 3 Diskussion Lokalisierung der Proteine des ersten Schrittes der Moco-Biosynthese In vivo Lokalisierung der Proteine des ersten Schrittes der Moco- Biosynthese Lokalisierung der Proteine des ersten Schrittes der Moco-Biosynthese mittels Immunoblot-Analyse Lokalisierung des ersten Intermediats der Moco-Biosynthese Beteiligung des mitochondrialen ABC-Transporters ATM3 aus Arabidopsis an der Moco-Biosynthese Entwicklung der sfaf-mutante Die Mo-Enzyme in afm3-mutanten 94

5 3.2.3 Die ABA-Konzentration in der sfa7-mutante Die Moco-Biosynthese-Intermediate cpmp und MPT in afrn3-mutanten Mögliche Aufgabe des ABC-Transporters ATM3 in der Moco-Biosynthese Die Rolle von ABCb7 für die Moco-Biosynthese in Maus Die Rolle von Frataxin für die Moco-Biosynthese in Maus Fazit Material und Methoden Materialien Verwendete E. co//-stämme Plasmide Primer Antikörper Häufig verwendete Chemikalien, Enzyme und Matrices Geräte, Material und Software Molekularbiologische Arbeiten Klonierungen Isolation von genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana RNA-Isolation RT-Reaktion Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Klonierungs-PCR InversePCR DNA-Sequenzierung Proteinbiochemische Arbeiten Überexpression rekombinanter Proteine in E. coli Affinitätschromatographische Aufreinigung von His-getaggten Proteinen Bestimmung der Proteinkonzentration Konzentrierung von Proteinlösungen Umpuffern von Proteinlösungen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (native PAGE) Immunoblot-Analyse Antikörper-Aufreinigung AO-und XDH-Aktivitätsassay im nativen Gel ABA3-Aktivitätsassay im nativen Gel (nach T. Heidenreich, unveröffentlichte Daten) Bestimmung der Nitratreduktase-Aktivität 120

6 Bestimmung der Sulfitoxidase-Aktivität Bestimmung der pflanzlichen SO-Aktivität mittels kolorimetrischen Sulfitnachweis (nach Pachmayr) Bestimmung der tierischen SO-Aktivität mit Cytochrom c MPT- und cpmp-nachweis über FormA-dephospho und CompoundZ Arbeiten mit Arabidopsis thaliana Pflanzenanzucht Ernte und Verarbeitung des Pflanzenmaterials Ernte von Arabidopsis-Samen Sterilisation von Arabidopsis-Samen Arbeiten mit A. tumefaciens Prinzip der Transformation von A. tumefaciens Kontrolle der Transformation von Agrobakterien Transiente Transformation von N. benthamiana durch Agrobakterien- Infiltration Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Zellbiologische Methoden Kultivierung von tierischen Zellen Bestimmung der Zellzahl Transiente Transfektion tierischer Zellen Vorbereitung der transfizierten Zellen für die Fluoreszenz-Mikroskopie: Fixierung und Permeabilisierung von Zellen Einbettung fixierter Präparate in Mowiol und Fluoreszenz-Mikroskopie Kultivierung von pflanzlichen Zellen Mitochondrienisolation Mitochondrienisolation aus grünen A. thaliana-puanzen (nach Day et a/., abgeändert durch H.P. Braun) Mitochondrienisolation aus Arabidopsis thaliana Zellkulturen (nach Werhahn eral., 2001)! Mitochondrienisolation aus Blumenkohl (nach A.H. Millar, A. Liddell and C.J. Leaver) Subiraktionierung von Blumenkohlmitochondrien Zusammenfassung -J Literaturverzeichnis 133

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