Johannes Gutenberg-Universität Mainz Fachbereich Biologie, Institut für Zoologie Leitung: Prof. Dr. Wolfrum Datum: 15. April 2005

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1 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Fachbereich Biologie, Institut für Zoologie Leitung: Prof. Dr. Wolfrum Datum: 15. April 2005 F1 Molekulare Zoologie Teil II: Expressionsanalyse Proteinexpressionsanalyse mittels SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse I. Einleitung

2 Bei der Gelelektrophorese wandern Moleküle aufgrund ihrer elektrischen Ladung und Größe entlang eines elektrischen Feldes in einer Gelmatrix. Dieses Prinzip wird benutzt, um α-actin und α-tubulin aus en und gewebe von Astacus leptodactylus anhand von bekannten Markermolekülen nachzuweisen. Die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese) ist eine spezielle Gelelektrophorese, bei der Moleküle von einem negativ geladenen Mantel des SDS (Natriumdodecylsulfat, H 3 C-(CH 2 ) 11 -O-SO - 3 Na + ) umgeben werden, so dass sie nur aufgrund ihrer Größe durch das Polyacrylamid-Gel wandern. Die Proteinladung entfällt somit als Trennkriterium. Bei einem Western-Blot handelt es sich um die Übertragung von Proteinen auf eine Trägersubstanz nach der Auftrennung mittels Gelelektrophorese. Der Auftrag auf die Nitrocellulosemembran bewirkt eine Immobilisierung der Proteine. Ein spezifischer Nachweis eines Proteins kann mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgen und mittels einer Farbstoffreaktion nachgewiesen werden. II. Material und Methode Angaben zum verwendeten Material und den angewandten Methoden befinden sich im Skript auf den Seiten 1-9. Abweichungen vom Skript werden im Folgenden aufgelistet: - anstatt den vorgegebenen 0,5 ml wurden nur 250 µl RIPA-Puffer verwendet - die 1,5 µl Proteinprobe 1 (/Medulla terminalis) wurde nicht 1:1 mit Puffer versetzt, statt dessen wurden 5 µl Puffer dazugegeben - die 1,2 µl Proteinprobe 2 () wurde nicht 1:1 mit Puffer versetzt, statt dessen wurden 5 µl Puffer dazugegeben - es wurde jeweils nur eine halbe Stunde in Blockierungslösung I und II blockiert III. Ergebnisse a) Photometrische Bestimmung (mittels Bicinchoninsäurereaktion) bei 280 nm: /Medulla terminalis, interna und externa: 33,496 µg in 5 µl Für die Beladung der Geltasche werden 10 µg Protein benötigt: 5 µl 33,496 µg x µl 10 µg x = 1,4927 µl 2

3 : 41,5427 µg in 5 µl Für die Beladung der Geltasche werden wiederum 10 µg Protein benötigt: 5 µl 41,54 µg x µl 10 µg x = 1,2 µl b) SDS-PAGE Proteinmarker Proteinmarker I kda 116,0 66,2 60,2 45,0 35,0 25,0 18,4 14,4 Abb. A. Coomassie gefärbtes Gel einer SDS-PAGE von - und proteinen von Astacus leptodactylus Es wurden ein Proteinmarker und jeweils zwei Proben von - und auf das Gel aufgetragen. Das Gel zeigt in allen vier Probespuren viele distinkte Proteinbanden. Prominente Banden sind im Bereich von 66 kda sowohl im als auch im zu erkennen. Ebenfalls fallen zwei aneinander liegende Banden im Bereich von 35 und 45 kda auf. Zwischen 25 und 18,4 kda (bei ca. 20 kda) sind nur in den Spuren der proteine intensive Banden zu beobachten. 3

4 c) Western Blot Proteinmarker 1 kda 116,0 60,2 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 14,4 α-tubulin Ak α- Aktin Ak Abb. B. Westernblot einer SDS-PAGE von - und proteinen von Astacus leptodactylus Es wurde die durchgeführte SDS-PAGE gegen spezifische Antikörpern (α-tubulin Ak und α- Aktin Ak) geblottet. Die mit α-tubulin Ak behandelte Membran zeigt nur beim gewebe eine Bande bei etwa 58 kda. Beim Gewebe des s ist keine Bande zu erkennen. Nach Behandlung der Membran mit α- Aktin Ak sind in beiden Geweben je eine Bande in der Höhe von ca. 45 kda zu beobachten. IV. Diskussion Aus den verschiedenen Proteinbanden der SDS-PAGE konnten mittels Western-Blot-Analyse Banden zweier verschiedener Größen detektiert werden. Diese gehen jeweils auf die spezifische Reaktion der Proteine mit den entsprechenden Antikörpern zurück. Die aus der SDS-PAGE sichtbar gewordene dominante Bande zwischen 66,2 kda und 45 kda konnte bei dem Gewebe des s mittels Western-Blot als α-tubulin identifiziert werden, die bei ca. 55 kda liegt. Da im Blot in der Spur des s keine Bande zu sehen war, ist 4

5 zu vermuten, dass die Proteinmenge möglicherweise nicht ausreichend war um α-tubulin mittels dieser Methode zu detektieren. Die bei der SDS-PAGE bei ca. 45 kda sowohl in der Spur des s als auch des s liegenden schwachen Banden konnten mittels Western-Blot-Analyse als α- Aktin identifiziert werden. Die Banden liegen hier bei etwa 42 kda. Sowohl dieser Wert, als auch der Wert des α-tubulin stimmen mit den in der Literatur angegebenen Werten näherungsweise überein. 5