Diagnostik von Epstein-Barr-Virusinfektionen: Serologie vs Virusgenomnachweis

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1 Diagnostik von Epstein-Barr-Virusinfektionen: Serologie vs Virusgenomnachweis Nikolaus Müller-Lantzsch und Barbara Gärtner Institut für Virologie, Homburg/Saar

2 Das Epstein - Barr Virus (EBV) 1964 von Epstein und Barr erstmals beschrieben Mitglied der Herpesvirusfamilie: Homologien: Zielzellen: Rezeptor: Verbreitung: Enthält eine doppelsträngige DNA von Basenpaaren, kloniert, sequenziert. zu anderen Herpesviren (HSV1, DNA - Polymerase, Ribonukleotid- Reduktase, Thymidinkinase). B - Lymphozyten und undifferenzierte Epithelzellen des Rachens und des Zungenrandes. Rezeptor für die Komplementkomponente C3 d (145 KDa Glykoprotein CR - 2) Ubiquitär, 95%ige Durchseuchung

3 Biologie der EBV - Infektion 1. Produktive Infektion im Mund-Rachenraum (Zungenepithel). Ausscheidung mit dem Speichel. 2. Nicht - produktive Infektion von zirkulierenden B - Zellen, die immortalisiert bzw. transformiet werden. Immunabwehr und Eliminierung durch cytotoxische T-Zellen (LYDMA). 3. Reaktivierung des EBV bei ca. 20 % aller gesunden und seropositiven Personen im Mund - Rachenraum und Ausscheidung mit dem Speichel. 4. EBV im Genitaltrakt?

4

5 Erkrankungen mit Beteiligung von EBV Magenkarzinome Immungesunde Immunsupprimierte Mononukleose Div. Lymphome Orale Haarleukoplakie Burkitt-Lymphom Hämophagozytensyndrom Chronische EBV Infektion X-chrom. Immundefekt (XLP) Nasopharynx-Karzinom M. Hodgkin Lymphome z.b. PTLD AIDS, TX

6

7 Epstein-Barr Virus Primärinfektion Reaktivierung Tumorerkrankung

8 Therapie der Mononukleose Aciclovir Verkürzt hoch signifikant die Virusausscheidung Hat keinen Einfluss auf die Symptome Torre 1999 Kortikosteroide Evtl. in fulminanten Fällen gerechtfertigt, bisher aber kein Effekt in randomisierten Studien nachgewiesen

9 Organisation des EBV-Genoms

10 EBV Nachweismethoden Indirekte Nachweismethoden Nachweis heterophiler Antikörper (Schnelltest) Paul-Bunnell Test (Schaferys) Monospot (Pferdeerys) ELISA (VCA-IgG, -IgM, EBNA-1, EA-IgG, -IgM. Blot rekombinante Blots Lysat Blots Lineblots Immunfluoreszenz Direkte Nachweismethoden Viruslastbestimmung mittels PCR Histologische Techniken

11 Prävalenz von EBV in Deutschland EBV-VCA-IgG positiv (in %) Alter in Jahren 3254 Seren aus der Uniklinik Homburg

12 Ziele der EBV Diagnostik Immungesunde Unterscheidung der EBV Primärinfektion von EBV negativen oder Patienten mit alten Infektionen Antikörperuntersuchungen Immunsupprimierte und Tumorerkrankungen Nachweis der Krankheitsaktivität PCR VCA-IgA (als Tumormarker/Nasopharynxcarzinom)

13 Diagnostik bei Immungesunden Wie war das noch mal mit dem EBNA-1? Welche Antikörperkonstellationen sind mehrdeutig? Welche Lösungsstrategien gibt es?

14 Die wichtigsten viralen Antigene in der EBV - Diagnostik VCA Viruskapsidantigen (Strukturproteine), Indirekte Immunfluoreszenz (IF), ELISA, WB EA Early antigen = Frühe Proteine (Regulatorische Proteine), Indirekte Immunfluoreszenz (IF), ELISA, WB EBNA 1 Epstein - Barr Virus spezifisches nukleäres Antigen 1 (Regulatorisches Kernprotein, für DNA - Replikation wichtig), Antikomplimentäre Immunfluoreszenz (ACF), IF, ELISA, WB EBNA 2 Epstein - Barr Virus spezifisches nukleäres Antigen 2 (Regulatorisches Kernprotein, Transaktivator viraler und zellulärer Gene) ACF, IF, ELISA, WB

15 Antikörpernachweis während der Primärinfektion Infektion Symptome VCA-IgG VCA-IgM EBNA-2-IgG EA-IgG EBNA-1-IgG

16 Antikörpernachweise während einer serologischen Reaktivierung VCA-IgG EBNA-2-IgG EBNA-1-IgG VCA-IgM? EA-IgG

17 Was brauchen wir wirklich an Diagnostik Infektion Symptome VCA-IgG VCA-IgM EBNA-1-IgG

18 Interpretationsschema VCA-IgG VCA-IgM EBNA-1-IgG Interpretation Seronegativ +(-) + - Primärinfektion Alte Infektion Antizelluläre Reaktionen?????????

19 Probleme in der serologischen EBV-Diagnostik Alle Parameter positiv Wiederauftreten von IgM während einer Reaktivierung EBNA-1-IgG bereits früh gebildet in der Primärinfektion Isoliertes VCA-IgG Fehlendes IgM in der Primärinfektion Fehlende EBNA-1 Bildung/EBNA-1 Verlust z.b. während serologische Reaktivierung Primärinfektion und alte Infektion können gleich aussehen

20 Wie häufig sind dieses problematischen Seren? Alte Infektionen negativ 6% 7% 4% 6% Primärinfektionen Antizelluläre Reaktionen Unklar : isoliert VCA-IgG positiv 77% Analyse von 3622 Seren einer Routinediagnostik Bauer Clin Lab 2001

21 Lösungsstrategien Nachweis eines späten VCA-IgG (p18 im Blot) p18 negativ (bei isoliert positiven VCA-IgG) = Primärinfektion Aviditätstestung Niedrig avide Antikörper = Primärinfektion Hoch avide Antikörper = alte Infektion Heterophile Antikörper positiv = Primärinfektion negativ = keine Aussage möglich PCR Flexibler Grenzwert

22 Sinnvolle serologische Stufendiagnostik beim Immungesunden EBNA-1 IgG positiv negativ Alte Infektion VCA-IgG positiv VCA-IgM negativ Seronegativ positiv negativ Primärinfektion Weiterführend Diagnostik z.b. Avidität, Blot, PCR

23 Diagnostik bei Immunsupprimierten Warum funktionieren die Antikörperteste nicht? Was bringt die Viruslast? Wie war das damals mit dem prädiktiven Wert? Wie muss die Viruslast interpretiert werden?

24 Serologische Diagnostik bei Immunsupprimierten HIV Dialyse Transplantation Patienten gesamt Blutspender EBV PCR Positiv Negativ Positiv Negativ Positiv Negativ Positiv Negativ Negativ Gärtner, J Clin Microbiol 2000 N Serologische Reaktivierungen 9 (75%) 16 (89%) 2 (50%) 4 (21%) 4 (27%) 2 (13%) 15 (48%) 16 (32%) 4 (13%) p 0,31 0,23 0,36 0,59

25 Warum funktionieren Antikörperteste bei Immunsupprimierten nicht? Die serologische Reaktivierungen korrelieren nicht mit den Viruslastbefunden, daher sollte bei Immunsupprimierten auf eine serologische Diagnostik verzichtet werden passiv übertragene Antikörper inkonstante Bildung von Antikörper, lange Persistenz von Antikörpern Bei z.t. fulminanten Erkrankungen kommt eine Diagnostik auf Antikörpergrundlage zu spät

26 Sinnvolle Diagnostik bei Immunsupprimierten und hohem Risiko für Lymphome VCA-IgG, EBNA-1-IgG Seropositiv Seronegativ Bei TX (mit positivem Spender) EBV-PCR in einem regelm. Monitoring

27 ACV: Aciclovir DLI: Donor-Lymphozyten, adoptiver-t Zell Transfer Verlauf der EBV Viruslast bei Patienten mit PTLD EBV Viruslast in Kopien/µ gdna ACV 2. Transplantation PTLD Tage nach Transplantation Rituximab EBV Viruslast in Kopien/µ gdna ACV Antivirale Therapie DLI Tage nach Transplantation Rituximab PTLD

28 ACV: Aciclovir GCV: Ganciclovir Verlauf der EBV Viruslast bei Patienten ohne PTLD EBV Viruslast in Kopien/µ gdna ACV EBV Viruslast in Kopien/µ gdna ACV GCV Tage nach Transplantation Tage nach Transplantation

29 Bedeutung der EBV Viruslast nach SCT p < 0,0001 EBV-Kopien/µg DNA negativ Grenzwertberechnung für die EBV Viruslast: 10 5 Kopien/µg DNA Sensitivität: 91 % Spezifität: 93% negativ ohne PTLD PTLD Gärtner J Clin Microbiol 2002, aktualisiert 4/2004

30 Bedeutung der Viruslast II Hohe Werte ergeben nur bedingt eine Aussage zu einer PTLD EBV nur indirekt beteiligt EBV nur ein Kofaktor EBV spielt eine unterschiedliche Rollen, z. B. Hit and Run Vermutlich ausschlaggebend ist die Reaktivität des Immunsystems

31 Zusammenfassung In der Diagnostik benigner Erkrankungen von Immungesunden steht die Antikörperdiagnostik im Vordergrund mit den Kernfragen: Primärinfektion -alte Infektion - Seronegativ Hierfür sind die VCA-IgG, VCA-IGM und EBNA-1-IgG in den meisten Fällen ausreichend Lösungsstrategien für mehrdeutige Antikörpermuster sind: Nachweis von p18 Avidität heterophile Antikörper PCR Bei Erkrankungen von Immunsupprimierten ist die EBV- Viruslastmessung mittels PCR die Methode der Wahl (Monitoring). Aufgrund der Pathogenese der Erkrankungen ist die Interpretation nicht trivial.

32 ENDE

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