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1 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Klassifizierung und Struktur von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren Purinerge Rezeptoren Pharmazeutische Bedeutung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren Di- und Oligomerisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren Adenosin-Rezeptoren Physiologische Funktionen von Adenosin-Rezeptoren Pharmazeutische Bedeutung von Adenosin-Rezeptoren Liganden und Ligandenbindungsstellen der Adenosin-A 2A -... und -A 2B -Rezeptoren Di- und Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren Ziele der Arbeit I

2 2 Methoden Charakterisierung der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors und Expression in CHO-Zellen Kompetitionsexperimente Funktionelle Experimente: camp-akkumulation Computermodell der ha 2B (EL2-hA 2A )-Rezeptor-Mutante Homodimerisierung von humanen Adenosin-A 2B -Rezeptoren Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer Verdrängungsexperimente Einfluss von Liganden auf die Homodimerisierung Einfluss der M198A-Mutation auf die Adenosin-A 2B -... Homodimerisierung Computermodell des Adenosin-A 2B -Rezeptor-Homodimers Heterodimerisierung von humanen Adenosin-A 2A - und... -A 2B -Rezeptoren Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer Verdrängungsexperimente Einfluss von Liganden auf die Heterodimerisierung Konfokale Mikroskopie Computermodell des Adenosin-A 2A -A 2B -Rezeptor Heterodimers Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren:... Elektrophorese-Experimente Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Blaue Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese II

3 3 Ergebnisse Charakterisierung der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors und Expression in CHO-Zellen Kompetitionsexperimente Funktionelle Experimente: camp-akkumulation Computermodell der ha 2B (EL2-hA 2A )-Rezeptor-Mutante Homodimerisierung von humanen Adenosin-A 2B -Rezeptoren Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer Verdrängungsexperimente Einfluss von Liganden auf die Homodimerisierung Einfluss der M198A-Mutation auf die Adenosin-A 2B -... Homodimerisierung Computermodell des Adenosin-A 2B -Rezeptor-Homodimers Heterodimerisierung von humanen Adenosin-A 2A - und... -A 2B -Rezeptoren Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer Verdrängungsexperimente Einfluss von Liganden auf die Heterodimerisierung Konfokale Mikroskopie Computermodell des Adenosin-A 2A -A 2B -Rezeptor Heterodimers Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren:... Elektrophorese-Experimente Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Blaue Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese III

4 4 Diskussion Charakterisierung der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors und Expression in CHO-Zellen Kompetitionsexperimente Funktionelle Experimente: camp-akkumulation Computermodell der ha 2B (EL2-hA 2A )-Rezeptor-Mutante Zusammenfassende Diskussion Homodimerisierung von humanen Adenosin-A 2B -Rezeptoren Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer Verdrängungsexperimente Einfluss von Liganden auf die Homodimerisierung Einfluss der M198A-Mutation auf die Adenosin-A 2B -... Homodimerisierung Computermodell des Adenosin-A 2B -Rezeptor-Homodimers Zusammenfassende Diskussion Heterodimerisierung von humanen Adenosin-A 2A - und... -A 2B -Rezeptoren Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer Verdrängungsexperimente Einfluss von Liganden auf die Heterodimerisierung Konfokale Mikroskopie Computermodell des Adenosin-A 2A -A 2B -Rezeptor Heterodimers Zusammenfassende Diskussion Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren:... Elektrophorese-Experimente Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Blaue Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zusammenfassende Diskussion IV

5 5 Zusammenfassung und Ausblick Experimenteller Teil Allgemeine Angaben Geräte und Materialien Chemikalien Kits Radioliganden Antikörper Zelllinien Puffer und Lösungen Lösungen für die Molekularbiologie Lösungen für die Zellkultur Lösungen für die Membranpräparation Lösungen für die Proteinbestimmung Puffer für Radioligand-Bindungsstudien Puffer für funktionelle camp-experimente Puffer für Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-... Experimente Puffer und Lösungen für die Immunzytochemie Puffer und Lösungen für die Oozyten Puffer und Lösungen für... Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Puffer und Lösungen für die Blaue Native... Polyacrylamid-Gelelektrophorese Puffer und Lösungen für den Western Blot Molekularbiologische Experimente Vektorkarten cdna Primer Sequenzierungsprimer Enzyme V

6 6.3.6 Polymerase-Kettenreaktion Agarose-Gelelektrophorese für DNA Extraktion von DNA aus dem Agarosegel Restriktionsverdau Restriktionsverdau methylierter DNA Ligation mit T4-DNA-Ligase Transformation in Escherichia coli Retransformation Selektion und Kultivierung von Bakterien-Monoklonen Glycerinkulturen Mini-/Midi-/Maxipräparation von DNA Konzentrationsbestimmung von DNA Sequenzierung Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des A 2B -Rezeptors... mittels Overlap-Extension Klonierung von Rezeptor-DNA in einen Vektor Mutagenese von M198A in den humanen A 2B -Rezeptor Klonierung von Erkennungssequenzen an Rezeptor-DNA Linearisierung von DNA für die RNA Synthese RNA-Synthese Agarose-Gelelektrophorese für RNA Konzentrationsbestimmung von RNA Zellkultur Medien Auftauen von Zellen Kultivierung von Zellen Zellzahlbestimmung Einfrieren von Zellen Retrovirale Transfektion Transiente Transfektion Membranpräparation Gewinnung von camp-bindeprotein VI

7 6.7 Proteinbestimmung Proteinbestimmung nach Lowry Proteinbestimmung nach Bradford Kompetitionsexperimente Radioligand-Bindungsstudien an Adenosin-A 2B -Rezeptoren Radioligand-Bindungsstudien an Adenosin-A 2A -Rezeptoren Funktionelle camp-experimente Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Experimente Verdrängungsexperimente Einfluss von Liganden Immunzytochemie Oozyten Gewinnung von Oozyten aus Xenopus laevis Injektion von RNA in Oozyten Metabolische Markierung mit [ 35 S]Methionin Markierung mit Cy3 oder Cy Aufbereitung der Oozyten Aufreinigung über His-markierte Proteine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese Western Blot Abkürzungsverzeichnis Allgemeine Abkürzungen Abkürzungen von Aminosäuren Literaturverzeichnis VII

1. Einleitung S. 1 1.1. Zelladhäsionsmoleküle S. 1 1.2. Die Immunglobulin-Superfamilie S. 2. 1.2.1. Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM S.

1. Einleitung S. 1 1.1. Zelladhäsionsmoleküle S. 1 1.2. Die Immunglobulin-Superfamilie S. 2. 1.2.1. Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM S. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung S. 1 1.1. Zelladhäsionsmoleküle S. 1 1.2. Die Immunglobulin-Superfamilie S. 2 1.2.1. Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM S. 4 1.2.1.1. Molekulare Struktur von NCAM S.

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