Biochemisches Grundpraktikum. Elektrophoretische Trennung von Proteinen

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Dieter Fürst
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1 Biochemisches Grundpraktikum Versuch Nummer G-05 05: Elektrophoretische Trennung von Proteinen

2 Gliederung: I. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 2 a) Versuchsziele, Aufgaben... 2 b) Versuchsdurchführung... 2 c) Meßergebnisse und Beobachtungen... 2 d) Auswertung und Diskussion... 2 II. Gelelektrophorese mit Celluloseacetat-Folien... 4 a) Versuchsziele, Aufgaben... 4 b) Versuchsdurchführung... 4 c) Meßergebnisse und Beobachtungen... 4 d) Auswertung und Diskussion

.. 2 d) Auswertung und Diskussion... 2 II. Gelelektrophorese mit Celluloseacetat-Folien.

3 I. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese a) Versuchsziele, Aufgaben Mit der SDS-Gelelektrophorese soll die relative Molmasse von LDH bestimmt werden. b) Versuchsdurchführung Dieser Versuchsteil wurde wie im Skript angegeben durchgeführt. c) Meßergebnisse und Beobachtungen Abb. I-1 zeigt eine Photographie der erhaltenen Gelelektrophorese. Neben den Banden sind die Rf-Werte angegeben. Die Laufstrecken sind in Tabelle I-1 unter d) zu finden. Abb. I-1: SDS-Page Da die Bedingungen denaturierend waren, ist nur eine Aussage über die Größe möglich. d) Auswertung und Diskussion Für die Auswertung wurden die rel. Molmassen der Markerproteine und ihre Rf- Werte benötigt. Sie sind in Tabelle I-1 aufgeführt. Aus dem linearen Bereich der Auftragung (Diagramm I-1, Seite 3) wird der entsprechende Rf-Wert auf die Gerade projiziert und über den erhaltenen logarithmischen Wert die Molmasse errechnet. Im Skript ist die Molmasse der LDH mit 35 kda angegeben. Die Berechnungen aus unseren Meßwerten ergaben eine Molmasse von 35.4 kda. Obwohl unsere gesamte Laufstrecke relative kurz war, ist dieser Wert sehr gut. Da nur eine Messung durchgeführt worden ist, kann allerdings nichts über seine tatsächliche Genauigkeit gesagt werden. Probleme bei der Gelelektrophorese können vor allem dann auftreten, wenn das Gel nicht gleichmäßig gegossen wurde. Pipettierfehler spielen in diesem Fall keine große Rolle, da es nur auf die Molmasse ankommt, die unabhängig von der eingesetzten Konzentration ist

Neben den Banden sind die Rf-Werte angegeben. Die Laufstrecken sind in Tabelle I-1 unter d) zu finden. Abb.

4 Masse / log(masse) Laufstrecke Rf-Wert kda /cm Laufstrecke gesamt 3.15 Markerproteine LDH Tabelle I-1: Meßwerte und Auswertung Massenbestimmung mit Gelelektrophorese Markerproteine LDH linear Rf-Werte log(masse) Diagramm I-1: Graphische Bestimmung der Molmasse - 3 -

57 Tabelle I-1: Meßwerte und Auswertung Massenbestimmung mit Gelelektrophorese 1.2 1.0 0.

5 II. Gelelektrophorese mit Celluloseacetat-Folien a) Versuchsziele, Aufgaben Während im ersten Versuchsteil unter denaturierenden Umständen gearbeitet wurde, sollen hier native Konformationen der LDH (Isoenzyme) spezifisch nachgewiesen werden. Zudem erfolgt die Trennung lediglich nach der Ladung, nicht nach der Größe. b) Versuchsdurchführung Auch dieser Versuchsteil wurde den Anweisungen des Skripts gemäß durchgeführt. c) Meßergebnisse und Beobachtungen Im folgenden sind schematisch die erhaltenen Ergebnisse dargestellt: - Laufrichtung M 4 HM 3 HM 2 2 HM 3 H 4 + HM 4 4 H L HM N H L N (H4M4 = Marker, H = Herz, L = Leber, N = Niere) 4 4 HM 4 4 Die grünen Banden sind die erwarteten, die blauen die tatsächlich sichtbaren. d) Auswertung und Diskussion Durch die unterschiedliche Ladung werden die verschiedenen Untereinheiten getrennt. Am schnellsten wandert dabei H4, da es die meisten negativen Ladungen trägt, am langsamsten M4. Dementsprechend ergeben sich für die kombinierten Untereinheiten dazwischen liegende Laufgeschwindigkeiten. Die einzelnen Kombinationen sind links neben den Folien angegeben. Auf der ersten und der dritten Folie sind die Markerbanden deutlich zu erkennen gewesen. Das Fehlen der Banden auf der zweiten Folie ist eventuell durch Auftragungsfehler zu erklären. Zusätzlich fehlen auf der zweiten Folie die Banden des Nierenextrakts, was wahrscheinlich auch an einer fehlerhaften Auftragung liegt. Dahingegen entsprechen die drei Banden des Nierenextrakts auf der dritten Folie den Erwartungen, denn in der Niere kommen alle Tetramere vor. Die Tatsache, daß die Banden des Leberextrakts nicht zu erkennen waren, kann in einer fehlerhaften Lösung begründet sein. Zudem war die Farbe insgesamt sehr schwach, so daß die Banden nicht ausreichend zu sehen waren

b) Versuchsdurchführung Auch dieser Versuchsteil wurde den Anweisungen des Skripts gemäß durchgeführt.

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