Molekulare Diagnostik Hans Nitschko

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1 Molekulare Diagnostik Hans Nitschko

2 Nachweis viraler Erreger durch molekularbiologische Methoden Antikörpernachweise Nachweis antigenspezifischer T-Zellen Neutralisationsteste Nachweis Therapie-resistenter Viruspopulationen Infektionsketten

3 Nachweismethoden Indirekte (Serologische) Nachweismethoden ELISA µ-capture ELISA Immunfluoreszenztest (IFT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Hämagglutinationshemmtest (HHT) Western Blot (WB) Neutralisationstest (NT)) Direkte Nachweismethoden Polymerase Ketten Reaktion (PCR) Quantitative PCR Antigennachweis (ELISA) Antigennachweis (Schnelltest) Virusisolierung Antigennachweis nach Virusinfektion in der Zellkultur Sequenzierung Elektronenmikroskopie

4 ELISA

5 ELISA Testprinzip 1. Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte ELISA1

6 ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation ELISA2

7 ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper ELISA3

8 ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation ELISA4

9 AntigenNachweis Antigen Nachweis

10 Antigen-Schnelltest Testprinzip 1. Mit Antikörper beschichtetes Röhrchen Antigen-ELISA1

11 Antigen-Schnelltest Testprinzip 2. Inkubation mit Patientenmaterial Antigen-ELISA2

12 Antigen-Schnelltest Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper Antigen-ELISA3

13 Antigen-Schnelltest Testprinzip 4. Substratinkubation Antigen-ELISA4

14 ELISA Mikrotiterplatte

15 µ-capture ELISA Testprinzip 1. Anti-IgM beschichtete Mikrotiterplatte µ Capture1

16 µ-capture ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation µ Capture2

17 µ-capture ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antigen µ Capture3

18 µ-capture ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation µ Capture4

19 PCR, RT- PCR, q-pcr

20 TaqMan 5 -nuclease assay -principle Pol R Q Pol R Q Amplification R R Pol Q Pol Q HBV-polymerase gene human DNA, different targets

21 HN April 2001 Sensitivity of HBV-TaqMan

22 Precision of assay 4000, 2000, 1000, 500 Geq. / ml 2-fold replicat es HN April 2001

23 HN April 2001 Linearity of HBV-TaqMan

24 Sequenzierung

25 Sequenzierung LMU Bestimmung der Basenabfolge in einer Nukleinsäure = GOLDSTANDARD Einsatzfelder: Genotypisierung Resistenzbestimmung Infektionsketten Verifizierung von PCR-Produkten Detektion von Mutanten SNP (single nucleotide polymorphism)...

26 Sequenzierung Ablauf Seq.Ablauf PCR Sequenzierreaktion Elektrophorese Auswertung

27 Sequenzierung Testprinzip ds DNA 5 GCATATGTCAGTCCAG 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 Sequ. Testprinzip primer annealing 5 GCAT 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 excess datp, dttp, dctp, dgtp ddatp Taq ddttp Taq ddctp Taq ddgtp Taq 5 GCATA 5 GCATAT 5 GCATATGTC 5 GCATATG 5 GCATATGTCA 5 GCATATGT 5 GCATATGTCAGTC 5 GCATATGTCAG 5 GCATATGTCAGTCCA 5 GCATATGTCAGT 5 GCATATGTCAGTCC 5 GCATATGTCAGTCCAG electrophoresis

28 Sequenzierung LMU Halbe PCR 30-fache Amplifikation DNA Puffer cycle sequencing HN Feb 2004

29 Sequenzierung LMU Methodik Auftrennung der Extensionsprodukte nach Länge Primer (Probleme: 70% DNA, 10% Inhib., 10% Primer, 10% Cycling u.a.)

30 Sequenzierung LMU Plattenformat (line tracking) HN Feb 2004

31 Sequenzierung LMU Elektropherogramm HN Feb 2004

32 ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät Laserebene HN Feb 2004

33 ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät HN Feb 2004

34 Beckman Coulter LMU CEQ Kapillaren, 100 Basen/10 min Erste Peaks nach 20 min HN Feb Mikrotiterplatten

35 Kapillar- Sequenzierung Gele gießen entfällt Kein manueller Probenauftrag Kein line tracking Kein cross talk Keine Platten- Reinigung Variabler Volumeneinsatz während des Laufs Hoher Durchsatz LMU

36 Kapillar- Sequenzierung II LMU HN Feb 2004

37 Sequenzierung LMU Proben- Einzug (im nl- Maßstab) durch Anlegen von Spannug HN Feb 2004

38 HBV-Genom LMU Zirkuläre DNA 4 Gene: S surface P polymerase C core X x-gen HN Feb 2004

39 Lamivudine Therapie 1. HBV Sequenz HBV Sequenz

40 HBV Sequenz ierung HBV Sequenzen eines Patienten unter LamivudinTherapie

41 Sequenzierung Polymorphismus an Position 552 der HBV-Polymerase Übergang von Wildtyp M zu resistenter Mutante I sense antisense ATG = Met (M), ATT = Ile (I) HN April 2001

42 Sequenzierung Auswertung HBV Auswertung Blutentnahme (vor Lamivudin) (unter Lamivudin) Aminosäure (Position 552) Nukleinsäure-Triplet Resistenzmutation (ja/nein)? M ATG nein I ATT ja; 400-fach

43 Sequenzierung LMU HN Feb 2004

44 Sequenz: HBsAG-conformation HBs3 HBs HBs1 C 110 C 124 C C C HBs2 C 139 C C N G 145 G>R (vaccine escape) HBs HN April

45 Sequenz: HBsAG-vaccine escape 130 C 124 C C C 139 C N G HN April mutations associated with vaccine failure

46 Sequenz: HBsAG-diagnostic failure mutations Diagnostic failures 130 C C 124 C C 139 C N G 145 C HN April of 5: no obvious aa changes

47 Sequenzierung HBV LMU HN Jun 2010

48 Sequenzierung HBV LMU HN Jun 2010

49 Sequenzierung HIV LMU PR RT HN Feb 2004

50 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010

51 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010

52 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010

53 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010

54 Immunfluoreszenz Test Immunfluoreszenz Test

55 RFLP Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus

56 RFLP Analyse

57 HCV-RFLP DrdI BsmaI BsrI Sau3A HinfI Schnell & billig Ø Ø Ø Ø Ø?

58 Western Blot Analyse

59 FACS Analyse Fluorescence activated cell sorting

60 Renal transplant recipients II LMU Clinically asymptomatic: O Mononucleosis like symptoms:

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