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1 0 INHALTSVERZEICHNIS EINLEITUNG RELEVANZ TROPISCHER REGENWÄLDER FÜR DIE VIRUSDIVERSITÄT EINFLUSS DES MENSCHEN AUF DAS AUFTRETEN NEUARTIGER ERREGER MOSKITOS ALS VIRUSRESERVOIR Infektionen durch Arboviren Relevanz Insekten- restringierter Viren NIDOVIRALES Familie Coronaviridae Unterfamilie Coronavirinae Unterfamilie Torovirinae Familie Roniviridae Familie Arteriviridae FORSCHUNGSHINTERGRUND UND FORSCHUNGSSTAND ZU BEGINN DER ARBEIT ZIELSETZUNG DER ARBEIT MATERIAL CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN PUFFER UND LÖSUNGEN ENZYME BAKTERIENSTÄMME UND PLASMIDE ANTIKÖRPER UND SEREN Primär- Antikörper Sekundär- Antikörper KITS ZELLLINIEN TECHNISCHE GERÄTE VERBRAUCHSMATERIALIEN SOFTWARE PROBENMATERIAL METHODEN ZELLKULTUR Kultivierung der Zelllinien Bestimmung der Zellzahl Anzucht der Viren auf Insektenzellen Endpunktaufreinigung Herstellung von Virusstocks und Titration

2 3.1.6 Wachstumskinetik Infektion der Säugetierzellen Aufkonzentration von Virus mittels Ultrazentrifugation Virusaufreinigung mittels einer Gradientenultrazentrifugation ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN Negativkontrastierung von Viruspellets Herstellung von EM- Dünnschnittpräparaten infizierter Zellen Auswertung am Elektronenmikroskop und fotografische Dokumentation RNA- ISOLIERUNG Extraktion viraler RNA aus Zellkulturüberstand Extraktion der gesamten RNA aus Zellen Phenol- Chloroform Extraktion mittels TRIzol LS CDNA- SYNTHESE Einzelstrang- cdna Doppelstrang- cdna PRIMER- UND SONDENDESIGN POLYMERASEKETTENREAKTION PCR und nested - PCR Quantitative PCR One- Step RT- PCR Generische screening - PCR Unspezifische DNA- Amplifikation Particle- associated nucleic acid - PCR Modifizierte PAN- PCR SIA random - PCR Walking - PCR Amplifikation der Enden von Nukleinsäuren RACE RACE RLM- RACE Scanning - PCR AGAROSE- GELELEKTROPHORESE AUFREINIGUNG VON DNA Aufreinigung von DNA in PCR- Produkten Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen PRÄPARATIVE PLASMID- ISOLIERUNG AUS BAKTERIEN KONZENTRATIONSMESSUNG VON NUKLEINSÄUREN KLONIERUNG UND TRANSFORMATION

3 Klonierung mittels TOPO TA cloning - Kit Klonierung mittels Restriktionsverdau und Ligation EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN EUKARYOTISCHEN ZELLEN HERSTELLUNG EINER STANDARDREIHE FÜR DIE QPCR SANGER- SEQUENZIERUNG PYROSEQUENZIERUNG SEQUENZANALYSE THEORETISCHE ANALYSE VON PROTEINFUNKTIONEN PHYLOGENETISCHE ANALYSE NORTHERN BLOT BRADFORD- ASSAY SDS- POLYACRYLAMID- GELELEKTROPHORESE WESTERN BLOT PROTEINFÄRBUNGEN Coomassie- Färbung eines Proteingels Coomassie- Färbung einer SequiBlot- PVDF- Membran Silbernitrat- Färbung Fast Green- Färbung EDMAN- SEQUENZIERUNG MASSENSPEKTROMETRIE DEGLYKOSYLIERUNG VON PROTEINEN IMMUNFLUORESZENZ- TEST IFT mit Virus- infizierten Insektenzellen IFT mit rekombinanten, viralen Proteinen in Säugetierzellen ERGEBNISSE SEQUENZIERUNG DES CAVALLY- VIRUS VOLLGENOMS PRÄVALENZ NEUER, CAVV- ÄHNLICHER VIREN SEQUENZIERUNGEN DER VOLLGENOME VON HANA- VIRUS, MÉNO- VIRUS, NSÉ- VIRUS UND MOUMO- VIRUS Hana- Virus Nsé- Virus Méno- Virus Moumo- Virus GENOMANALYSE PHYLOGENETISCHE VERWANDTSCHAFTSBEZIEHUNGEN WIRTSTROPISMUS UND MORPHOLOGIE DER MESONIVIREN

4 4.6.1 Herstellung Virusstocks und Ausbildung zytopathogener Effekte Wachstumskinetiken auf Insektenzellen Infektionsversuche von Säugetierzellen Morphologische Untersuchungen IDENTIFIKATION DER VIRALEN MESSENGER RNAS VON CAVALLY- VIRUS CHARAKTERISIERUNG DER FUSIONSSTELLEN DER SG MRNAS VON CAVV TRANSKRIPTIONSMECHANISMUS DER MESONIVIREN EXPRESSION DER MESONIVIRUS- STRUKTURPROTEINE Aufbereitung der Mesonivirus- Proteine Färbung der mesoniviralen Strukturproteine Sequenzierung und Identifikation der Strukturproteine MESONIVIRUS- KREUZREAKTIVITÄT NACHWEIS DER VIRALEN PROTEINE IN INFIZIERTEN ZELLEN SEROLOGIE Immunfluoreszenztest auf Insektenzellen Serologische Untersuchungen der Humanseren Western Blot- Analysen der Humanseren IFT mit rekombinantem CavV- Glykoprotein in Säugetierzellen DISKUSSION GENOMGRÖßE GENOMORGANISATION Replikase- Polyprotein Strukturproteine und akzessorische Proteine MORPHOLOGIE KLASSIFIZIERUNG DER ISOLATE INNERHALB MESONIVIRIDAE TRANSKRIPTIONSMECHANISMUS PROTEINEXPRESSION UND - MODIFIKATION SEROLOGISCHE VERWANDTSCHAFT DER MESONIVIREN UNTEREINANDER PHYLOGENETISCHE VERWANDTSCHAFT EVOLUTION DER MESONIVIREN VORKOMMEN DER MESONIVIREN ISOLATION DER MESONIVIREN ÜBERTRAGUNG DER MESONIVIREN ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG

5 8.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VEKTORKARTEN PRIMERTABELLE PROTEIN- ALIGNMENTS ERKLÄRUNG ZUR DISSERTATION VORVERÖFFENTLICHUNGEN DANKSAGUNG