Drexler G.A. 1, Derer A 1, Dirks W.G. 2, Hable V. 3, Greubel C. 3, Burgdorfer C. 3, Dollinger G. 3, Du G. 4, Friedl A.A. 1

Transkript

1 Nutzung von bi-cistronischen Vektoren für die Beobachtung der Rekrutierung von Signal- und Reparaturproteinen an DNA-Schäden nach Ionen- Mikrobestrahlung durch Live-Cell Imaging Drexler G.A. 1, Derer A 1, Dirks W.G. 2, Hable V. 3, Greubel C. 3, Burgdorfer C. 3, Dollinger G. 3, Du G. 4, Friedl A.A. 1 1 Ludwig-Maximilians-Universität München, Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, AG Molekulare Strahlenbiologie, München, 2 DSMZ, Department of Human and Animal Cell Culture, Braunschweig, 3 Bundeswehr-Universität München, Institut für Luft- und Raumfahrttechnik LRT2, München, 4 TU München, Physik Department E12, München Funding: Kompetenzverbund Strahlenforschung, BMBF, BfS, DFG Excellenzcluster MAP, European Science Foundation,

2 Wie werden DSBs visualisiert? Nach DNA-Doppelstrangbruch (DSB) Induktion durch ionisierende Strahlung akkumulieren DNA Reparatur- und Signalproteine am Ort des DNA-Schadens in sehr großer Menge, so dass sie mittels Immunfluoreszenz (A) oder durch GFP-Markierung (B) visualisiert werden können. A) Immunfluoreszenzfärbung B) GFP-Markierte Proteine Signalprotein 53BP1 (grün) akkumuliert an DSB nach 55 MeV Kohlenstoffbestrahlung (1,5 h nach Bestrahlung, Zellkerne sind blau angefärbt (DAPI), Ionen wurden in einer 5 x 5 µm Matrix appliziert) Vorteile: unaufwendig flexibel (wenn Antikörper vorhanden) Nachteile: Momentaufnahme (da Zellen getötet werden) sehr schnelle Ereignisse können nicht erfasst werden Signalprotein MDC1-GFP akkumuliert an DSB nach 55 MeV Kohlenstoffbestrahlung. Film zeigt real-time Aufnahmen des Ionenstrahls (diffuser Fleck, der linienartig über die Zellen wandert) und die MDC1-Bindung an die geschädigte DNA (grüne Linienstrukturen in den Zellkernen) Vorteile: sehr schnelle Prozesse können erfasst werden kontinuierliches Betrachten möglich Nachteile: aufwendige Klonierung und Transfektion keine stabile Expression des GFPmarkierten Proteins mit herkömmlichen Vektoren Verwendung von bi-cistronischen Vektoren für stabile Expression

3 Der Weg vom Gen zum Klon Zellen Isolation der gesamt RNA cdna Synthese Transfektion in Zellen Zelle mit Vektor Zelle ohne Vektor Amplifikation der gewünschten cdna Vektor Selektion mit Puromycin Klonierung der Sequenz in gewünschten Vektor Besonderheit des pmc16 Vektors Das Puromycinresistenzgen (pac) befindet sich unter der Kontrolle des selben Promotors (CMVp, blau) wie das GFP- Fusionsgen (EGFP-53BP1, grün) und wird als ein Transkript exprimiert bi-cistronisch Interne Ribosomen-Bindestelle (IRES, grau) ermöglicht Translation des pac-gens Isolation der Einzelzell-Klone und Expansion Klon # 1 Klon # 2 Klon # 3 mit stabiler Expression des GFPmarkierten Proteins, die weiter charakterisiert werden können Stillegung des Promotors führt zum Tod der Zelle

4 Stabile Überexpression des GFP-markierten Proteins durch bi-cistronische Vektoren A) Western Blot nach 53BP1 und SMC1 Detektion B) Relatives 53BP1 Expressionslevel nach 150 Zellgenerationen Auftrag 7 µg Proteinmenge je Spur als Triplikat. Spur untransfizierte HeLa (Kontrolle) Spur HeLa pmc16-gfp-53bp1-#2 Spur HeLa pmc16-gfp-53bp1-ukc. Die Banden des endogenen 53BP1(214 kda, detektiert bei mehr als 250 kda) finden sich dabei auf gleicher Höhe wie die des ektopisch exprimierten 53BP1-GFP (erwartet 240,9 kda). Das Protein SMC1 befindet bei 150 kda. Beginn der Analyse im Juni 2009, Ende der Analyse nach ca. 150 Zellpopulationen im Nov Das Expressionslevel von 53BP1wurde gegen das Haushaltsprotein SMC1 normiert. Der Klon #2 exprimiert im Vergleich zum endogenen 53BP1 stabil über lange Zeit ca. 40 % mehr (GFP-markiertes) 53BP1, der Klon UKC ca 140 % mehr. Durch bi-cistronische Vektoren wird das GFP-markierte Protein über einen langen Zeitraum konstant exprimiert

5 Die stabile Überexpression ermöglicht weitere Analysen A) Vergleich der Wachstumsgeschwindigkeit B) Koloniebildung nach Röntgenbestrahlung Grafische Darstellung der Generationzeiten von untransfizierten HeLa-Zellen (Kontrolle), HeLa Zellen transfiziert mit dem leeren pmc16-vektor (pmc16-gfp, Pool), 1 Zelllinie mit Rad52-GFP Überexpression (pmc16-rad52, Pool CS#3), 1 Klon mit Rad52 Überexpression, welches durch zusätzliche Aminosäuren keine Foci nach Bestrahlung bildet (pmc16-rad52, C5) und 2 53BP1 überexprimierenden Klonen (pmc16-53bp1 #2 und UKC) Rad52-GFP (Foci bildend und keine Foci bildend) und 53BP1-GFP Überexpression hat in HeLa-Zellen keinen Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit Kolonie Überlebenstest nach Röntgenbestrahlung von untransfizierten HeLa-Zellen (Kontrolle), HeLa Zellen transfiziert mit dem leeren pmc16-vektor (pmc16-gfp, Pool), 1 Zelllinie mit Rad52-GFP Überexpression (pmc16- Rad52, Pool CS#3), 1 Klon mit Rad52 Überexpression, welches durch zusätzliche Aminosäuren keine Foci nach Bestrahlung bildet (pmc16-rad52, C5) Rad52-GFP Überexpression hat keinen Einfluss auf das Überleben der Zellen nach ionisierender Strahlung, auch wenn das Protein nicht am DSB akkumulieren kann

6 Zusammenfassung Bei den bisher üblichen Vektoren kann es zur Stilllegung des Promotors kommen, der das klonierte Gen kontrolliert (sog. silencing). Dieser silencing-prozess konnte für häufig verwendeten CMV Promotor mechanistisch aufgeklärt werden (Meilinger et al., EMBO Rep Nov;10(11): ). Bi-cistronische Vektoren ermöglichen durch die Koppelung des klonierten Gens an das Resistengen auf einem Transkript eine langfristige stabile Expression von GFPmarkierten Proteinen. Dies ist unter anderem notwendig für: Etablierung von Einzelzellklonen, welche weitergehend molekularund zellbiologisch charakterisiert werden können (Überexpressionslevel, Generationszeiten, Überleben nach Exposition mit toxischen Agentien) Wiederholung von Experimenten mit identischen Zellen Zeitlich schwer planbare Experimente, wie z.b. an einem Ionen- Mikrostrahl Bei stabiler Transfektion sind bi-cistronische Vektorsysteme den herkömmlichen Vektoren überlegen