Charakterisierung der mirna-expression im großzellig anaplastischen T-Zell-Lymphom
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- Gottlob Koenig
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1 Charakterisierung der mirna-expression im großzellig anaplastischen T-Zell-Lymphom Dissertation der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Julia Perdika Steinhilber aus Ulm Tübingen
2 Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG 1 2 EINLEITUNG Großzellig anaplastisches T-Zell-Lymphom (ALCL) Definition, Epidemiologie und Geschichte Phänotyp Prognose und Behandlung ALK (anaplastlc lymphoma klnase) Charakteristika und Expression der ALK-Rezeptor-Tyrosinkinase ALK-Fusionen und NPM-ALK JAK/STAT-Signalweg C/EBPß (CCAAT/enhancer-bindlng protein ß) C/EBPß-Struktur Regulation der C/EBPß-Expression Funktionen des C/EBPß-Proteins MiRNAs Charakterisierung und Funktionen Nomenklatur Genomische Organisation Biogenese MiRNA-mRNA-Interaktion Möglichkeiten zur Regulation der mirna-expression Vorhersage und Identifikation regulierter Gene MiRNAs im ALCL Lentiviraler Gentransfer Next-Generation-Sequencing Einführung Vorbereitung der Templates Sequenzierung und Auswertung Mögliche Anwendungsgebiete Zielsetzung der Arbeit 35
3 3 MATERIAL UND METHODEN Materialien Zellen Patientenmaterial Plasmide und Bakterien Medien und Zusätze Geräte Puffer und Lösungen Kits Primer Antikörper Enzyme Reagenzien Chemikalien Verbrauchsmaterialien Hersteller EDV-Programme Lentiviraler Gentransfer zur C/EBPß-Herunterregulation in ALK+ ALCL-Zelllinien Kultivierung der Zellen Zellzählung Durchflusszytometrische Analysen Plasmidisolation für die Virusproduktion Virusproduktion Bestimmung des Virustiters Infektion Überprüfung der C/EBPß-Herunterregulation auf RNA- und Protein- Ebene Zellemte für RNA-Extraktion mrna-extraktion cdna-synthese RT-qPCR Protein-Extraktion Bestimmung der Proteinkonzentration Western Blot Identifizierung der durch C/EBPß oder ALK regulierten mirnas mit Next-Generation-Sequencing Isolierung CD3+ T-Zellen aus humanem Blut 58
4 3.4.2 Next-Generation-Sequencing Validierung der differenziell exprimierten mirnas In Zelllinien und im Patientenmaterial MiRNA-Extraktion aus Zellen RNA- und mirna-extraktion aus Patientenmaterial MiRNA-cDNA-Synthese RT-qPCR zur Quantifizierung der mirnas Überexpression der C/EBPß-lsoformen LAP* und LAP mittels lentiviralen Gentransfers und Analyse der mirna-expression In-Fusion-Klonierung Überprüfung der In-Fusion-Klonierung mittels Restriktionsverdau Überprüfung der In-Fusion-Klonierung mittels Sanger-Sequenzierung Virusproduktion und Bestimmung des Virustiters Infektion der SR-786-Zellen und Bestimmung der Infektionsrate Überprüfung der Überexpression der C/EBPß-lsoformen auf Proteinebene Überprüfung der C/EBPß-abhängigen mirna-expression in den die C/EBPß-lsoformen überexprimierenden SR-786-Zellen Gen-Ontologie- und Signalweg-Analysen der durch C/EBPß regulierten mirnas Etablierung, Durchführung und Überprüfung der Überexpression von mirna-mimics Etablierung MiRNA-Mimic-Überexpression Überprüfung der mirna-mimic-überexpression Identifizierung der mirna-regulierten potenziellen Zielgene Identifizierung der mirnas 181a*, 146b-5p oder 203 -regulierten Zielgene mittels Software-basierter Vorhersage Überprüfung der potenziell durch mirnas 146b-5p, 203 oder 181a* regulierten Gene mittels RT-qPCR Analyse des SUDHL-1-Zell-Transkriptoms mit und ohne Überexpression der mirnas 29c oder 146a Überprüfung der mirna 29c oder 146a -abhängigen Expression der Kandidatengene mittels RT-qPCR 74
5 4 ERGEBNISSE Lentiviraler Gentransfer zur Herunterregulation von C/EBPß in ALK+ ALCL-Zelllinien Bestimmung des Virustiters Bestimmung der C/EBPß-mRNA-Level in verschiedenen Zelllinien Bestimmung der Infektionsraten C/EBPß-Herunterregulation auf RNA- und Protein-Ebene RT-qPCR zur Bestimmung der relativen C/EBPß-mRNA-Level Western Blot zur Bestimmung der C/EBPß-Expression auf Proteinebene Untersuchung der mirna-expression mittels Next-Generation- Sequencing Isolierung CD3+ T-Zellen aus humanem Blut Next-Generation-Sequencing Hauptkomponentenanalyse der mirna-next-generation-sequencing- Daten Durch C/EBPß regulierte mirnas Identifizierung durch C/EBPß signifikant regulierter mirnas Validiemng der drei durch C/EBPß regulierten mirnas 146b-5p, 181a* und 203 mittels RT-qPCR Validierung der drei durch C/EBPß regulierten mirnas mittels Überexpression der C/EBPß-lsoformen und RT-qPCR-Analyse Gen-Ontologie- und Signalweg-Analysen der durch C/EBPß regulierten mirnas Charakteristisch im ALK+ ALCL exprimierte mirnas Unterschiedlich exprimierte mirnas im ALK+ ALCL, ALK- ALCL und in normalen T-Zellen MiRNA-Überexpression Etablierung der mirna-mimic-überexpression Überprüfung der mirna-mimic-überexpression Identifizierung von mirna-zielgenen Identifizierung der durch die mirnas 181a*, 146b-5p oder 203 regulierten Zielgene mittels Software-basierter Vorhersage Analyse des SUDHL-1-Zell-Transkriptoms mit und ohne Überexpression der mirnas 29c oder 146a Überprüfung der Transkriptom-Analysen Potenzielle Zielgen-Bindungsstellen der mirnas 114
6 5 DISKUSSION Next-Generation-Sequencing MiRNA-Sequenzierung Transkriptom-Analyse Identifizierung der durch C/EBPß regulierten mirnas Identifizierung der ALK-assoziierten mirnas Identifizierung von Zielgenen der mirnas Schlussfolgerungen und Ausblick VERZEICHNISSE Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis PUBLIKATIONEN UND KONGRESSE Publikationen Kongresse DANKSAGUNG 162
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