Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 2. Material

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Franziska Eberhardt
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1 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Überblick der Sphingolipidsynthese und der Phospholipid-/Triacylglycerinsynthese De novo Biosynthese von Ceramid Herstellung der komplexen Glykosphingolipide sowie Transport von Ceramid aus dem ER in den Golgi-Apparat Synthese von Phospholipiden und Triacylglycerin Abbau von Phospholipiden sowie Sphingolipiden und Wiederverwertung von Ceramid Ceramidsynthasen Entdeckung Struktur der CerS Proteine aus der Maus sowie deren Gewebeexpressionsmuster und Fettsäureacyl-CoA Spezifität Funktion von Ceramid Aufbau des CerS2 Gens und Proteins Aufbau des CerS4 Gens und Proteins Nervensystem im Säugetier Zelltypen des Nervensystems Myelin Struktureller Aufbau Biochemische Zusammensetzung des Myelins Entwicklung des Myelins Leber Aufbau der Leber Hepatokarzinogenese Ursachen des hepatozellulären Karzinoms Nicht-alkoholische Lebererkrankung Niere Aufbau der Niere Funktion von Ceramiden/Glykosphingolipiden in Nierenerkrankungen Transgene Mäuse als Modellorganismen Erzeugung transgener Mäuse Gene targeting Gene Trap Zielsetzung Material PBS - (Phosphat gepufferte Salzlösung) Lösungen für die Nukleinsäureanalyse Lösungen für die Bakterienkultur Lösungen für die Zellkultur Lösungen für die LacZ-Färbung Lösungen für die Immunoblot-Analyse Lösungen für die Lipidanalytik Anästhetikum Kommerzielle Flüssigkeiten/Lösungen Kommerzielle Reagenziensätze Allgemeiner Laborbedarf... 35

2 2.12 Geräte-Hersteller Nukleinsäuren Oligonukleotidstartermoleküle Plasmide Klonierungsvektoren Hybridisierungssonden Größenstandards DNS, RNS und Protein Lipidstandards Bakterienstämme Eukaryontische Zell-Linie Mauslinien Antikörper Methoden Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren Plasmid-Präparation aus Bakterien Analytische Plasmid-Isolierung (Mini-Präparation) Präparative Plasmid-Isolierung (Midipräparation) aus Bakterien Endotoxin-freie Plasmidisolierung (Maxi-Präparation) Isolierung genomischer DNS aus embryonalen Stammzellen Isolierung genomischer DNS aus Mausschwanzspitzen Isolierung der genomischen DNS aus der Leber Isolierung der Gesamt-RNS aus Leber, Niere und Gehirn Aufreinigung von DNS aus Agarosegelen Gelelution mit kommerziellen Reagenziensätzen Natrium-Acetat-Fällung Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Photometrische Konzentrationsbestimmung Konzentrationsabschätzung im Gel Nukleinsäure-Analysen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) PCR zum Nachweis der Insertion der Rosafary Sequenz ins Genom von transgenen Mäusen (βgeo PCR) PCR zum Nachweis der Anwesenheit der Hygromyzinresistenzkassette in der Rosafary Sequenz in transgenen Mäusen (Hygro PCR) PCR zum Nachweis der Anwesenheit der Flp-Rekombinase in transgenen Mäusen (Flp PCR) PCR zur Erzeugung einer CerS2 Sonde für die CerS2 Southern-Blot Analyse (2_SB Sonde PCR) PCR zur Erzeugung einer CerS6 Sonde zur Ermittlung der CerS6 Transkriptmenge in CerS2 gt/gt Mäusen (CerS6 PCR) PCRs zur Erzeugung des Austauschvektors CerS4KILacZ Fusions-PCR PCR zur Erzeugung der 5 und 3 homologen Region des Retrievalvektors PCR zur Erzeugung des Minitargetingvektors PCR zur Amplifikation des Fusionsprodukts aus dem Spleissakzeptor und einer Teilsequenz des NLS-LacZ Gens PCR für die Amplifikation der 3 homologen Region des Minitargetingvektors (3 HR Mini PCR) PCR für die Amplifikation der verlängerten 3 homologen Region des Testvektors (3 HR Test PCR) PCR zum Nachweis der Insertion im Intron 1 des CerS4 Gens im Genom von HM1 (PCR I) PCR zum Nachweis der homologen Rekombination von Lass4KILacZ in ES-Zellen (ES-Zell PCR)... 55

3 PCR zur Erzeugung der 5 Southern-Blot Sonde für die Charakterisierung der ES- Zell Klone (5 Sonde PCR) PCR zum Nachweis der Deletion der CerS4 kodierenden Region Herstellung rekombinanter Plasmide Spaltung doppelsträngiger DNS mit Restriktionsendonukleasen Modifikationen und Ligation von DNS-Molekülen Auffüllen klebriger Enden (Blunten) Dephosphorylierung von Vektorrückgraten Ligation von DNS-Fragmenten Transformation Herstellung von elektro-kompetenten Bakterien Elektro-Transformation Rekombineering Anlegen von Glyzerinkulturen Sequenzierung Agarosegel-Elektrophorese Native Agarosegel-Elektrophorese von DNS Denaturierende Elektrophorese von RNS Southern-Blot und Northern-Blot Analysen Transfer von DNS (Southern-Blot Analyse) Transfer von RNS (Northern-Blot Analyse) Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden Zellkultur HM1 embryonale Stammzellen der Maus Kultivierung der HM1 ES-Zellen Einfrieren und Auftauen von HM1 ES-Zellen Stabile Transfektion von HM1 ES-Zellen mittels Elektroporation Selektion von HM1 ES-Zellen auf stabile Integration und homologe Rekombination Karyotyp-Analyse homolog rekombinierter ES-Zellklone Vorbereitung der ES-Zellen für die Blastozysteninjektion Zucht- und Haltungsbedingungen von Versuchsmäusen Blastozysteninjektion, Uterustransfer und Chimärismusgrad Histologische Untersuchungen Herstellung von Gefrierschnitten X-Gal Färbung von unterschiedlichen Organen der CerS2 +/gt und CerS2 gt/gt Mäuse Histologische Analyse der Leber, Niere und Gehirn von CerS2 +/+ und CerS2 gt/gt Mäusen Proteinpräparation Herstellung von Gehirnlysaten Proteinbestimmung Immunoblot Analyse Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulose-Membranen Lipidanalytik Ceramidsynthase Aktivitätstest Lipidanalyse über Dünnschichtchromatographie Homogenisierung Lipidextraktion Lipidaufarbeitung Alkalische Hydrolyse DEAE-Anionenaustauschchromatographie Entsalzung der Lipidextrakte Entsalzung über RP Folchextraktion Dünnschichtchromatographie Visualisierung... 78

4 Myelin Präparation und Lipid Analyse von Sphingolipiden im Myelin und dem Ischias- Nerv über die Dünnschichtchromatographie Lipidanalyse über Massenspektroskopie Ergebnisse Charakterisierung von CerS2 Gene Trap Mäusen Charakterisierung der CerS2 Gene Trap Mäuse mittels PCR, Southern-Blot und Northern-Blot Analyse Transkriptmengen der CerS1, CerS4, CerS5 und CerS6 Gene im Gehirn von CerS2 gt/gt Mäusen Vererbungsstatistik β-galaktosidase Reportergen Expression des Fusionsproteins βgeo in CerS2 +/gt und CerS2 gt/gt Mäusen Verhaltensphänotyp in CerS2 gt/gt Mäusen Phänotypische Anomalien in CerS2 gt/gt Mäusen Phänotypische Anomalien des Nervensystems in CerS2 gt/gt Mäusen Morphologie und Anfärbbarkeit des Gehirns in CerS2 gt/gt Mäusen Morphologie eines peripheren Nervs (Trigeminus) von CerS2 gt/gt Mäusen Phänotypische Anomalien der Leber in CerS2 gt/gt Mäusen Phänotypische Anomalien in der Niere von CerS2 gt/gt Mäusen Ceramidsynthase Aktivitätstest Analyse der Lipidzusammensetzung im Gehirn, in der Leber und in der Niere von CerS2 gt/gt Mäusen Analyse der Sphingolipide im Gehirn, in der Leber und in der Niere von... CerS2 gt/gt Mäusen anhand der Massenspektroskopie Analyse der komplexen Sphingolipide sowie der Phospholipide im Gehirn und in der Leber von CerS2 gt/gt Mäusen anhand von Dünnschichtchromatographien Expression des Myelin basischen Proteins in CerS2 gt/gt Mäusen Erzeugung einer nicht konditionalen CerS4 defizienten Mausmutante Herstellung des CerS4KILacZ nicht konditionalen Vektors Analyse der CerS4 BAC Klone Klonierung des Retrievalvektors mit anschließendem Rekombineering Klonierung des Minitargetingvektors mit anschließendem Rekombineering Erzeugung des CerS4 Testvektors Erzeugung und Charakterisierung von homolog rekombinierten CerS4KILacZ HM1 ES-Zellen Blastozysteninjektion ausgewählter homolog rekombinierter ES-Zellklone, Verpaarungen resultierender Mauschimären sowie Genotypisierung der heterozygoten CerS4 +/LacZ Nachkommen β-galaktosidase Expression von Mäusen mit dem Genotyp CerS4 LacZ/+ Maus in der Haut Diskussion Charakterisierung von CerS2 deletierten Mäusen, die durch einen kommerziellen Gene Trap ES-Zellklon erzeugt wurden Biochemische Charakterisierung der CerS2 gt/gt Mäuse Charakterisierung der Leber von CerS2 gt/gt Mäusen Ursache des hepatozellulären Karzinoms Vergleich von CerS2 Gene Trap Mäusen aus den Laboren Futerman und Willecke Charakterisierung der Niere von CerS2 gt/gt Mäusen Charakterisierung des Gehirns von CerS2 gt/gt Mäusen Vergleich der CerS2 gt/gt Mäuse mit und ohne Hygromyzinresistenz auf der Grundlage der neutralen Glykosphingolipide Nicht konventioneller CerS4KILacZ Vektor Ausblick Charakterisierung von CerS2 gt/gt Mäusen

5 6.2 Erzeugung von Ceramidsynthase 4 defizienten Mäusen Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang 162

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