Bioanalytik-Vorlesung Western-Blot. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

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1 Bioanalytik-Vorlesung Western-Blot Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

2 Western-Blot Western-Blot: Übertragung von elektrophoretisch aufgetrennten Proteinen auf eine Membran und Nachweis der übertragenen Protein mit Hilfe von Antikörper. Wofür: Überprüfung des Tags, der für die Aufreinigung an ein Protein fusioniert wurde (Zum Beispiel His-Tag Nachweis mit His-Tag spez. Antikörpern) Sequenzierung des Proteins direkt von der Membran Expressionsstudien, semiquantitative Analyse Diagnostik in der Medizin: - Nachweis von Antikörpern im Serum die für bestimmte Infektionen typisch sind. - Identifizierung von entarteten Zellen, die verstärkt bestimmte Proteine binden. - Untersuchung zur Wirkung von Medikamenten auf vermehrte Expression von Proteinen Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 2

3 Western-Blot: Workflow Übertragung von Proteinen auf eine Membran Auftrennung der Proteine im SDS-Gel Blocken unspezifischer Bindungsstellen Erneutes Färben mit Coomassie zur Kontrolle des Protein-Transfers Kontrolle des Proteintransfers durch Färben Entweder mit Ponceaurot (bei Proteinkonzentrationen > 50 ng/bande). Marker wird mit Bleistift markiert! Andere Färbemethode die sich mit anschließender Immunfärbung verträgt: mit Fluoreszenzfarbstoff Übertragung der Proteine auf eine Membran SYPRO Ruby (Nitrocellulose oder bevorzugt PVDF =Polyvinylidenfluorid, + Nylon) Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 3 Immundetektion

4 Western-Blotting: Blotting Apparaturen Semidry-Blotting Tankblotting Semi-Dry-Blotting hat sich gegenüber Tankblotting durchgesetzt: Einfachere Handhabung Effizienterer Proteintransfer bei kürzerer Transferzeit Proteinfärbung und Immunnachweise empfindlicher Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 4

5 Immundetektion der Proteine Für die Detektion der Membran-gebundenen Proteine werden Antikörper eingesetzt. (i.d.r monoklonale Antikörper). Die eingesetzten Antikörper binden auch an unspezifischen Stellen an der Membran. Daher muss ein optimales Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis eingestellt werden, indem: Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran abgedeckt (geblockt) werden (z.b. durch Milchpulver, Rinderserumalbumin (BSA), Gelatine, Eiklar.) Die richtige Antikörper-Verdünnung gewählt wird mit dem Ziel, bei maximaler spezifischer Reaktion unspezifischen Bindungen zu unterdrücken. Ein Nachweissystem mit ausreichender Empfindlichkeit ausgewählt wird. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 5

6 Monoklonale/Polyklonale Antikörper Monoklonale AK= polyklonale Antikörper Nachkommen vieler B- Lymphozyten, Mischung mehrerer Antikörper, die sich gegen unterschiedliche Oberflächenstrukturen eines Antiges richten monoklonale Antikörper Stammen von einer B- Lymphocyten-Zelllinie Richtet sich gegen ein Epitop Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 6

7 Struktur des Antikörpers Immunglobulin G (IgG) Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 7

8 Immundetektion der Proteine 1. Inkubation mit anti-antigen-antikörper 2. Abwaschen ungebundener Antikörper 3. Inkubation mit zweitem Antikörper, der an den ersten bindet. Dieser ist mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiert. 4. Peroxidase katalysiert die Oxidation von Luminol was als Chemilumineszenz sichtbar wird. Diese Peroxidase-Reaktion ist 10 mal sensitiver als der Nachweis über alkalische Phosphatase. Antikörper können wieder entfernt werden (Strippen). Färben des Blot mit verschiedenen Antikörpern möglich Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 8

9 Nachweis von Glykoproteinen auf Blots Glykoproteine können mit Lektinen nachgewiesen werden. Lektine sind Proteine, die spezifisch Kohlenhydratstrukturen binden. Markierte Lektine (z.b. Peroxidase-markiert) können auf Blots weniger als 10 ng Glykoprotein/Bande nachweisen. Es darf nicht mit einfachen BSA-Präparaten oder Milchpulver geblockt werden, die selber Glykoproteine enthalten. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 9