Zusammenfassung. 1 Einleitung. 2 Material & Methoden. 1.1 Hepatitis B Virus (HBV) 1.2 Adeno-Assoziierte Viren (AAV) 1.3 Das humane Immunsystem

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Edwina Geier
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Zusammenfassung 1 Einleitung 1.1 Hepatitis B Virus (HBV) 1.1.1 Epidemiologie des humanen HBV 1.1.2 Partikelaufbau des HBV 1.1.3 Hüllproteine 1.1.4 Genomorganisation 1.1.5 Replikationszyklus 1.

1 Zusammenfassung 1 Einleitung 1.1 Hepatitis B Virus (HBV) Epidemiologie des humanen HBV Partikelaufbau des HBV Hüllproteine Genomorganisation Replikationszyklus 1.2 Adeno-Assoziierte Viren (AAV) Partikelaufbau und Replikationszyklus Gentherapie 1.3 Das humane Immunsystem Das angeborene Immunsystem Das adaptive Immunsystem 1.4 Rezeptoren des angeborenen Immunsystems Toll-ähnliche Rezeptoren (TLR) C-Typ Lektin Rezeptoren (CLR) RIG-I-ähnliche Helikasen (RLR) NOD-ähnliche Rezeptoren (NLR) 1.5 Leberanatomie und Zellpopulationen 1.6 Zielsetzung der Arbeit 2 Material & Methoden 2.1 Verbrauchsmaterialien und Chemikalien Kits Chemikalien & Reagenzien

2 2.1.3 Medien und Medienzusätze Eukaryotische Zelllinien Enzyme Gewichts- und Längenstandards Oligonukleotide Radioisotope Antikörper Verbrauchsmaterial Geräte Software Statistik Verwendete Lösungen und Puffer Zellkulturmedien Zellbiologische Methoden Etablierung von infektiösen HBV Stocks und Negativ-Kontrollen Aussäen und Kultivieren von HepG2.215 und HepG2 Zellen Konzentration von HBV aus dem Zellkulturmedium Etablierung von raav Stocks, leeren AAV Kapsiden und Negativ-Kontrolle Isolation und Kultivierung primärer humaner Zellen Bestimmung der Zellzahl und Vitalität Leberzell-Mischkulturen Hochreine humane Leberzellkulturen Primäre humane Leukozyten aus Blut Differenzierung von pro-inflammatorischen MO aus Monozyten THP-1 Zellen Kultivierung von HEK-293 und HEK-293/TLR2 Zellen Isolation muriner MO Infektionsversuche und Aktivitätstests HBV-Infektion von PHH und NPC 52 II

3 Inkubation von Zellen mit HBV Infektion mit AAV Partikeln Inkubation von Zellen mit Liganden für Mustererkennungsrezeptoren Lagerung der abgenommenen Zellkulturmedien Immunfarbung Aufnahme von acetyliertem Low-Density-Lipoprotein Molekularbiologische Methoden RNA-Isolation aus Zellen RNA-Isolation mittels Trizol Reagenz RNA-Isolation mittels Peqlab Reagenz Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA DNA Verdau in RNA Proben cdna Synthese Quantitative Light Cycler Echtzeit-PCR (qpcr) DNA-Isolation aus HBV Partikeln Agarosegelelektrophorese DNA Dot-Blot Analyse (HBV DNA) Überprüfung der Zellkulturen auf Mykoplasmen mittels PCR Biochemische Methoden Enzyme Linked Immunosorbent Assay Messung der HBV-Antigensekretion Aufreinigung von HBV Partikeln Anreicherung viraler Partikel durch Heparin-Affinitäts-Chromatographie Aufreinigung von HBV Partikeln mittels Saccharose Dichtegradienten Titerbestimmung und Charakterisierung der HBV-Stocks 66 3 Ergebnisse Isolation primärer humaner Leberzellen Isolation und Identifizierung Charakterisierung der TLR in den Zellpopulationen 69 III

4 3.2 Erkennung von Viren in Leberzellen Erkennung von HBV Erkennung von AAV Beteiligung von TLR und CLR an der Erkennung viraler Partikel HBV Virionen und Kapside werden von humanen MO erkannt Erkennung viraler Partikel durch TLR Die Erkennung von HBV beansprucht die TLR Signalkaskade HBV induziert TLR 2 Expression HBV-spezifische IL-8 Induktion in HEK293-TLR Die Erkennung von HBV durch KC, LSEC und MO ist TLR 2-abhängig Die Erkennung von AAV ist TLR 2-abhängig TLR 9 ist nicht an der Erkennung von HBV beteiligt Erkennung von HBV durch CLR Die Erkennung von HBV erfordert eine Clathrin-abhängige Phagozytose Die HBV-Erkennung ist Calcium-abhängig Untersuchung der ITAM-Motiv-Rezeptor Signalkaskade HBV Erkennung erfordert endosomale Reifung Der Mannose Rezeptor und die Erkennung von HBV 96 4 Diskussion Isolation primärer humaner Leberzellen Erkennung viraler Partikel durch TLR Erkennung von HBV Partikeln Erkennung von AAV Kapsiden Erkennung viraler Partikel durch CLR Zusammenfassung Abkürzungen und Abbildungen Abkürzungen 115 IV

5 5.2 Abbildlingsverzeichnis 5.3 Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis Danksagung v

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